文章编号:1008)9632(2001)03)0005)03
遗传多样性概述
沈 浩,刘登义
(安徽师范大学生物多样性研究中心,芜湖 241000)
摘 要:遗传多样性作为生物多样性的重要组成部分,是物种多样性、生态系统多样性和景观多样性的基础。随着研究方法和实验技术的发展,遗传多样性研究从形态学水平、细胞学(染色体)水平、生理生化水平逐渐发展到分子水平。形态标记、细胞学标记、等位酶分析、DNA多态性分析等方法,为我们研究遗传多样性提供了有效的工具。特别是DNA多态性分析是一种更为直接而有效的方法。
关键词:遗传多样性;遗传变异;等位酶分析;PCR;RAPD中图分类号:Q948#5 文献标识码:A 当今的世界面临着人口、资源、环境、粮食与能源五大危机,这些危机的解决都与地球上的生物多样性(Bio-diversity)有着密切的关系,保护生物多样性已成为国际社会关注的热点。生物多样性是生物及其环境形成的生态复合体以及与此相关的各种生态过程的总和,它包括数以百万计的动物、植物、微生物和它们所拥有的基因以及它们与生存环境形成的复杂的生态系统。因此,生物多样性是一个内涵十分丰富的重要概念,包括四个层次:遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样[1]
性。其中,遗传多样性(Geneticdiversity)是生物多样性的核心,保护生物多样性最终是要保护其遗传多样性,因为一个物种的稳定性和进化潜力依赖其遗传多样性,而物种的经济和生态价值也依赖其特有的基因组成[2]。物种的遗传多样性可以从形态特征、细胞学特征、生理特征、基因位点及DNA序列等不同方面来体现。1 遗传多样性的概念
广义的遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和。但一般所指的遗传多样性是指种内的遗传多样性,即种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和[3]。种内的多样性是物种以上各水平多样性的最重要来源。遗传变异、生活史特点、种群动态及其遗传结构等决定或影响着一个物种与其它物种及其环境相互作用的方式。而且,种内的多样性是一个物种对人为干扰进行成功反应的决定因素。种内的遗传变异程度也决定其进化的潜势[4]。
所有的遗传多样性都发生在分子水平。自然界中存在的变异源于突变的积累,这些突变都经受过自然选择。一些中性突变通过随机过程整合到基因组中,上述过程形成了丰富的遗传多样性。遗传多样性体现在不同水平上:居群(Population,又译种群、群体)水平、个体水平、组
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织和细胞水平以及分子水平。通常,遗传多样性最直接的表达形式就是遗传变异性的高低。在自然界,由于个体生命的有限性,有其特定分布格局的居群或居群系统(宗、亚种、种)才是进化的基本单位,故遗传多样性不仅包括遗传变异高低,也包括遗传变异分布格局,即居群的遗传结构,居群遗传结构上的差异是遗传多样性的一种重要体现,一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能
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力取决于种内遗传变异的大小,也有赖于遗传变异的居群结构[6]。
遗传多样性的研究具有重要的理论和实际意义。首先,物种或居群的遗传多样性大小是长期进化的产物,是其生存(适应)和发展(进化)的前提。一个居群(或物种)遗传多样性越高或遗传变异越丰富,对环境变化的适应能力就越强,越容易扩展其分布范围和开拓新的环境,理论推导和大量实验证据表明,生物居群中遗传变异的大小与其进化速率成正比,因此对遗传多样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史(起源的时间、、方式),也能
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为进一步分析其进化潜力和未来命运提供重要资料,
[8]
尤其有助于物种稀有或濒危原因及过程的探讨。其次,遗传多样性是保护生物学研究的核心之一。不了解种内遗传变异的大小、时空分布及其与环境条件的关系,我们就无法采取科学有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源(基因),来挽救濒于绝灭的物种,保护受威胁的物种,对珍稀濒危物种保护方针和措施的制订,如采样策略、迁地或就地保护的选择等等,都有赖于我们对物种遗
[8,9]
传多样性的认识。再次,对遗传多样性的认识是生物各分支学科重要的背景资料。对遗传多样性的研究无疑有助于人们更清楚地认识生物多样性的起源和进化,尤其能加深人们对微观进化的认识,为动植物的分类、进化研究提供有益的资料,进而为动植物育种和遗传改良奠定基础。
2 遗传多样性的研究方法
从远古时代进行动物饲养、植物栽培起,人们就开始了对生物遗传多样性的利用和认识。但科学地总结并提高到理论高度进行系统化的首推达尔文。随着孟德尔定律的重新发现(1900)及20年代摩尔根染色体遗传学及后来发展成的细胞遗传学为群体遗传理论提供实验证据。
