荧光定量PCR 中探针法与染料法的区别：
一、荧光定量PCR 中探针法与染料法的描述：
1. 荧光定量PCR 探针法：探针法即除了引物外另外设置一个探针，在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团，这个时候，两个平衡不发光，但是当DNA 通过引物合成的时候，探针被折断，释放出发光集团和淬灭集团，两个距离较远，发光集团产生荧光，被机器收集到信号，从而检测基因的量
2、荧光定量PCR SYBR Green 染料法：染料能够与双链结合，当PCR 扩增的时候，染料结合到DNA 上，从而发光，单个的染料不发光，这样就能收集到信号，我们可以看出，染料法特异性不强，只要是双链的DNA 都回结合发光。
二、荧光定量PCR 中探针法与染料法的优缺点
1、探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，能够用多重体系反应的方法，能够预测和提前进行反应条件的优化，缺点是要合成探针，成本高
2、染料法经济实惠，可以做溶解曲线，分析全部PCR 产物的TM 值，缺点就是特异性没有探针法好
【分享】定量pcr 仪选则宝典:各自精彩的选择
如何选择合适的定量 PCR 仪定量PCR 仪主要由两部分组成，一个是PCR 系统，一个是荧光检测系统。选择定量PCR 仪的关键——由于定量PCR 必需借助样本和标准品之间的对比来实现定量的，对于定量PCR 系统来说，重要的参数除了传统PCR 的温控精确性、升降温速度等等，更重要的还在于样品孔之间的均一性，以避免微小的差别被指数级放大。至于荧光检测系统，多色多通道检测是当
今的主流趋势——仪器的激发通道越多，仪器适用的荧光素种类越多，仪器适用范围就越宽; 多通道指可同时检测一个样品中的多种荧光，仪器就可以同时检测单管内多模版或者内标+样品，通道越多，仪器适用范围越宽、性能就更强大。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED 光源，前者可配多色滤光镜实现不同激发波长，而单色发光二极管LED 价格低、能耗少、寿命长，不过因为是单色，需要不同的LED 才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD 成像系统和PMT 光电倍增管，前者可以一次对多点成像，后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品，需要通过逐个扫描实现多样品检测，对于大量样品来说需要较长的时间。定量PCR 仪需要考虑的另外一个因素是软件设计，这一点目前较新型号的仪器都有不错的配套软件可以满足常规使用。——随着定量PCR 技术在临床诊断、疾病监控、药物监测、肿瘤研究等领域的越来越广泛的应用，市面上不同品牌和设计的定量PCR 仪也不断推陈出新，生物通在这里着重介绍不同的3类定量PCR 仪，各有各精彩。
1. 传统的96孔板式定量PCR 仪传统的96孔板式定量PCR 仪以美国应用生物系统公司(ABI)为代表。传统96孔板式定量PCR 仪的优点是可容纳的样本量大而且无需特殊耗材，可以采用传统的96孔板甚至384孔板进行批量的定量反应，但是缺点也显而易见——温度均一性不佳——平板固定加热模块的PCR 温度控制有边缘效应——样品槽上每个孔之间的温度存在差异——也就是所谓位置效应，因此标准曲线的反应条件应难以做到与样本完全一致，样本和样本之间的温度控制也可能存在差异，对于灵敏度极高的定量PCR 来说，任何极微小的差异都会以指数级别的规模被放大，不能不说是一种缺憾。传统反应板面积大，温度控制的精确性、升降温速度也相对较慢，因而反应速度也较慢。96孔板定量PCR 仪的荧光检测分析系统，由于96孔板上样品孔的位置是固定的，每个样品孔距离光源和监测器的光程各不相同，有可能对结果产生影响。检测在试管管底进行，试管底的透光性和厚薄均一性都可能对结果产生影响。MJ 和Bio-Red 公司的定量 PCR 仪也属于这一类。 ABI 的7500型荧光定量PCR 仪激发光源为卤钨灯光源，5色滤光镜，可同时激发96个样品，超低温CCD 具备同时多点多色检测的能力，能够有效地分辨 FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和
Cy5等荧光染料。多色荧光检测技术为多重定量、SNP 分析、基因型分型和带阳性内对照的阴/阳性分析提供了基础。多重定量即在同一反应管内同时对多个目标基因进行定量，可以大大提高精度并节约成本。随机配置的定量PCR 引物和探针设计软件Primer Express非常有用，“因为到目前为止还没有其他软件有能力设计定量PCR 所需的TaqMan 探针(生物通摘自ABI 技术资料) ”。各型号都有实时动态(Real-Time)和终点读板(Plate Read)两种运行模式。实时动态模式用于定量DNA 或RNA 拷贝数。可以动态显示PCR 扩增曲线的生成，定量的线性范围大于9个数量级，区分5000和 10000个拷贝的DNA 模板可信度达99.7%。终点读板模式用于基因型鉴定、点突变检测和单核苷酸多态性(SNP)分析等。当然，也可以作为普通 PCR 仪使用。ABI 定量PCR 仪最大的优势在于ABI 已经发布十二万种Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因组基因表达分析试剂盒，覆盖人类全部4万个基因，二百万种Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因组SNP 检测试剂盒，为运用7000、7300、7500、7900型开展课题研究创造了绝佳的条件。ABI 的定量PCR 仪均支持两种定量化学：TaqMan 荧光探针和SYBR Green I 荧光染料。其熔解曲线(Dissociation Curve) 功能用于判断PCR 扩增反应是否特异，有无杂带生成。7500型号比7300多一个滤光镜，新的光路设计使长波长红色荧光的检测灵敏度大大提高，带有快速运行模式。增强的7900型在96孔模块的基础上更加可以更换384孔版模块，使得高通量处理数据的能力大大增强，应该更适合经常处理大量标本的实验室吧。 MJ 的Option 系列是在MJ 原来的常规PCR 仪基础上改造，采用LED 光源PMT 光电倍增管荧检测器。 96个单色LED 光源对应96孔板，但是单色LED 激发波长范围较窄。Option 是单道单个光电倍增管荧光检测器，升级的Option2是双PMT 光电倍增管荧光检测器，PMT 灵敏度高但一次只能扫描一个样品，所以Option 系列是逐孔扫描而非同时检测96个样品。双PMT 可同时进 行双色检测 (FAM/SYBR Green I;VIC/Joe/TAMRA)。优势之一是带梯度功能。Bio-Rad(伯乐) 也算是个熟悉的品牌，iCycler iQ 实时定量PCR 系统也是96孔平板式固定加热的，荧光检测波长范围400-700nm ，可4波长同时检测，仪器的设计灵活，定性和定量部分可独立工作，同样可完成梯度PCR 。5组滤光片位置使用户可以自由选择不同的检测波长。专利技术intensifier 荧光放大器保证了极高的检测灵敏度。MJ 被 Bio-Rad 收购后，
Option 和iCycler iQ目前还是各自走各自的销售渠道，至于将来Bio-Rad 会如何决定二者的发展方向还需要拭目以待。
小 中 大 2. 创新概念的离心式实时定量pcr 仪为了克服平板式定量pcr 温度均一性差的缺点，聪明的研究人员又开发出创新概念的离心式实时定量pcr 仪，以roche 罗氏的lightcycle 和corbett 的rotor-gene 为代表。pcr 扩增样品槽被巧妙地设计为离心转子的模样，借助空气加热和转子在腔内旋转，转子上每个孔都是“等位”的，几乎无差别，很好的解决了每个样品孔之间的温度均一性的关键问题 ——corbett 的rotor-gene 样品间温度差异小于±0.01℃，最大程度地保障了标准曲线和样品之间条件的一致性。利用空气做加热介质的优点在于能实现与反应体系无缝接触，接触面积大且加热均匀。虽然有竞争对手批评空气介质比热小，但事实上roche 的lightcycle%202.0却是目前升温速度最快的定量pcr 仪，可以达到20℃/秒!Corbett 的Rotor-gene 也可以达到5℃/秒(样品实际升温速度达到2.5℃/秒) ，优于多数的平板式PCR 仪。借助旋转离心力还可以随时将可能凝在管壁和盖子上的液滴离心到管底而无需热盖; 还可以将酶加在管盖上，升温后离心到管底与反应体系混合，实现“机械的热启动功能”。由于升温速度快，对于常规需要2个多小时完成的定量PCR 反应，Roche 的LightCycler 仅需20—30 分钟即可完成，可以大大节约时间和提高工作效率。这一点对于研究人员来说极为有用，因为你不再需要等2个多小时才能看实验结果了，或者换句话来说，2个多小时你可以做4—5轮定量实验了。 由于转子上的样品孔是旋转可移动的，因而离心式荧光检测系统可以固定激发光源和荧光检测器，随时检测旋转到跟前的样品管——由于每个样品管在检测时距离检测器和激发光源的距离都是“等价”一样的，使用的是同一个检测器和激发光源，有效减少不必要的系统误差。固定的结构使得仪器运行更稳定，使用寿命更长; 离心式定量PCR 都是逐个检测样品的，所以大多采用了长寿的LED(发光二极管) 冷光源，运行前无须预热，无须校正; 系统检测重复性也更好。离心式定量 PCR 仪的缺点主要是离心的转子小，能容纳的样本量有限，由于是离心式转子，常规的96孔板和条形管就不适用，有的还需要特殊的消耗品，增加使用成本。当然离心式定量PCR 仪不可能带梯度功能。 Roche
