第34卷第3期
CHINESE
中华中
OF
医药学刊
MEDICINE
Vol．34No．3Mar．2016
2016年3月AＲCHIVESTＲADITIONALCHINESE
DOI ：10．13193/j．issn．1673-7717．2016．03．032
硫熏和鲜切浙贝母的化学成分及其药理作用的比较研究
11，2321，2
卓诗勤，张浩，丁弋娜，杜伟锋，葛卫红
（1．浙江中医药大学药学院，浙江杭州310053；2．浙江中医药大学中药炮制技术研究中心，浙江杭州310053；
3．杭州师范大学基础医学院，浙江杭州310036）摘要：目的：比较研究硫熏对浙贝母中总生物碱、总皂苷的影响，及硫熏、鲜切浙贝母水煎液镇咳、祛痰及其
抗炎作用，初步阐明硫熏对浙贝母药理作用的影响。方法：采用UV 显色法、重量法考察硫熏对浙贝母中总生物碱、总皂苷含量的影响。采用小鼠氨水引咳法、小鼠酚红排泌法、二甲苯致小鼠耳肿胀法及急性毒性实验考察硫熏对浙贝母镇咳作用、祛痰作用、抗炎作用的影响。结果：测得硫熏、鲜切浙贝母中总生物碱的平均含量分别为0．0629%、0．0727%；其总皂苷的平均含量分别为0．8567%、2．3157%；药理学实验结果表明，与阴性对照组相比，
1．5、33g /kg剂量下均具有明显的镇咳、P ＜0．01），在0．75、硫熏浙贝母水煎液在1．5g /kg，祛痰作用（P ＜0．05，
g /kg剂量下具有明显的抗炎作用（P ＜0．01）；鲜切浙贝母水煎液在0．75、1．5、3g /kg剂量组下均具有明显的镇
P ＜0．01）。而硫熏浙贝母水煎液组与鲜切浙贝母水煎液组相比，1．5、3咳、祛痰及其抗炎作用（P ＜0．05，在0．75、
g /kg剂量下其镇咳、祛痰及其抗炎作用未有明显的差异性（P ＞0．05）。结论：硫熏在一定程度上降低了浙贝母中总生物碱、总皂苷的含量；硫熏对浙贝母镇咳、祛痰、抗炎的药理作用有一定的影响，但影响并不明显，其原因有待进一步研究。
关键词：硫熏；浙贝母；镇咳；祛痰；抗炎
0618-047717（2016）03-中图分类号：Ｒ284．1文献标志码：A 文章编号：1673-
Comparative Study of Chemical Ingredients and Pharmacological Effects on
Sulphur Fumigated or Fresh Cut of Fritillaria Thunbergii
22
ZHUO Shiqin 1，ZHANG Hao 1，，DING Yina 3，DU Weifeng 2，GE Weihong 1，
（1．School of Pharmacy ，Zhejiang Chinese Medical University ，Hangzhou 310053，Zhejiang ，China ；
2．TCM Processed Technology ＲesearchCenter ，Zhejiang Chinese Medical University ，Hangzhou 310053，Zhejiang ，China ；
3．Basic Medical College of Hangzhou Normal Univeristy ，Hangzhou 310036，Zhejiang ，China ）
中
华中医药618学刊
Abstract ：Objective ：To study and compare the influence of Sulfur fumigation on total alkaloid and total saponin from Fritillaria thunbergii and the antitussive ，phlegm －resolving and anti －inflammatory action to preliminary clarify its effect on pharmacological effects．Methods ：By using UV chromogenic method and gravimetric method ，we investigated the con-centrations of total alkaloid and total saponins．