荧光原位杂交技术（FISH）常见问答
对于FISH操作来说，那些因素比较重要？
在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度；各种试剂pH是否符合要求直接关系到FISH的稳定性。
在夏季成功检测的同一探针和样本为什么在冬季就得不到理想的效果？
发生上述现象最大的可能是FISH操作的环境温度发生了变化导致的。在我国，冬季普遍比夏季寒冷，低的环境温度使FISH得不到良好的杂交效率。此外，探针的保存不当也容易引起荧光素的萃灭而导致效果不佳。因此保证FISH操作中的温度非常重要。
该如何保证FISH操作中的温度？
最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作。如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一些仪器进行温控能力的检查，诸如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进行更换（疾病诊断中的探针要求温控精度在1度以内）。其次，要尽可能地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其进行测温。同时检测的样本最好不能超过4块。操作中的行动一定要迅速。操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。特别是在冬季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多（10ul），因此事先没有预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标DNA的杂交效率。因此对上述小部件的预热也能有效地提高FISH的杂交效果。
使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号。但随后信号急剧衰减。几分钟后信号就消失了。这是探针本身的质量问题吗？
在正常情况下，目前的商业化探针即使是杂交后，如果保存适当，荧光信号能保持半年以上。出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。阳光或是强的灯光都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作。也可以在封片观察时加入一定的antifade（抗淬灭剂）以延缓荧光素的淬灭。
如何配制各种试剂呢？
强烈建议使用去离子水配制各种所需的试剂。此外，配制后使用pH计检测是否符合要求。配制的各种试剂都要采用超纯级的要求。每次FISH使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。
直标型探针和间标型探针有何不同？为什么我们要选择直标型探针？
所谓的直标型探针是指DNA探针共价连接着荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接，诸如生物素或地高辛，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针－半抗原－荧光素基团，类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在FISH检测领域，尤其是在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。
我能对同一样本进行多次的FISH操作吗？
在多数情况下，如果FISH操作没有得到正常的结果，我们可以将探针洗去，然后使用同样的探针进行再次的杂交。如果我们使用的是直标型探针，还可以使用不同探针对同一样本进行反复杂交。针对不同的样本，处理方法略有不同。
外周血样本的处理：
1、使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片
2、将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。
对于多次杂交，复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。曾有报道在同一样本片上进行了多达8次的FISH操作。
也可对已经进行G带显色的样本片进行FISH操作：
将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。
H&E 去染色
由于H&E染色使样本片在荧光显微镜下出现类似自发的荧光，因此有必要洗去H&E染色。以下的步骤并不能洗去100％的H&E，但对于大多数的H&E样本片，建议进行以下操作。