的Lightcycler 刚推出的时候确实让人眼前一亮! 现在Lightcycler2.0拥有令人心动的优点-----快速：利用空气动力学原理，20-30分钟内完成30-40个循环。控温准确：变温速率最高可达20℃/秒，温差≤±0.3°C 多波长检测：可同时在530、640及710nm 三个通道进行检测，实现同管检测两个项目或设立检测项目的外对照和内对照。此外动态检测范围达10个数量级，而无须将样品稀释; 具有熔点曲线分析功能可以鉴别基因型、检测点突变、检测非特异性扩增，具多种检测模式如Taqman 探针、荧光染料SYBR Green I检测、序列特异杂交探针等; 探针及引物设计方便，杂交探针及引物设计的限制少，而且亦可方便地选用合适大小的扩增子(100-1000bp)。但是 Lightcycler 需要使用特定的毛细管作为样品管，这在某种程度上提高了消耗成本，也不方便作为常规PCR 仪使用。 Corbett 的Rotor-Gene 也是离心式的定量PCR 仪。在品牌的角度上Corbett 当然不如Roche 罗氏在国内那样家喻户晓，之所以特别提到这个产品，确实是因为Corbett 的设计有独到之处。比如Corbett 的Rotot-Gene3000标准型是真正独立的4通道(可建立新通道) ，4个独立LED 激发光源(470nm/ 530nm/585nm/625nm)保证最少的光谱交叉 (0.99935)。由于转子在反应过程之中一直以恒定的低速旋转，使得样品间的温度均一性极佳(±0.01℃/秒) ，同一热反应室提供完全相同的反应条件，同一光学通路提供完全相同的测量通道，每标本每循环检测32次，满足高精度和一致性要求。Rotot- Gene3000提供了36 x0.2ml和72x0.1ml 两种转子，检测是通过薄壁管侧壁而非管底进行的，因而可以使用普通的0.2ml PCR管，并允许在试管盖上标记，这降低了使用成本。Rotot-Gene3000的温控速度不如LightCycler ，但优于多数的固定加热模块的机型，能达到5℃/秒(管内实际升温速度达到2.5℃/秒) 。 Corbett 还有一个光学变性专利——让待扩增样品预先进行一次熔解曲线程序，检测荧光染料信号大小的变化，找到代表全部双链DNA 解链的峰值对应温度，在其后的反应中就无需总是将变性温度设为94度，也不需要延长孵育时间。这个专利使得反应过程大大缩短。Rotot-Gene 主要的问题也是可容纳的样品数量少，只能靠反应速度快，同样的时间可以多运行几轮反应来弥补。对于大量样品的实验室， Corbett 同时还提供定量PCR 反应自动加样系统，不单可以和自家的Rotor-Gene 配套使用提高工作效率和均一性、安全性，也可以配套 Roche 和ABI 的定量PCR 仪。这样就不用担心加样累坏了。
3. 第三类的荧光定量pcr 仪以cepher 公司的smart%20cyclerii为代表，对于国内的用户来说比较新鲜，但这个一直受美国国防部和安全局、美国军队传染病医学研究中心、美国军队士兵和生物化学合作所资助的公司却相当有来头。smart%20cyclerii获得过1998年美国研发 r&d100金奖。smart%20cyclerii的机型小巧，只有16个样品槽，它的独到之处在于这16个样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，也就是说这16个样品槽相当于16台独立的定量pcr 仪! 独立控温的好处首先是，你可以在同一定量pcr 仪上分别进行不同条件的定量pcr 反应，更为灵活自定义的梯度优化反应也好，或者是完全不同的几组反应——甚至，你可能只进行个别样品的检测，只占用其中几个样品槽——过一会儿其它的同事也要用 ——他不需要等待你的反应结束，而可以随时利用空置的样品槽开始其它定量反应! 对于各有各忙的多成员的实验室，要是个别样品就占据96孔样品槽，其它人每轮要再等2个多小时，有时还要等几轮，那可够郁闷的。smart%20cycler%20ii的使用频率可以被最大化，大家都不用等待! 这个世界上唯一允许不同条件pcr 同时进行的定量pcr 仪拥有独一无二的优点，是其它任何平板式或者离心式定量pcr 都不具备的。此外，每个温控模块只控制一个样品槽，升降温速度当然更快——高达10℃/秒，控温精度自然就更高——这里根本不用考虑不同样品槽之间的温度均一性的问题，只有每个模块控温精确度的问题。对于普通的96孔板固定加热模块，本身有控温精度和准确度的差异，再加上样品槽不同位置之间的温度差异，而 Smart CyclerII 就完全减少了一个误差因素。优异的特性使得只要20分钟就可以完成常规的定量PCR 反应，大大提高研究人员的工作效率。每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触，保证荧光激发和检测不受外界干扰，固定的结构使得仪器运行更稳定，使用寿命更长。整合有4通道光学检测系统，分别可以检测FAM/SYBR Green I, Tet/ Cy3, Texas Red和Cy5，可在同一样本中进行多靶点分析，同时检测4种荧光信号，可使用多种检测方法，包括Taqman 探针、分子信标、Amplifluor 引物和Scorpion 引物和荧光内插染料等等。宽达9个数量级的线性范围。不过Smart CyclerII 需要使用独家的扁平反应管，增加了反应成本，上样也不如传统的方法方便，而且16个样品槽也不大适合批量反应的要求——不过Smart Cycler II 的软件设计允许一台电脑同时操作6台Smart Cycler II，部分弥补了缺憾。所以Smart Cycler II会更适合
多成员、样本量不大、要求快速出结果的实验室。不是每个实验室都总是要同时检测几十上百个样品吧? 在选购定量PCR 前之前我们需要先了解自己的需要——是同时检测大量样本? 还是小规模的研究? 是固定的标准化检测方法还是有机会尝试不同的方法? 随着技术的加速发展不断有新的荧光素、标记方法和试剂盒面市，还要考虑仪器性能在将来的可拓展性等等。生物通撰写本文的目的并非指出哪一类的仪器更适合我们的需要——毕竟不同应用领域、不同的实验室有着不同的需求，所以了解不同类型的定量PCR 仪的特点有助于选择更适合自己需要的仪器，“不求最好，但求适合”。
实时荧光Taqman 探针设计的几个要点
实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman 探针设计、实时荧光PCR 探针的选择、
引物的设计及评价。
荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR 技术的特异性比常规PCR 技术大大提高。目前较常提及的有探针、FRET 杂交探针(荧光共振能量传递探针) 和分子信
标Molecular Beacon。
广泛使用的TaqMan 探针法是指PCR 扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM 、VIC 等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA 等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光) 。随着PCR 的进行，Taq 酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响) 就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。报告信号