Ammonia in mice led to coughing ，phenol red in mice shedding ，mice ear swelling induced by xylene ，all these were used to investigate sulfur fumigation on the antitussive ，phlegm －resolving and anti －inflammatory effect．Ｒesults：The average contents of total alkaloid in Fritillariae thunbergii by sulfur fumigation and fresh －cut were respectively 0．0629%，0．0727%and the contents of total saponin were respectively 0．8567%，2. 3157%．The pharmacology experiment results showed that compared with negative control group ，water decoction of Fritillaria thunbergii by sulfur fumigation in 1．5g /kg，3g /kghad obvious antitussive and phlegm －resolving effect （P ＜
1．5，3g /kgdoses had obvious anti －inflammatory effects （P ＜0．01）．Water decoction of Fritil-0．05，P ＜0．01）；0．75，
laria thunbergii by fresh －cut in 0．75，1．5，3g /kggroups had obvious antitussive ，phlegm －resolving and anti －inflam-matory effects （P ＜0．05，P ＜0．01）．Water decoction group of Fritillaria thunbergii by sulfur fumigation compared with water decoction group of Fritillaria thunbergii by fresh －cut in 0．75，1．5，3g /kg，the antitussive ，phlegm －resolving and anti －inflammatory effects had no obvious difference （P ＞0．05）．Conclusion ：Sulfur fumigated for Fritillaria thunbergii reduced the contents of total alkaloid and total saponins．Sulfur fumigated Fritillaria thunbergii had no obvious effect on antitussive ，phlegm －resolving and anti －inflammatory pharmacological actions．
Key words ：sulfur fumigation ；Thunberg Fritillary Bulb ；antitussive ；phlegm －resolving ；anti －inflammatory 浙贝母为百合科植物浙贝母（Fritillaria thunbergii
Miq．）的干燥鳞茎［1］，主要功效为清热散结、化痰止咳，是
收稿日期：2015－10－21
基金项目：国家中医药行业专项项目（201507002）；浙江省公益性技术应用研究计划项目（2015C33152）；浙江省中医药科学研究基金计划