1、揭去盖玻片，置于65ºC的预处理液中孵育45分钟。残余的可见染料可在随后的去石蜡操作中被除去
2、进行标准的去石蜡预处理操作
当将0.1% NP-40的洗液加热时出现混浊，是否正常？
加热时洗液出现混浊是正常的，并不会干扰FISH的结果。
复合荧光原位杂交和光谱核型分析进展
徐岚 陈赛娟
用染色体核型分析进行细胞遗传学检查，因其实用性和准确性，很快成为染色体异常的常规筛选检查。但是由于核型分析并不能完全适应复杂核型分析的需要，特别对于一些实体瘤组织，不仅染色体改变复杂，而且难以制备有一定质量的中期染色体分裂相，因此，更难以用传统核型分析得到准确结果。荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)由于其高度敏感性和特异性，已成为另一有力的细胞遗传学研究工具，并与核型分析互相补充联合应用［1］。在此基础上，随着探针制备的完善与发展，进一步衍生出染色体涂抹(chromosome painting,CP)［2］，比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)［3］［4］及反向染色体涂抹(reverse CP,RCP)等。这些技术的联合应用，丰富了细胞遗传学研究内容，使细胞遗传学向分子领域发展，并在临床和科研工作中得到广泛应用。但是FISH也有其局限性，首先它只能用特异性的探针检测已知的染色体异常；其次，能够同时检测的目标数受限于探针数，也就是荧光显微镜所能分辨的荧光素的数目［5］。因此，FISH不能作为染色体异常的筛选实验。1990年，Nederlof等［6］描述了一种方法，仅用3种荧光素标记了7种探针(表1)，这种方法称为联合标记(combinatorial labeling)。1992年，David Ward等［7］再次用3种荧光素同时检测了7个DNA探针，证实了其可行性。于是，科学家们设想给人类22条常染色体和2条性染色体染上不同的颜色，可以在一份标本上同时看到24种颜色显示出所有染色体。但是由于技术与设备等原因，直到1996年Speicher等［8］在一次对分裂中期染色体的分析中，同时以24种颜色显示出所有染色体。这种细胞遗传学方法被称为复合FISH(multiplex FISH,mFISH)。
表1 mFISH联合标记方法
1 mFISH基本原理和方法
将一个人类染色体探针池分别标记上24种不同的荧光素组合，然后与中期染色体分裂相进行杂交，经电荷耦联装置(charge-coupled device,CCD)显微镜
摄像，计算机处理产生24色人类染色体图像。mFISH的成功依赖于24色探针标
［5］记，滤片装置的选择及计算机软件的发展。
1.1 探针标记和荧光选择 mFISH的DNA探针是由显微切割产生、并经PCR扩增的全染色体探针［9］，经缺口平移法进行联合标记。联合标记的出现，使N个荧光素可标记远远多于该数目的探针。如，2种荧光素可标记3种探针，3种荧光素可标记7种探针，那么N种荧光素可组成的有效组合是2N-1，5种荧光素即能产生31种组合，已满足了检测24种染色体的需要。这5种荧光素包括：异氰酸荧光素(FITC)、花氰染色(Cy)3、Cy3.5、Cy5和Cy7，同时用于标记24种染色体(表2)。
在联合标记中，一条染色体或者100%用某种荧光素标记，或者没有用这种荧光素标记。而在另一种新的标记技术——比例标记(ratio labeling)中［10］，通过变换荧光素比例(0～100%)达到标记的目的。如仅使用2种荧光素FITC和德克萨斯红(Texas red)能标记5条染色体，显示出5种颜色(表3)。与联合标记相比，比例标记可以用更少的荧光素得到更多的组合，标记更多的探针，联合标记与比例标记的共同使用，将进一步完善mFISH标记技术［11］，获得更广的应用范围。
1.2 滤片选择 滤片选择每个荧光素与其波长最接近的2个荧光素的激发/发散比值比＞90%［5，8］。如，Cy5与Cy5.5的激发/发散比值比为80%～90%，而其他荧光素的比值比均大于90%，因此，Cy5.5不适用于mFISH。此外，滤片的带宽被限制在5～15 nm范围内，而其他标准滤片的带宽约为50 nm或更宽［8］。
1.3 电脑图像处理 mFISH的图像处理是另一关键步骤。mFISH图像处理软件系统首先纠正由干扰产生的几何图像的移位；根据4，6-二脒-2-苯吲哚(4，6-diamino-2-phenyliodole dihydrochloride,DAPI)染色分辨出一个中期分裂相中所有染色体；计算每种荧光的背景强度阈值；建立每个探针的光谱信号，然后通过识别与探针杂交物质来鉴定染色体，产生复合的灰值图像，每对染色