的强度就代表了模板DNA 的拷贝数。
(请注意，该图显示的不是普通的探针法，而是 MGB探针法) 探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM ，TET ，VIC ，HEX 等等。当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan 探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB 探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher) ，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时上还连接有MGB (Minor Groove Binder) 修饰基团，可以将探针的Tm 值提高10°C 左右。因此为了获得同样的Tm 值，MGB 探针可以比普通TaqMan 探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的
短的探针比长的更容易设计。实验证明， MGB探针对于富含A/TDNA 碱基组成不理想的情况下，
的模板可以区分得更为理想。
探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术利用了Taq 酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂
家只给Taq 酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq 酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C ，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难
于做质控检测。
Real time PCR 探针设计、实时多重PCR 探针的选择和引物的设计及评价
一、实时荧光Taqman 探针设计
总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp 相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp 。当找不到150bp 的保守片段时，必须确保探针的
片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物) 。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有
荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时;2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端) ，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm 值，均要高于平常PCR 的引物和杂交的探针的Tm 值。
二、 探针的设计
探针设计的基本原则：
1. 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且
最好为A 或T ，而不能为G 或A ，因为A 、T 为双键，而G 、A 为三键。
2. 探针长度:Taqman探针的长度最好在25-32bp 之间，且Tm 值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm 值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC 的保守片段，保证其的Tm 值较高。现在有Taqman MGB探针，在TAMER 之后再标记一个MGB ，可使探针的Tm 值较高, 即使探针片段较短，也可达到Taqman 探针的Tm 值要求(68-70℃) 。
3. 探针的名称:应标记探针在基因组的位置及长度。
4. 探针Tm 值计算: 用oligo 或primer preiemer软件即可计算Tm 值。确保探针中GC 含量在30-80%。
应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G 碱基出现。
5. 探针的评价:用DNAstar 软件中的Primerselect 软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入的名称、位置，按Tab 键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的序列。选中整个序列后，在 “report”菜单下“primer self dimer”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer ，
并对此探针用dG 值进行评价(通常给出最差的dG 值，理论上是dG 值越大越好) 。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins ，并对此探针的hairpins 进
行评价。多重荧光PCR 时，要对多条探针进行“pair dimer”进行分析。
6. 探针的5’端不能为G ，因为即使单个G 碱基与FAM 荧光报告基团相连时，G 可以淬灭FAM 基团所发
出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
7. Taqman 探针与引物之间的位置:Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman 探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’ 端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证
探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp 。
荧光定量PCR 详细流程和问题解析 [转自 丁香园论坛]
前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR 技术的PPT 有很多人看过或引用过，考虑到自己作荧光定量PCR 工作已经了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR 实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。
荧光定量PCR 原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。
普通PCR 与荧光定量PCR 技术区别？
简单的讲PCR 技术最早是用于扩增一段特异的PCR 片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR 片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR 技术则是为了测定样本中特异的PCR 片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR 片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA 的含量等。
前些年有人讲过普通PCR 后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR 产物的定量与PCR 样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。
Sybr Green、Taqman 、Molecular beacon、LUX 这些方法如何选择？
从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR 加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR 反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管