2013ZA027）；浙江省教育厅科研计划项目（Y201224449）项目（2012ZB032，
作者简介：卓诗勤（1990－），硕士研究生，研究方向：中药药理与新产品开发研究。女，福建三明人，
mail ：duweifeng_200158@sohu．com 。通讯作者：杜伟锋（1984－），助理研究员，研究方向：中药炮制及饮片质量控制。E-男，河北任县人，
著名的“浙八味”之一，其药用历史悠久，产量宏大。课题2．1．3最大吸收波长的测定精密量取3mL 置于锥形瓶
组对浙贝母产地加工方式的调查发现，目前浙贝母的产地中，加氯仿7mL ，蒸馏水5mL ，
pH 4．5的0．04%溴甲酚绿加工方式主要有硫熏法、鲜切法，虽然浙江省药监部门已推－邻苯二甲酸氢钾溶液2mL ，密闭，剧烈振摇3min 置分液行对浙贝母的产地加工采用鲜切法，然而硫熏法一直盛行，漏斗中静置30 60min ，取氯仿层5mL ，置预先加入氢氧因其有对药材外观增色以及防护作用的优势，使得众多不化钾－无水乙醇溶液1mL 的试管中，摇匀。
良商贩普遍采用此法加工。近年研究发现硫熏使药材中某在200 800nm 之间对供试品溶液和对照品溶液（贝些化学成分发生变化，还使药材中重金属残留量升高，并且
母素甲）最大吸收波长进行扫描，在此条件下其最大吸收影响了药效
［2－3］
，其有效性和安全性的问题也受到了极大波长为622nm ，见图1。因此，在紫外分光光度计上于622的关注。硫熏法造成了浙贝母内部有效成分含量的改变，nm 处测定吸光度（A ）
。
且化学成分组成也发生了改变，对镇咳、祛痰、抗炎的药理作用也有一定的影响，为了更全面阐明地硫熏对浙贝母化学组成成分、药理作用的影响，本论文通过对硫熏、鲜切浙贝母中总生物碱、总皂苷的变化来阐明硫熏对浙贝母化学成分的影响；并通过对硫熏、鲜切浙贝母镇咳、祛痰及抗炎的药理作用研究阐明硫熏对浙贝母药理作用的影响，为了科学地选择浙贝母的产地加工方式提供实验依据，以确保浙贝母药材及饮片的质量。1材料和方法1．1药物
硫熏、鲜切浙贝母来源于宁波鄞州产区，经浙江中医药大学中药资源与鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定为正品。
硫熏、鲜切浙贝母水煎液的制备：实验前加9倍体积的
水煎煮提取2次，2h /次，合并提取液，浓缩至含生药浓度
为0．15g /mL。1．2试剂
对照品：贝母素甲对照品（110750－201110，中国药品图1供试品的最大吸收波长
生物制品鉴定所）。
2．1．4标准曲线的制备各系类浓度的吸光度如表1，以氨水（南京化学试剂）；强力批把露（哈尔滨市康隆药吸光度（y ）对浓度（x ）进行线性回归，得回归方程：y =业）；盐酸氨溴索注射液（勃林格殷格翰）；苯酚红（上海化0. 0144x －0．1416，r =0．9996。实验结果表明，贝母素甲工）；地塞米松磷酸钠注射液（济南利民制药有限公司）；二在10．2 61．2μg /mL内与吸光度具有良好的线性关系。
甲苯（天津化学试剂厂）。表1贝母素甲各系列浓度的吸光度
1．3试验动物
浓度（μg /mL）10．2
20．4
30．6
40．8
51．0
61．2
ICＲ小鼠，雌雄对半，体重18 22g ，健康状况良好，由浙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号吸光度（A ）
0．00770．15700．29140．43500．60010．7401
201402066。均由浙江中医药大学实验动物中心提供。动2．1．5精密度实验精密吸取供试品溶液3mL ，5份，按
物实验室环境温度20 25ħ ，湿度50% 70%，光照150“1．3项”下方法测定吸光度，结果ＲSD为1．45%，表明该 200Lx ，12h 明暗交替，噪音＜50dB 。方法精密度良好。
1．4仪器
2．1．6稳定性实验精密吸取供试品溶液3mL ，按照“1．Mettler AL －204型电子分析天平（上海）；紫外－可见3项”下方法，分别在显色后0、10、20、30、60、90min 测定吸分光光度计（UV －2450，岛津）；9mm 打孔器（华东医疗器光度，结果ＲSD为1．61%，表明供试品在显色后90min 内械有限公司）；超声雾化器（上海医药股份有限公司）；旋转