检测遗传多样性的方法随生物学,尤其是遗传学和分子生物学的发展而不断提高和完善,然而目前任何检测遗传多样性的方法,或在理论上或在实际研究中都有各自的优点和局限,还找不到一种能完全替代其他方法的技术[9]。
211 形态学水平
基金项目:安徽省教育厅自然科学基金资助项目,编号:(98JL154)
作者简介:沈浩(1975))男,99级硕士研究生,主要从事植物生态学和生物多样性研究
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从形态学或表型性状上来检测遗传变异是最古老也最简便易行的方法。通常所利用的表型性状主要有两类,一是符合孟德尔遗传规律的单基因性状(如质量性状、稀有突变等),另一类是根据多基因决定的数量性状(如大多数形态性状、生活史性状)[10]。由于天然居群中,单基因性状很少,用其作为遗传标记来研究遗传多样性主要还是针对一些具有重要经济价值的农作物、林木和园艺作物及其野生近缘种,而且多利用这类单基因标记来研究交配系统、基因流和选择等进化因素。相比之下,针对数量性状的研究则由来已久,通过对这些数量性状的研究同样能分析居群的遗传水平和遗传结构。在利用数量性状来研究遗传变异时,还有另一种更为科学和严密的方法,即数量遗传学方法。这种方法是通过特定的杂交试验和后代测定来分析性状在亲子代间的传递规律,将影响数量性状变异的遗传因素同环境因素区分开来,确定遗传因素在性状变异中的相对重要性;同时分析遗传和环境交互作用,甚至可以估算控制数量性状多基因的位点数目。在许多场合,利用形态性状来估测遗传变异是最现实的方法,尤其是当需要在短期内对变异性有所了解或在其他生化方法无法开展之时,形态学手段不失为一种有价值的选择[9]。其缺点是由自然突变或物化诱变所获得的具有特定形态特征的材料所需时间长,且可能产生不利的性状;遗传表达有时不太稳定,易受环境条件及基因显隐性的影响。212 染色体水平
染色体是遗传物质的载体,是基因的携带者。与形态学变异不同,染色体变异(畸变)必然导致遗传变异的发生,是生物遗传变异的重要来源。在任何生物类群的天然居群中都存在或大或小的染色体变异,这些变异在进化过程中起着十分重要的作用。染色体变异主要体现为染色体组型特征的变异,包括染色体数目变异(整倍性或非整倍性)以及染色体结构变异。种内染色体的整倍性变化在动物中是不常见的,主要出现在一些孤雌生殖的种类中。可是,多倍性在植物中广泛存在,大多数有染色体资料的被子植物科都有一些种呈现种内多倍性。除了整倍性变化外,染色体数目也可不成倍增加,即非整倍性变异。尽管非整倍性常导致发育失败或不正常,因而在进化中的意义不大,但在不少动植物种内,非整倍性变异仍是很普遍的现象。和染色体数目的多态性相比,染色体结构变异在种内就更为常见。染色体结构变异的研究在果蝇中开展最多,尤其是倒位多态现象。除了倒位之外,其它染色体结构上的变异(缺失、重复、易位)在动植物居群中也并非少见,都是构成染色体多态现象的重要因素。除了数目和结构变异外,染色体水平上的多样性还可体现在染色体的形态(着丝点位置)、缢痕和随体等核型特征上,这些特征的变异使种内出现细胞型的多样性。随着染色体研究技术的不断发展,如分带技术、细胞原位杂交方法的应用,无疑能在染色体水平上揭示出更多的遗传多样性。此外,超数染色体(B染色体)在种内的变化也很大[8]。
染色体多样性检测主要对细胞分裂时期染色体的数目和形态特征(如相对长度、臂比值、着丝点位置、臂指数等加以分析,即核型分析,得到一定的核型。不同种类的生物或同种生物的核型不同。但某些种类,特别是种下水平居群间,其组型和染色体特征差别不明显,则必须对染色体进行分带处理,显示深浅不同的染色体带纹,如C带、Q带、G带、R带、T带等等[14]。显然,细胞学标记的数目也很有限。213 等位酶水平
Markert和Moller1959年报道了乳酸脱氢酶在不同组织、不同个体以及不同种内的不同形式的存在,这就导致了/同工酶(Isozyme)0概念的产生:有机体产生的催化同一反应但具不同分子形式的酶。Prakashetal.提出了把同一基因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形式叫做/等位酶(Allozyme)0,是借助于特定的遗传分析方法确定的一种特殊的同工酶,把它从广义的.同工酶0的概念中分了出来。由于其通常以共显性方式遗传,在生物界中广泛存在;且材料来源丰富、实验技术简单、结果易于比较,使其成为一种十分有效的遗传标记,因而成为近一二十年来检测遗传多样性应用最普遍的方法,是当前分子系统学中应用最广泛的手段。迄今已积累了十分丰富的资料,并在采样原则、实验方法、数据处理和结果分析方面形成了一套统一的标准,尤其是建立了度量遗传变异和居群遗传结构的定量指标,使整个生物界遗传多样性的研究结果可以在共同的基础上进行比较。通过将一批等位酶位点作为基因组的随机样本,利用群体遗传的知识,计算遗传多样性的度量指标,如多态位点的百分数P(PercentageofPolymorphicLoci),平均每个位点的预期杂合度He(MeanExpectedHeterozygosityPerLocus),平均每个位点的实际杂合度Ho(MeanObservedHeterozygosityPerLocus),内繁育系数F(InbreedingCo-efficient),基因分化系数Gst(CoefficientofGeneDifferen-tiation),遗传一致度I(GeneticIdentity)等。由此可以有效地揭示生物居群的遗传学结构,了解居群内、种内、种间乃至种上遗传多样性的情况;而且还可以用来判断其繁育系统的性质、生殖方式;结合居群的生态条件进行同工酶和DNA分析,则可以了解生物适应生态环境的遗传学基础。迄今关于植物天然群体遗传变异及遗传结构方面的知识几乎都来自等位酶研究的结果。等位酶分析同样有其局限性,表现在:实验结果随动植物不同发育时期、器官及环境而变化;可以利用的遗传位点数量比较小,常规电泳方法只能检测出DNA序列中1/4左右的碱基替换;对电泳分析的样品要求较高。因此,其代表性和敏感性仍不如对DNA直接分析。214 DNA水平