中进行一种PCR 反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。
如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman 、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。
另一种值得一提的是LUX 探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman 和Molecular beacon 方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如Sybr Green法
选择单通道实验还是多通道实验？
这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR 反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。
可以看出，如果单通道实验可以解决问题，就不要选择多通道实验了。三个以上的基因进行比较时就最好用单通道。因为一般的仪器最多也只有四个通道，就是有更多的通道，实验条件的优化也是足够麻烦了。
双通道实验时如何克服反应条件、干扰以及模板数差别很大等困难？
对于反应条件的优化，可通过两个单独实验的标准曲线来优化，主要是复性温度，可用PCR 仪的温度梯度功能来选择，然后找到一个合适的复性温度。对于如何确定是否存在相互干扰，
则要通过两个独立的单通道实验与双通道实验的结果进行比较，如果差别不大，则表明没有干扰。至于模板数差别很大的问题，可以通过降低引物浓度的方法来实现，即primer limited，在一般的PCR 反应中，引物的浓度是足够高的，基本上可以将反应液中的核苷酸全部消耗尽，在优化引物浓度时，用不同的引物浓度进行实验，找到不影响反应的C(t)值的最低引物浓度。这样在实际反应中，模板数高的基因在引物耗尽后，反应液中仍然有足够的核苷酸等用于另一个基因的反应。
引物设计中的几个注意事项
1、 引物设计最好用相关的软件来进行设计，考虑引物自身回折、错配、引物二聚体、复性温度、产物变性温度等问题，其中产物的变性温度是大家不太关心的问题，但有些产物在一般的95度条件下不能充分解链，会严重影响实验结果。
2、 引物所设计的片断一定要有足够的特异性，选择好片段后，最好到互联网中进行相关的搜索，看在样本的基因组有没有相拟的基因以及假基因等，如果有，则可选择特异性更高的区域。
3、 在进行mRNA 表达量的定量，可以在引物设计时考虑基因组的污染问题，即在引物设计时让两个引物跨一个内含子，这样基因组污染所造成的扩增可以区别出来，或因为片段过大而不能扩增
4、 由于mRNA 表达量的定量有一个逆转录的过程，如果逆转录是用poly （T ）作引物，则设计的片段尽量靠近poly （A ），以免逆转录的效率影响到实验结果。如果用特异性引物进行逆转录，则要考虑引物区是否存在RNA 二级结构的问题
5、 产物片段的大小：定量PCR 一般产生片段都不大，不会超过600bp 。Sybr Green法一般选择250-600bp ，过大会影响到PCR 扩增的效率，过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分开，但并不是绝对的。Taqman 法的扩增片段都很小，几十或是100多，这是其原理造成的。Molecular beacon法对片段大小的要求不高，只要不是太长即可。
Sybr Green法的实验策略：
实验可分为三个阶段，即实验条件的优化、预实验和正式实验。
一、 实验条件的优化阶段，这一阶段是最花时间的，
1、 要找到一个阳性的模板，可以是克隆有基因质粒、强阳性样本或纯化的PCR 产物等。有了阳性的模板才能进行最基本的定量扩增实验，如果有普通PCR 的实验条件，也可以此
为基础进行实验。
2、 扩增出的产物要通过电泳方法确定其大小，以确认定量PCR 扩增的产物是你的目的基因，有些用户就发生过优化了几天的条件才发现扩增片段的大小不对，不是自己想要的基因。当然，能测个序什么的最好。并通过融解曲线实验来确定产生的Tm 值以及所用的变性温度是否已经足够，个别情况下会出来解键不充分的现象。
3、 有了基本的PCR 条件后，要将阳性模板进行倍比稀释，一般用10倍稀释。将稀释的模板带上阴性对照，分成多份进行温度梯度实验，对复性温度进行优化，以找出复性温度范围，复性温度最好能满足以下条件：高中低模板浓度下PCR 扩增效率都很高、阴性模板没有扩增。选择满足条件的中间温度，这样可以提高实验的稳定性，不会因为样本管在加热模块中的位置不同而影响实验结果。
4、 如果找不到合适的条件，如引物二聚体过多，可对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO 含量等进行优化，然后再进行复性温度梯度实验。其中Mg2+离子浓度、DMSO 含量都会影响Tm 值以及所用的变性温度。
二、 预实验阶段
按照优化的条件对所需要分析的样本做一个没有重复的实验，每个样本做一个10倍和100倍稀释的实验，预实验的目的主要有两个，一是了解样本的模板浓度范围，如果有样本的模板浓度在标准曲线之外，如过高或过低，则可能要对标准曲线进行重新优化，当然，如果过高和过低不影响你的实验结论则可定为高于多少或低于多少，直接进行外推是不科学的。另一个目的看样本中是否有PCR 抑制物的影响，如果每个样本的定量结果与其10及100倍稀释后的样本的结果相同，则表明没有抑制物的影响，如果不同，如原倍结果为零，而10及100倍稀释后的样本的结果为阳性，则表明样本中PCR 抑制物浓度较高。可用其10及100倍稀释后的样本进行定量。
有几个用户发现过实验为阴性的样本在其10及100倍稀释后的样本为阳性的，也许有更多用户没有进行这样的实验，得到了错误的结论。因为样本RNA 的提取试剂中经常有抑制PCR 反应的物质，清洗不干净就会影响到定量PCR 反应。
三、 正式实验阶段
然后就可以进行正式实验了，只需要将每个样本作三个或更多的重复即可以了。有抑制物的样本先进行稀释，计算浓度时不要忘记就行了。最后就可以进行实验结果分析了，个别样本中离群的数值可以删除。
Sybr Green法的注意事项
1、 最好按照上面提到策略进行实验，以免造成不必要重复实验，从而降低实验成本
2、 Sybr Green I一般是先将母液用DMSO 进行稀释100倍，最终的使用浓度为4000-10000分之一。可能不同的Sybr Green I母液的稀释倍数不同，可通过实验来证明，但高浓度的Sybr Green I肯定会影响PCR 反应。另外用水稀释后的Sybr Green I保存的时间很短，一般1周后就不能用了。DMSO 似乎反复冻融会影响性能，但原因不明。
3、 在对引物浓度、Mg2+离子浓度、DMSO 含量等进行优化后仍得不到满意的结果，特别是引物二聚体很多时，可以考虑更换引物，因为引物成本低，而优化实验成本很高。
4、 当有少量引物二聚体影响荧光结果时，可以提高荧光读板时的温度来消除引物二聚体的影响，如将读板时的温度提高到82度，此时引物二聚体已经解链而产物没有解链。但引物二聚体浓度很高时会严重影响PCR 反应，消除引物二聚体的影响也没有用。
5、 大家都知道进行绝对定量需要标准曲线，有些用户认为进行相对定量时就不需要标准曲线了，可以通过2ΔΔC （t ）来计算，但这一计算是有条件的，即所有荧光定量PCR 扩增的效率都接近于100%，可以通过实验来证明。但大多数用户并没有进行这样的实验就直接用2ΔΔC （t ）来计算了。这是错误的，会得到错误结论。
6、 无论是使用自配的试剂还是用商业的荧光定量试剂盒，最好买够试剂，以免进行预实验或正式实验时没有试剂而必需采用其他试剂，由于不同试剂的缓冲液成份有较大差别，如有的试剂中含有DMSO 及Mg2+离子等，可能会影响到实验结果，甚至要重新进行实验条件的优化。
7、 不要在管盖上写字，原因很明显，但有些用户习惯了写字，后来再擦掉，也会对实验有些影响。
8、 最好使用高质量的PCR 管，低质量管的管间差可能会很大。
9、 每次实验一定要有阳性对照和阴性对照，以免出现问题时找不到原因。
10、 在样本很珍贵时可以采用对样本进行稀释的方式进行定量。只要浓度不是太低，理论来讲对稀释是不会影响实验结果的。
其他方法也可以采用类拟的策略，以节约成本，提高效率。
想到的内容就这些了，希望大家多批评指正。
反应体系的建立及优化
1. SG浓度：
终浓度1:5,000－1:100,000，一般为1:10,000—1:70,000
2. Primer浓度：