基本稳定。
蒸发仪（上海鲁伊有限公司），
HH －4型恒温水浴箱（天津2．1．7重复性实验取同一批样品5份，按“1．2项”下方市泰斯特仪器有限公司）；ZD －2自动电位滴定仪（雷磁）；法制备供试品溶液，按1．3项”下方法测定吸光度，结果KQ －500DB 型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）等。ＲSD为1．19%。
2方法与结果表2加样回收率
2．1硫熏、鲜切浙贝母中总生物碱的含量测定样品含量加入量测得量回收率平均值ＲSD2．1．1对照品制备精密称取贝母素甲对照品，加甲醇溶（mg ）（mg ）（mg ）（%）（%）
（%）
解制成不同浓度的标准品溶液，加氯仿使成10mL ，蒸馏水1．4071．4152．75197．4845mL ，以下同供试品溶液制备方法制备。
1．4101．4152．78198．4422．1．2供试品制备取各样品粉末（过4号药筛）约2g ，1．4181．4152．82199．576精密称定，置烧瓶中，加浓氨试液4mL 浸润，精密加入三氯1．4081．4152．883102．12599．480
1．823
甲烷－甲醇（4ʒ 1）的混合溶液40mL ，称定重量，混匀，置1．4051．4152．851101．09980ħ 水浴中加热回流2h ，补足减失重量，滤过。精密量取1．403
1．415
2．766
98．155
续滤液10mL ，挥干，残渣加甲醇使溶解并转移至10mL 量2．1．8加样回收实验精密称定已知含量的样品6份，分
瓶中，加甲醇至刻度。
别加入贝母素甲对照品适量，按“1．2项”下方法制备供试品
中华中医药619学刊
溶液，按1．3项”下方法测定吸光度，计算回收率，见表2。2．1．9结果将不同产地及批次的硫熏、鲜切浙贝母按上述方法制备成供试品溶液，测定总生物碱的含量，见表3。
表3不同产地及批次硫熏、鲜切浙贝母
总生物碱的含量测定结果（n =2）
组别
产地宁波木里交1宁波木里交2宁波外龙观1宁波外龙观2宁波中章水1宁波中水章2金华新渥村宁波木里交1宁波木里交2宁波外龙观1宁波外龙观2宁波中章水1宁波中章水2金华新渥村
总生物碱含量%
0．0650．0640．0550．0560．0650．0660．0660．0700．0720．0600．0610．0800．0710．071
[1**********]376
平均值ʃ SD%
煎液较硫熏浙贝母水煎剂延长了小鼠氨水引咳的潜伏期。结果见表5。
表5硫熏、鲜切浙贝母水煎液对小鼠
珋x ʃ s ）氨水引咳的潜伏期影响（n =10，
组别阴性对照组组强力枇杷露组
硫熏浙贝母水煎液低剂量组硫熏浙贝母水煎液中剂量组硫熏浙贝母水煎液高剂量组鲜切浙贝母水煎液低剂量组鲜切浙贝母水煎液中剂量组鲜切浙贝母水煎液高剂量组
给药剂量0．2mL 25mL /kg0．75g /kg1．5g /kg3g /kg0．75g /kg1．5g /kg3g /kg
潜伏期（S ）56．9ʃ 12．0114．2ʃ 16．0▲▲
62．0ʃ 12．688．6ʃ 19．5▲▲99．5ʃ 21．2▲▲75．5ʃ 11．7▲91．2ʃ 17．3▲▲111．8ʃ 20．6▲▲
硫熏0．0629ʃ 0．0048
注：与阴性对照组比较，▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01；与鲜切浙贝
*P ＜0．05，母水煎液组比较，＊＊P ＜0．01。
0．0727ʃ 0．0034
鲜切
2．2硫熏、鲜切浙贝母中总皂苷的含量测定
2．2．1方法取浙贝母药材粉末（过四号药筛）约5g ，精密称定，置索氏提取器中加入甲醇100mL ，回流提取至不呈里伯曼正反应，提取减压后浓缩至30mL ，冷却后加入乙
4ħ 冰箱放置12h 倾出上清液，醚100mL ，混匀，沉淀用10
mL 乙醚洗涤再用30mL 甲醇加热溶解，然后用垂熔漏斗过滤，抽干干燥至恒重，减去漏斗重量，即为总皂苷重量。2．2．2结果将不同产地及批次的硫熏、鲜切浙贝母按上述方法，测定总皂苷的含量，结果见表4。