DNA是遗传物质的载体,遗传信息就是DNA的碱基排列顺序,因此直接对DNA碱基序列的分析和比较是揭示遗传多样性最理想的方法。目前DNA分析技术主要是针对部分DNA进行的,从原理上可大致分为两类:一类是直接测序,主要是分析一些特定基因或DNA片段的核苷酸序列,度量这些片段DNA的变异性;另一类是检测基因组的一批识别位点,从而估测基因组的变异性。直接测序是一件费时、费力、经济投入很大的工作,主要是针对一些比较保守的DNA片段,如Rubisco大亚基基团、rDNA部分片段等,使序列分析主要应用在动植物系统发育推断和宏观进化研究方面,相比之下,对不特定基因组或DNA片段识别位点的研究则十分普遍,最常见的是限制性片段长度DNA(RestrictionFrag-mentLengthPolymorphism,RFLP)方法)))用特定的方法将核(n)DNA、叶绿体(cp)DNA、线粒体(mt)DNA或
者总DNA提取出来,用已知的限制性内切酶消化、电泳印迹,再用DNA探针杂交并放射自显影,从而得到与探针同源的DNA序列酶切后在长度上的差异。迄今已分离到的限制性内切酶种类已有500多种,各自均有其特异的识别序列(位点)。作为探针的DNA片段可以来自叶绿体基因组、核糖体(r)DNA、单拷贝基因(如ADH)
[10]
1)以及高变序列等。利用各种限制性内切酶及DNA探针进行组合,将得到一大批DNA标记,有效地揭示出DNA水平上的遗传多样性。但RFLP分析需要比较完善的包括多种酶切、标记、分子杂交等技术的实验室,而且工作量大、成本高以及放射性标记所存在的安全性问题,使其应用受到一定的限制。随着聚合酶链式反应(PCR)技术的建立,通过利用一对特定的寡核苷酸片段为引物在耐热TaqDNA聚合酶催化下,数小时乃至几十分钟内就可将目的基因扩增上百万倍,推动了分子标记进一步发展,与RFLP相比,它所需要的DNA量较少,可检测纳克(ng)水平;不需要同位素,安全性好;较便宜,快速易行,易于自动化。目前应用较多的有:随机扩增多态DNA(RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)技术、DNA扩增指纹分析DNAAmplificationFinger-printing,DAF)、任意引物PCRArbitraryPrimedDNA,AP)PCR)、序标位(SequenceTaggedSite,STS)等,并开始应用于遗传育种、进化等许多研究领域,包括遗传多样性检测。RAPD技术由Williams和Welsh首先提出,是利用一个随机序列的寡核苷酸作引物,通常为10个核苷酸,以生物的基因组DNA作模板进行PCR扩增反应,经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性。与常规PCR反应相比,RAPD有以下特点:(1)RAPD引物是一个10bp的随机引物,常规PCR需要2个20bp左右的特定设计引物;(2)RAPD反应退火温度较低,一般在36e左右,一方面保证引物与模板的稳定配对,同时允许适当的错误配对,提高多态检出率。RAPD标记检测灵敏、方便、多态性强,可以检测出RFLP标记不能检测的重复顺序区,可补RFLP图谱的空缺,适用于种质资源鉴定和分类、目标性状基因的分子标记、遗传图谱的快速构建等研究,已应用于遗传多样性检测。但RAPD标记为显性标记,不能有效鉴别杂合子;易受反应条件的影响,稳定性较差。解决的办法之一是以测序扩增区段(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion,SCAR)标记取代RAPD,即对特异RAPD条带进行克隆并测序,以测出序列的一端10)20bp加以RAPD引物的10bp合成出寡聚核苷酸引物,以此引物进行基因组常规PCR分析。DAF技术是利用非常短的随机引物扩增不同个体的DNA,然后采用高分辨力的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染显色检测DNA的多态性。DAF使用引物为7~8bp,比RAPD反应更短,因而扩增产物也更多。最近DAF技术得到进一步改进:(1)内切酶消化模板DNA;(2)使用微发夹引物,从而成倍增加可以检测的DNA多态性。DAF技术提供信息远远高于RAPD分析,但技术较为复杂。AP)PCR在PCR反应中使用的引物长度与常规PCR相当,但退火温度较低,允许大量错配,引动具有随机性质的扩增。由RAPD、DAF、AP)PCR一起组成的多态性分析方法统称任意扩增多态谱(MultipleArbitraryAmpliconPro-filing,MAAP),其中应用最广的还是RAPD标记。STS最早由OlsonM提出,它是由一般长度为200~500bp的