终浓度50nM －300nM
固定摸板浓度的梯度实验
不加摸板的对照实验（NTC ）——有无非特异信号
熔解曲线的分析——是否单峰
建议使用HPLC 纯化的引物
3. MgCl2浓度
降低MgCl2浓度以减少非特异性产物
最低可至1.5nM
同时做梯度实验和NTC 对照
4. 反应温度和时间参数
反应温度参考所用酶的种类
退火温度使用温度梯度功能优化
反应时间与常规PCR 类似，扩增片断一般为200－300bp
5. TaqMan探针
引物、探针设计：
首先选择探针序列
探针的Tm 值为68－70度，长度不应超过30碱基
探针的5’端不应是G ，G 有可能会淬灭荧光素
引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过400bp ，通常为80－150bp
引物的Tm 值为59－60度，长度约20碱基
避免引物、探针之间的二级结构
委托合成公司设计
使用辅助软件
确定反应参数
一般为两步法，94度10－20s
60度30－60s （Taq 酶的5’外切酶活性在60度最强）
通过温度梯度优化退火温度
三步法， 72度45s
优化引物探针浓度
目标：最高的信号/背景比
最小的Ct 值
引物浓度：50nM-900nM
探针浓度：50nM-250nM
通过多次实验确定各自的浓度和比例
real-time PCR 扫盲文章
real-time PCR 扫盲文章 [转自 丁香园论坛]
多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR ）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR）技术实现了PCR 从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。
1 实时荧光定量PCR 技术的方法学
1.1 原理 所谓real-time Q-PCR 技术，是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在
real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR 产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。
PCR 反应过程中产生的DNA 拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR 反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR 反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR 产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR 中，对整个PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR 反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR 反应处于指数期的某一点上来检测PCR 产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold ）是以PCR 反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline ），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct ）。Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
1.2 荧光化学 目前real-time Q-PCR 所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA 结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。
扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA 结合的荧光分子，如SYBR green 1等荧光染料。Real-time Q-PCR 发展早期就是运用这种最简单的方法，在PCR 反应体系中，加入过量SYBR green 1荧光染料，SYBR green 1荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号。荧光
染料的优势在于它能监测任何dsDNA 序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA 结合，因此它也能与非特异的dsDNA （如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。
扩增序列特异性检测方法是在PCR 反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接法和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在real-time Q-PCR 中最广泛使用的TaqMan 系统就是运用了这个原理。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET ），因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR 扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq 酶的5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。
直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，分子信标（molecular beacon ）就属于这一类，它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互补序列出现时，探针与DNA 杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR 引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR 扩增产物中。目前主要有两种：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。杂交探针（hybridization probe）使用两个特异的探针，其中上游的探针的3′端标记有供体荧光素（donor ），而下游的探针的5′端标记有受体荧光素（acceptor ）。在PCR 中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移（FRET ，此作用与上述水解探针的方式相反），使得受体
荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线（melting curve）对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息。
1.2 荧光化学 目前real-time Q-PCR 所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA 结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。
扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA 结合的荧光分子，如SYBR green 1等荧光染料。Real-time Q-PCR 发展早期就是运用这种最简单的方法，在PCR 反应体系中，加入过量SYBR green 1荧光染料，SYBR green 1荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA 序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA 结合，因此它也能与非特异的dsDNA （如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。
