DNA测序原理
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核酸的历史
• • • • • • • • 1865年 瑞士科学家Miescher发现核酸。 1866年 奥地利生物学家Mendel发表论文“植物杂交试验”，提出了遗传学 的分离定律、自由组合定律和遗传因子学说。 1879年 德国生物学家弗莱明Fleming发现细胞核内的染色体。 1903年 美国细胞学家萨顿发现了遗传因子与染色体的平行关系，提出了遗 传的染色体学说。 1928年 遗传学之父Morgan通过果蝇杂交实验证实了染色体是基因的载体 1929年 俄裔美国生物化学家列文发现核酸碱基的主要成份是腺膘呤、鸟膘 呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶。 1944年 美国细菌学家Avery首次证明DNA是遗传信息的载体。 1953年 美国生物学家Watson、英国生物物理学家Crick在英国女生物学家富 兰克琳（R.Franklin，1920－1958）和英国生物物理学家威尔金斯（M.Wilkins，1916 －2004）对DNA晶体所作的X光衍射分析的基础上，根据DNA分子碱基配对原则，构 建出了DNA分子的双螺旋结构模型。 1958年 Crick提出中心法则 1970年后 显带技术 1980年后 荧光原位杂交 ……………………….RNA的研究……………..逆转录现象……………….
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核酸基本知识
• RNA+DNA：A、C、G、T（U）
核酸基本知识
核酸基本知识
核酸基础知识--DNA复制
• 原料： DNA聚合酶（5种），脱氧核酸，模板，拓扑异构
酶，解链酶， SSB，引发酶及引发前体，Mg2+，连接酶
核酸基本知识--PCR
• 聚合酶链式反应--Polymerase Chain Reaction • 1983 Mullis 获得1993年的诺贝尔化学奖 • Taq DNA聚合酶,引物、dNTP、模板和Mg2+
第一代测序技术
• 1977年Gilbert等发明的 化学降解法 • 1977年Sanger等发明双 脱氧核苷酸末端终止 法
第一代测序技术
• • • 底物：模板DNA, Taq 酶, dNTPs, ddNTPs 和测序引物 变性－复性－延伸－终止 ddNTP可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。反应 体系中dNTPs 的浓度远高于ddNTPs( 一般1 ：3~4) 。
第一代测序技术
第二代测序技术
• Illumina/Solexa Genome Analyzer/Hiseq • GA与Solexa GA最早由Solexa研发，后Illumina收购Solex • 型号：GAI -> GAII -> GAIIx -> HiSeq2000
二代测序原理部分--可逆阻断技术
二代测序原理部分--SBS
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Step1.加入底物 Step2.合成第一个碱基 Step3.清除所有游离的碱基 Step4.获取信号 Step5.去除阻断和荧光集团 Step6.如上重复 1-5，直到达到指定长度
Hiseq2000 测序过程
• 构建文库
Hiseq2000 测序过程
PCR
Library
Hiseq2000 测序过程 Flowcell
Hiseq2000 测序过程
Hiseq2000 测序过程
Hiseq2000 测序过程
Hiseq2000 测序过程
第二代测序技术--Solid 测序原理
• Sequencing by Oligo Ligation Detection
S
olid 测序原理
解码流程
A C G T
AA CC GG TT
AC CA GT TG
CC AA TT GG
CT AG TC GA
TC GA CT AG
CT AG TC GA
TA GC CG AT
从颜色序列到碱基序列的翻译会产生不同的4种答案 4个答案中，相同位置每个答案的碱基各不相同 所以，如果碱基序列中只要有一个碱基已知，配合颜色序列，就可以得到 碱基序列的唯一解。
标题
• 该技术具有误差校正功能，因为它是通过两个碱基来对应 一个荧光信号而不是传统的一个碱基对应一个荧光信号， 这样每一个位点都会被检测两次，因此出错率明显降低。
454测序原理
• 焦磷酸测序(Pyrosequencing)
• 在测序时，使用了一种叫做“Pico TiterPlate”（PTP）的平板，它含有 160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学发光反应所需的各种酶和 底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、 A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生 碱基配对，就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经 过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光 素，同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高 灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一 分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的 碱基序列。
454结果图谱
三代测序技术--单分子测序
• Helicos公司的单分子测序技术 • PacificBiosciences公司的单分子实时(Single Molecule Real Time, SMRT)测序技术 • Ion Torrent公司的基于半导体技术的纳米孔测序 • Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分 子测序技术 • Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳 米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号或者PH值 信号进行测序
三代测序技术--单分子测序
• Helicos公司的单分子测序技术
三代测序技术--单分子测序
• Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time (SMRT?) DNA Sequencing”（单分子实时DNA测序） • 荧光标记的脱氧核苷酸、纳米微孔、共聚焦显微镜实时地 快速地对集成在板上的无数的纳米小孔同时进行记录
三代测序技术-- Ion Torrent
三代测序技术
三代测序技术--单分子测序
• 纳米孔测序