序列所界定的位点,在基因组中只出现一次。任何单拷贝的多态性标记都可作为基因组的界标转变为STS标记。获得STS的方法是将单拷贝的克隆DNA从两端测序,设计一对专门扩增引物(大约20bp)特异性扩增这一段序列。最富多态性的STS标记可能是扩增带有微卫星重复序列的DNA区域所得到的STS标记。STS标记的突出优点是共显性遗传方式,很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记转移。在人类基因组作图中已获得了21000个STS,它们是将遗传图谱和物理图谱整合的有力中介。扩增片段长度多态性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)是Zebeau等发明的一项技术。其基本原理是将DNA用可产生粘性末端的限制性内切酶消化产生大小不同的酶切片段,与含有共同粘性末端的人工接头连接,作为进一步扩增的模板。实验中,根据需要通过选择在末端上分别增加1~3个选择性核苷酸的不同引物,这样使得引物能选择性识别具有特异配对顺序的内切酶片段,然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上电泳,产生扩增片段长度不同的多态性带型。AFLP标记实际是RFLP和PCR相结合的一种产物,所需DNA量少,实验结果稳定可靠,重复性强,呈典型的孟德尔遗传,每个AFLP反应可以检测的位点多达50~100个,多态性很强,非常适合遗传多样性分析、种质鉴定、基因定位、快速构建遗传图谱等研究。美国的Blair利用AFLP技术研究54份水稻品种的系统发育和分类,并且用同工酶研究得出的结果进行比较,认为二者不仅结论一致,并且AFLP对研究水稻品种的遗传变异和构建基因组图谱十分理想。AFLP技术的缺点是需要同位素检测,费用昂贵,对操作人员素质及DNA质量要求较高。参考文献:
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Theroleofmetallothioneinsandphytochelatins
inheavymetaltoleranceofplants
LOULai-qingSHENZhen-guo
(KeyLaboratoryofCropGrowthRegulation,MinistryofAgricultureofChina,CollegeofAgonomy,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,210095,China)
Abstract:PCsandMTswhichareessentialforplantstotoleratetheheavymetalsexistinplant-kingdomextensive-ly.Theycanformthecomplexitionswiththeheavymetalstoalleviatethetoxicityofheavymetaltoplants.Thisarticlegiveabriefintroductiononthesetwochelatinsabouttheircompositions,biosynthesis,genicregulationandtherolesinalle-viatingheavymetaltoxicityinplants.
Keywords:phytochelatins;metallothioneins;alleviate;gene.(上接第7页)
Summaryofgeneticdiversity
SHENHao,LIUDeng-yi
(BiodiversityResearchCenter,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000,China)
Abstract:Asanimportantcomponentofbiodiversity,geneticdiversityisthebasisofspeciesdiversity,ecosystemd-i
versityandlandscapediversity.Withtheimprovementofresearchmethodsandexperimentaltechniques,theresearchofgeneticdiversityhasdevelopedfrommorphological,cytological,physiologicalandbiochemicalleveltomolecularlevel.Themethodssuchasmorphologicalmarking,cytologicalmarking,allozymeanalysis,DNApolymorphismanalysis,providedre-searcherswithefficienttoolstostudygeneticdiversityonseverallevels.Especially,usingDNApolymorphismanalysis,peo-plecanhavemoredirectandeffcientunderstandingofgeneticdiversity.
Keywords:geneticdiversity;geneticvariation;allozymeanalysis;PCR;RAPD.