扩增序列特异性检测方法是在PCR 反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接法和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在real-time Q-PCR 中最广泛使用的TaqMan 系统就是运用了这个原理。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET ），因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR 扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq 酶的5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。
直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，分子信标（molecular beacon ）就属于这一类，它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，
结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互补序列出现时，探针与DNA 杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR 引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR 扩增产物中。目前主要有两种：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。杂交探针（hybridization probe）使用两个特异的探针，其中上游的探针的3′端标记有供体荧光素（donor ），而下游的探针的5′端标记有受体荧光素（acceptor ）。在PCR 中模板退火阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移（FRET ，此作用与上述水解探针的方式相反），使得受体荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线（melting curve）对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息。
1.3 定量方法 在real-time Q-PCR 中，模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。
1.3.1 标准曲线的法的相对定量 由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n 倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA 或DNA 的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH 等）。
1.3.2 比较CT 法的相对定量 比较CT 法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR 反应的指数期得到CT 值来反应起始模板的量，一个循环（CT=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。
1.3.3 标准曲线法的绝对定量 此方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量是预先可知的。质粒DNA 和体外转入的RNA 常作为绝对定量标准品的制备之用。标准品的量可根据260nm 的吸光度值并用DNA 或RNA 的分子量来转换成其拷贝数来确定。
2 实时荧光定量PCR 技术的应用
Ｒeal-time Q-PCR的应用范围很广泛，包括mRNA 表达的研究、DNA 拷贝数的检测、单核苷酸多态性（SNPs ）的测定等。以下就目前real-time Q-PCR在易位基因的检测，细胞因子的表达分析，肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测中的应用作一概述。
2.1 微小残留病变的检测 肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了病人的生存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险性。因此微小残留病变（MRD ）的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。Real-time Q-PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。急性粒细胞性白血病（AML ）最常见的染色体异常是交互易位t(8；21) (q 22；q22) ，在这易位中，AML-1转录因子基因和8号染色体的MTG8基因发生融合，致使正常的AML-1转录调控受到影响，这可能是白血病的病因。目前的研究证明用real-time Q-PCR 来检测融合基因有助于对这些病人的MRD 进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价值的。同样的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒细胞性白血病（CML ）的BCR-ABL 融合基因；急性淋巴细胞性白血病（ALL ）的白血病特异的TEL-AML1融合基因；滤泡状淋巴瘤（FL ）的染色体易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。许多研究都在很大程度上受益于real-time Q-PCR方法的应用，随着技术的发展，Real-time Q-PCR 的运用将不断地扩大。
多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR ）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR）技术实现了PCR 从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，本文就此技术及其应用做一综述。
1 实时荧光定量PCR 技术的方法学
1.1 原理 所谓real-time Q-PCR 技术，是指在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time 技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR 产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。
PCR 反应过程中产生的DNA 拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR 反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。在传统的PCR 中，常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR 反应的最终扩增产物，因此用此终点法对PCR 产物定量存在不可靠之处。在real-time Q-PCR 中，对整个PCR 反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR 反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在PCR 反应处于指数期的某一点上来检测PCR 产物的量，并且由此来推断模板最初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold ）是以PCR 反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline ），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数（Ct ）。Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