表4不同产地及批次硫熏、鲜切浙贝母
总皂苷的含量测定结果（n =2）
组别
产地及批次宁波木里交1宁波木里交2宁波外龙观1宁波外龙观2宁波中章水1宁波中水章2金华新渥村宁波木里交1宁波木里交2宁波外龙观1宁波外龙观2宁波中章水1宁波中章水2金华新渥村
总皂苷含量%0．8780．8530．8550．8070．8690．8780．8562．2802．2222．2682．3852．3232．3692．362
[1**********]230
平均值ʃ SD%
2．3．2祛痰作用小鼠酚红排泌量实验：参考文献法，略加改进。酚红标准曲线的制备，精密称取苯酚红10mg ，用1
－1
mol ·L 氢氧化钠溶液和0．9%氯化钠溶液按照1ʒ 15的比例配制成的A 溶液溶解，定容至250mL ，作为贮备液。分别
0．1、0．2、0．3、0．4、0．6、0．8、1．0mL 的酚红贮精密量取0．05、
备液于10mL 的量瓶中，用上述A 溶液定容，备用。在200 800nm 之间对酚红溶液最大吸收波长进行扫描，在此条件下其最大吸收波长为558nm ，见图2。以上述A 溶液为空白，在紫外分光光度计上于558nm 处测定吸光度（A ）。各系类浓度的吸光度如表6，其对应的标准曲线，见图3
。
硫熏0．8567ʃ 0．0241
鲜切2．3157ʃ 0．0608
图2
酚红溶液的最大吸收波长
表6
浓度（C ）吸光度（A ）
0．20．069
酚红各系列浓度的吸光度（mg /L）
0．40．108
0．80．212
1．20．320
1．60．407
2．40．597
3．20．794
4．00．976
中
华中医药620学刊
2．3硫熏对浙贝母镇咳、祛痰及抗炎的药理作用
2．3．1镇咳作用小鼠氨水引咳实验：参考文献法，略加改进。按随机区组法将动物随机分成8组，每组10只。给
1．5、3．0g /kg剂量灌胃、药组按0．75、阳性对照组按25
mL /kg剂量灌胃，阴性对照组按等容量灌胃给予蒸馏水，各组均灌胃7d 。各组于第7天给药1h 后，用超声雾化器喷入12．5%的氨水，观察氨水刺激小鼠后引起咳嗽的潜伏期，记录数据。数据采用单因素方差分析，组间差异用LSD 法进行比较。结果显示：与阴性对照组相比，硫熏、鲜切浙贝母水煎液各剂量组延长了小鼠氨水引咳的潜伏期（P ＜0．05，P ＜0．01），且随剂量增加潜伏期延长；鲜切浙贝母水
r =0．999酚红标准曲线方程y =0．2402x +0．0210，
8。在0．2 4．0mg /L浓度范围内线性关系良好。
气管段酚红排痰实验：参考文献方法，略加改进。按随机区组法将动物随机分成8组，每组10只。给药组按0. 75、1．5、3g /kg剂量灌胃，阴性对照组ig 等容量的蒸馏水，各组均ig7天，阳性对照组只在第7d 按30mg /kg剂量ip 盐酸氨溴索。在第7d 给药后1h 后，小鼠ip2．5%的酚
30min 后处死小鼠，红0．5mL ，分离气管，自甲状软骨下缘
处和气管分岔处剪取气管，置于A 溶液中浸泡过夜。次
图3酚红标准曲线
558nm 处测其吸光值（A ），日，代入标准曲线方程中计算
组间差异用酚红的浓度。各组数据用单因素方差分析，
LSD 法进行比较。结果显示：与空白组相比，硫熏、鲜切浙贝母水煎液各剂量组对小鼠酚红排泌量显著增加（P ＜0. 05，P ＜0．01），且随剂量增加酚红排泌量增加。硫熏浙贝母水煎液较鲜切浙贝母水煎剂降低了小鼠酚红排泌量。结果见表7。
表7硫熏、鲜切浙贝母水煎液和
珋x ʃ s ）超微粉对小鼠酚红排泌量的影响（n =10，
组别阴性对照组盐酸氨溴索组
给药剂量0．2mL 30mg /kg
酚红浓度（mg /L）0．314ʃ 0．1240．890ʃ 0．270▲▲
0．491ʃ 0．1630．660ʃ 0．257▲▲0．712ʃ 0．290▲▲0．526ʃ 0．282▲0．683ʃ 0．193▲▲0．779ʃ 0．225▲▲
硫熏浙贝母水煎液低剂量组0．75g /kg硫熏浙贝母水煎液中剂量组1．5g /kg硫熏浙贝母水煎液高剂量组3g /kg鲜切浙贝母水煎液低剂量组0．75g /kg鲜切浙贝母水煎液中剂量组1．5g /kg鲜切浙贝母水煎液高剂量组3g /kg*P ＜0．05，母水煎液组比较，＊＊P ＜0．01。
▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01；与鲜切浙贝注：与阴性对照组比较，
2．3．3
抗炎作用二甲苯致小鼠耳肿胀实验：按随机区组
法将动物随机分成8组，每组10只。给药组按0．75g /kg，1．5g /kg，3．0g /kgig ，阴性对照组ig 等容量的蒸馏水，各组均ig 7d ，阳性对照组只在第7天按10mg /kg剂量ip 地塞米松。在第7天给药后45min 后，将100%二甲苯0．1mL 均匀涂在小鼠右耳前后两面，左耳作对照。1．5h 后脱颈处死，沿耳廓基线剪下两耳，用9mm 直径打孔器分别在左右耳的同一部位打下圆耳片，电子天平称质量，以两耳片的质量之差作为肿胀值进行统计学检验，并计算肿胀抑制率，肿胀抑制率=（正常组肿胀值－试验组肿胀值）/正常组肿胀
表8硫熏、鲜切浙贝母水煎液对
珋x ʃ s ）二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（n =10，
组别阴性对照组地塞米松组
硫熏浙贝母水煎液低剂量组硫熏浙贝母水煎液中剂量组硫熏浙贝母水煎液高剂量组鲜切浙贝母水煎液低剂量组鲜切浙贝母水煎液中剂量组鲜切浙贝母水煎液高剂量组
给药剂量0．20mL 10mg /kg0．75g /kg1．5g /kg3g /kg0．75g /kg1．5g /kg3g /kg
肿胀度（mg ）13．67ʃ 2．303．74ʃ 1．14
▲▲
值ˑ 100%。结果显示：与阴性对照组相比，硫熏、鲜切浙贝
母水煎液各剂量组对二甲苯致小鼠耳肿胀程度显著减轻（P ＜0．01），且随剂量增加抑制作用增加。鲜切浙贝母水煎液较硫熏浙贝母水煎剂减轻了二甲苯致小鼠耳肿胀程度。结果见表8。3讨论
对不同产地及批次硫熏、鲜切浙贝母中总生物碱、总皂苷的含量分析表明，硫熏、鲜切浙贝母总生物碱含量分别为（0．0629ʃ 0．0048）%、（0．0727ʃ 0．0034）%，两者总生物碱含量具有一定差异。发现硫熏浙贝母中总生物碱含量低于鲜切浙贝母，其原因可能硫熏法降低了其总生物碱含量。其硫熏、鲜切浙贝母总皂苷的含量分别为（0．8567ʃ 0．0241）%、（2．3157ʃ 0．0608）%，结果表明硫熏法可能也造成了浙贝母中总皂苷的含量降低。
药材水煎液pH 值的高低也是药材SO 2残留量高低的体现，硫熏浙贝母水煎液较鲜切浙贝母水煎液pH 值更偏酸性，经硫熏后浙贝母水煎液的pH 值下降，可能由于硫磺熏蒸后药材表面残留了SO 2发生的化学反应：SO 2+H 2O
H 2SO 3的化学性质表明其具有一定的漂白性和幑幐H 2SO 3，
酸性，这可能会对人体胃肠道吸收功能造成一定的影响，从
［4－9］
。而导致浙贝母药效降低
总皂硫熏法在一定程度上降低了浙贝母中总生物碱、
苷成分的含量和水煎液的pH 值，表明硫熏对浙贝母中总生物碱、总皂苷的含量及SO 2的残留量具有一定的影响。
鲜切浙贝母水煎液的药效方面进行了初步评对硫熏、
价研究，硫熏浙贝母镇咳、祛痰和抗炎的药理作用较鲜切浙贝母有所减弱，表明硫熏、鲜切浙贝母镇咳、祛痰和抗炎的药理作用有差异，但差异并不显著（P ＞0．05）。
通过对硫熏及鲜切浙贝母中相关化学成分的分析，对其水煎液进行药理作用方面的研究，接下来进一步我们可能可以从药理作用方面的有效地化学成分入手，研究浙贝母中两种炮制方法对起到药理作用的有效化学成分的影响，为下一步的研究做基础。参考文献
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肿胀抑制
率（%）
－72．6444．2653．3362．9854．0667．5272．35
7．62ʃ 2．64▲▲6．38ʃ 3．08▲▲5．06ʃ 2．36
▲▲
中华中医药621学
刊
6．28ʃ 1．69▲▲4．44ʃ 1．82▲▲3．78ʃ 1．22
▲▲
注：与阴性对照组比较，▲P ＜0．05，▲▲P ＜0．01；与鲜切浙贝*P ＜0．05，母水煎液组比较，＊＊P ＜0．01。