［12］体分别由1种灰值编码，最后给每种灰值一种伪彩色，并显示出结果。
表2 5种荧光素联合标记人类24条染色体
表3 mFISH按比例标记方法
简而言之，Speicher的方法是通过转换滤片来捕获每个荧光素的单独图像，然后用CCD摄象系统和电脑处理软件叠加每条染色体上的荧光，产生至少24种的伪彩色。同年，Schrock［13］用另一种技术——光谱核型分析(spectral
karyotyping,SKY)同样进行了24种彩色染色体的分析。两者相比，基于滤片摄取原理的mFISH允许使用更广范围的荧光素，产生更少的原始数据，更易进行结果处理。
2 应用
2.1 染色体核型分析 常规染色体核型分析不仅需要高强度劳动力，而且还依赖于个人技术，不能进行完全自动化分析［5］。常规FISH也有其限制性，而mFISH能有效弥补两者的缺陷。与FISH相比，mFISH能在一次杂交实验中筛查所有染色体，并不需要预先知道其核型异常。由于它是通过多次杂交实验找到每条染色体探针的最佳荧光位置，一旦探针构成参数建立了，那么每次杂交的变异就很小，因此可以获得高度的重复性［12］。mFISH能对中期染色体分裂相进行快速分析，即使有很复杂的大量染色体的重排，也能很快分析出；特别对一些未知来源的标记染色体，能很快根据颜色确定其来源；mFISH更能提供全自动核型分析［15］，既克服了常规核型分析的缺点，又具有部分FISH的优点，有其独特的应用价值。
mFISH用于染色体核型分析，可以鉴定数目异常，一些结构重排，例如简单和复杂结构易位，比较大的重复和缺失及一些臂间倒位也能简单鉴定出，重要的是mFISH相对于核型分析来说是全自动，节省了劳力与时间［15］。
在核型分析中，确定断裂点也很重要，mFISH可以作为染色体数目异常及一些结构改变的筛选实验，然后用片段长度分析和染色体带型转换图确定其断裂［16］点。
但是，mFISH用于核型分析不能检测臂内倒位、一些臂间倒位、小的重复及缺失(微缺失综合征)，用于检测隐匿的端粒易位的敏感性还未确定，对于一些中间丢失的断裂点的确定，只能靠传统核型分析。为了使mFISH技术更完善，需要设计位置特异性探针，如臂、带或端粒特异探针［17］。人类基因物理图谱的建立及染色体显微切割技术的发展将大为便利探针库的建立，并能应用于特殊诊断。
2.2 肿瘤细胞遗传学及标记染色体的鉴定 mFISH用于肿瘤细胞遗传学分析可以发现新的染色体异常，如白血病、淋巴瘤及难以进行常规分析的实体瘤的染色体畸变。白血病和淋巴瘤中最多见的是染色体易位，用传统核型分析和FISH已经进行了深入细致的研究。其中有一些相互易位的遗传物质及条带十分相似，用常规方法不能分析出。如t(12;21)易位发生在至少25%的儿童B系急淋患者中，但是由于相互易位染色体的带型与大小很接近，常规细胞遗传学方法的检出率还不到0.05％［18］。那么还有多少未知的染色体畸变不能用常规方法检出，因而也不能用FISH定位。在这方面，用24色FISH将能大大提高检出率。同样，至今我们仍不知道有多少白血病患者有正常的染色体核型(多数实验室报道约15%～20%)，mFISH的应用可能为回答这一问题提供有力的手段。
许多肿瘤有着十分复杂的染色体重排，这些重排染色体被称为标记染色体(marker chromosome)。mFISH在确定标记染色体的来源方面有着突出的优点，
根据标记染色体上不同的颜色能很快确定其来源。Speicher等［8］用mFISH分析了鳞状细胞肉瘤细胞系HTB43，很快地确定了其标记染色体的结构重排和各自来源。可以预见，mFISH与常规核型分析联合应用将会使恶性肿瘤染色体异常的诊断达到前所未有的准确。
2.3 生物学研究 mFISH可用于种间进化研究，通过比较细胞遗传学来检查种系发生，分析染色体结构域及它们的相互关系［12］，特别可以用于检查不同物种染色体序列的同源性程度，在植物、生物进化、农业研究中起到重要的作用［5，8，12］。
mFISH还能用于间期细胞遗传学研究，检测基因的扩增，分析核内组织，定义染色体结构域或多基因家族，确定细胞周期及疾病阶段，为染色体结构和功能研究提供新的信息［5，8］。
总之，mFISH能应用于临床研究、肿瘤诊断和科研等各方面，有其独特的适用范围及优点。它将是传统细胞遗传学最好的补充。FISH的出现，使细胞遗传学进入了一个彩色的时代，而mFISH将是这个时代中又一重要的标志。可以预见的是更多的色彩将同时出现在一张标本上，为我们提供更多的细胞遗传学信息。
(本文编辑 刘萍)
作者单位：徐岚（200025 上海第二医科大学附属瑞金医院血液学研究所细胞遗传学实验室）
陈赛娟（200025 上海第二医科大学附属瑞金医院血液学研究所细胞遗传学实验室）
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