1.2 荧光化学 目前real-time Q-PCR 所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA 结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。
扩增序列非特异性检测方法的基础是DNA 结合的荧光分子，如SYBR green 1等荧光染料。
Real-time Q-PCR 发展早期就是运用这种最简单的方法，在PCR 反应体系中，加入过量SYBR green 1荧光染料，SYBR green 1荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号。荧光染料的优势在于它能监测任何dsDNA 序列的扩增，不需要探针的设计，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。然而正是由于荧光染料能和任何dsDNA 结合，因此它也能与非特异的dsDNA （如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号。引物二聚体的问题目前可以用带有熔解曲线（melting curve）分析的软件加以解决。
扩增序列特异性检测方法是在PCR 反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接法和间接法。间接的方法就是利用水解探针的策略。目前在real-time Q-PCR 中最广泛使用的TaqMan 系统就是运用了这个原理。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET ），因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。但在PCR 扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq 酶的5′-3′外切酶活性（此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响）将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。
直接的方法指的是标记荧光的探针与扩增产物结合后即直接产生荧光，分子信标（molecular beacon ）就属于这一类，它本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互补序列出现时，探针与DNA 杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光。荧光标记引物是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR 引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR 扩增产物中。目前主要有两种：日出引物（sunrise primes）和蝎子引物（scorpion primes）。杂交探针（hybridization probe）使用两个特异的探针，其中上游的探针的3′端标记有供体荧光素（donor ），而下游的探针的5′端标记有受体荧光素（acceptor ）。在PCR 中模板退火
阶段，两探针同时与扩增产物杂交，并形成头尾结合的形式，使供体和受体荧光素距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移（FRET ，此作用与上述水解探针的方式相反），使得受体荧光基团发出荧光；当两探针处于游离状态时，无荧光产生。由于反应中运用了两个探针，因此增加了方法的特异性，另外也可利用荧光寡核苷酸熔解曲线（melting curve）对与寡核苷酸探针结合的序列进行分析，从中获取有用的信息。
1.3 定量方法 在real-time Q-PCR 中，模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。
1.3.1 标准曲线的法的相对定量 由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n 倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA 或DNA 的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH 等）。
1.3.2 比较CT 法的相对定量 比较CT 法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR 反应的指数期得到CT 值来反应起始模板的量，一个循环（CT=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。
1.3.3 标准曲线法的绝对定量 此方法与标准曲线法的相对定量的不同之处在于其标准品的量是预先可知的。质粒DNA 和体外转入的RNA 常作为绝对定量标准品的制备之用。标准品的量可根据260nm 的吸光度值并用DNA 或RNA 的分子量来转换成其拷贝数来确定。
2 实时荧光定量PCR 技术的应用
Ｒeal-time Q-PCR的应用范围很广泛，包括mRNA 表达的研究、DNA 拷贝数的检测、单核苷
酸多态性（SNPs ）的测定等。以下就目前real-time Q-PCR在易位基因的检测，细胞因子的表达分析，肿瘤耐药基因表达的研究以及病毒感染的定量监测中的应用作一概述。
2.1 微小残留病变的检测 肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了病人的生存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险性。因此微小残留病变（MRD ）的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。Real-time Q-PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。急性粒细胞性白血病（AML ）最常见的染色体异常是交互易位t(8；21) (q 22；q22) ，在这易位中，AML-1转录因子基因和8号染色体的MTG8基因发生融合，致使正常的AML-1转录调控受到影响，这可能是白血病的病因。目前的研究证明用real-time Q-PCR 来检测融合基因有助于对这些病人的MRD 进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价值的。同样的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒细胞性白血病（CML ）的BCR-ABL 融合基因；急性淋巴细胞性白血病（ALL ）的白血病特异的TEL-AML1融合基因；滤泡状淋巴瘤（FL ）的染色体易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。许多研究都在很大程度上受益于real-time Q-PCR方法的应用，随着技术的发展，Real-time Q-PCR 的运用将不断地扩大。
2.2 细胞因子的表达分析 细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应（包括淋巴细胞活化、增殖、分化、生存和凋亡）在免疫系统中起着核心作用。许多不同类型的细胞都能分泌这种低分子量的蛋白质，其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。细胞因子可被分为不同的组；白介素（IL-1～IL-23），干扰素（IFN-α，IFN-γ等），集落刺激因子（CSF ），肿瘤坏死因子（TNF ），肿瘤生长因子（TGF-β等）和化学因子（MCP-1，MIP-1等）。为了阐明在许多炎症反应，自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA 表达谱的可靠定量是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含量往往极低，然而real-time 反转灵PCR （RT-PCR ）以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。
2.3 肿瘤耐药基因表达的研究 对化疗药物的耐药是治疗肿瘤病人的主要障碍。由于耐药限制了许多肿瘤的成功治疗，因此研究肿瘤细胞对耐药机制就变得十分重要。目前研究中发现主要的耐药机制有：ATP 结合盒基因超家族（ATP-binding cassette superfamily ）的膜转运蛋
白介导的耐药，这些蛋白包括：MDR-1基因编码的P-糖蛋白（P-gp ），多药耐药相关蛋白（MRP ），肺耐药相关蛋白（LRP ），乳腺癌耐药蛋白（BCRP ）等；酶介导的耐药，包括拓扑导构酶（Topo ），谷胱甘肽（GSH ）及谷胱甘肽-S-转移酶（GST ），蛋白激酶C （PKC ），脱氧胞嘧啶核苷激酶（deoxycytidine kinase ）等，凋亡基因介导的耐药，如bcl-2家族，p53基因，c-myc 等。多药耐药（MDR ）是多因素，多种机制共同作用的结果。real-time 反转录PCR （RT-PCR ）是了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略的有用手段，它能观测用药前后及复发时肿瘤细胞的耐药基因mRNA 表达变化，从而及时调整治疗方案和评价疾
2.1 微小残留病变的检测 肿瘤疾病尤其是血液的恶性肿瘤常伴有特异性基因的易位，这种易位往往可以作为监测临床治疗效果的一种肿瘤标志。虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了病人的生存期，但是缓解期的病人仍存在复发的危险性。因此微小残留病变（MRD ）的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。Real-time Q-PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。通过对肿瘤融合基因的定量测定能指导临床对病人实行个体化的治疗。急性粒细胞性白血病（AML ）最常见的染色体异常是交互易位t(8；21) (q 22；q22) ，在这易位中，AML-1转录因子基因和8号染色体的MTG8基因发生融合，致使正常的AML-1转录调控受到影响，这可能是白血病的病因。目前的研究证明用real-time Q-PCR 来检测融合基因有助于对这些病人的MRD 进行定量，其作为预后的指标或对治疗方案的评估是有价值的。同样的方法也被用于定量其它的易位融合基因水平，如慢性粒细胞性白血病（CML ）的BCR-ABL 融合基因；急性淋巴细胞性白血病（ALL ）的白血病特异的TEL-AML1融合基因；滤泡状淋巴瘤（FL ）的染色体易位t(14;18)(q32;q21)和bcl-2重排等。许多研究都在很大程度上受益于real-time Q-PCR方法的应用，随着技术的发展，Real-time Q-PCR 的运用将不断地扩大。
2.2 细胞因子的表达分析 细胞因子是调节蛋白，它通过调节免疫反应（包括淋巴细胞活化、增殖、分化、生存和凋亡）在免疫系统中起着核心作用。许多不同类型的细胞都能分泌这种低分子量的蛋白质，其中包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞。细胞因子可被分为不同的组；白介素（IL-1～IL-23），干扰素（IFN-α，IFN-γ等），集落刺激因子（CSF ），肿瘤坏死因子（TNF ），肿瘤生长因子（TGF-β等）和化学因子（MCP-1，MIP-1等）。为了阐明在许多炎症反应，自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA 表达谱的可靠定量是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含量往往极低，然而real-time 反转灵PCR （RT-PCR ）以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。
2.3 肿瘤耐药基因表达的研究 对化疗药物的耐药是治疗肿瘤病人的主要障碍。由于耐药限制了许多肿瘤的成功治疗，因此研究肿瘤细胞对耐药机制就变得十分重要。目前研究中发现主要的耐药机制有：ATP 结合盒基因超家族（ATP-binding cassette superfamily ）的膜转运蛋白介导的耐药，这些蛋白包括：MDR-1基因编码的P-糖蛋白（P-gp ），多药耐药相关蛋白（MRP ），肺耐药相关蛋白（LRP ），乳腺癌耐药蛋白（BCRP ）等；酶介导的耐药，包括拓扑导构酶（Topo ），谷胱甘肽（GSH ）及谷胱甘肽-S-转移酶（GST ），蛋白激酶C （PKC ），脱氧胞嘧啶核苷激酶（deoxycytidine kinase ）等，凋亡基因介导的耐药，如bcl-2家族，p53基因，c-myc 等。多药耐药（MDR ）是多因素，多种机制共同作用的结果。real-time 反转录PCR （RT-PCR ）是了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略的有用手段，它能观测用药前后及复发时肿瘤细胞的耐药基因mRNA 表达变化，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。
2.4 病毒感染的定量监测 扩增技术的发展使得对病毒的定性或定量检测的能力随之提高，也使研究病毒的负荷和疾病进展的关系成为可能。Real-time Q-PCR是主要被运用于科研和诊断领域的扩增技术，它不仅能对病毒定性，而且由于其实验的批间和批内差异小，重复性好，因此能方便、快速、灵敏、准确地定量病毒DNA 或RNA 的序列，更重要的是从中可以动态地研究在整个病程中潜在病毒的复活或持续，从而使临床医生和病毒学家能检测临床的变化，如抗病毒治疗的效果，耐药变异的出现等。目前运用较多的是在器官移值中对使用免疫抑制剂的病人用Real-time Q-PCR 来定量测定CMV 感染。研究表明在骨髓移植的病人中用Real-time Q-PCR 检测CMV 感染比传统的pp65抗原试验更敏感，抗CMV 药物治疗能使血中的病毒含量下降，Real-time Q-PCR对于快速定量骨移植病人的CMV 感染和监测CMV 复活是一个有用的工具。
3 存在的问题及应用前景
在real-time Q-PCR 技术中，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在一些PCR 定量方法均有的问题有待解决。在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。目前由于无一统一标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用real-time Q-PCR来研究mRNA 时，受到不同RNA 样本存在不同的逆转录（RT ）效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物不受实验条件的影响的，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键。另外，与传统的PCR
技术相比，Real-time Q-PCR的不足之处是：（1）由于运用了封闭的检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；（2）因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了real-time Q-PCR 的复合式（multiplex ）检测的应用能力；（3）目前real-time Q-PCR实验成本比较高，从而也限制了其广泛的应用。
随着技术不断改进和发展。目前real-time Q-PCR已成为科研的主要工具，该技术未来的应用前景是令人鼓舞的，一方面real-time Q-PCR技术与其它分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA 拷贝数成为可能。另一方面荧光标记核酸化学技术和寡核苷酸探针杂交技术的发展以及real-time Q-PCR 技术的应用，使定量PCR 技术有一个足够的基础为广大临床诊断实验室所接受，将有助于临床医生对疾病的诊断和治疗。
4 结 语
Real-time Q-PCR 的发展使得研究人员又多了一种比较简单且自动化的手段去研究许多重要的基础课题。虽然此技术仍存在一些不足需要改进，但是它为real-time Q-PCR在常规诊断检测中的运用打下了良好的基础。Real-time Q-PCR将成为未来分子生物学实验室必备的研究工具。