中国农业科技导报,2009,1l(6):30—36JoumalofA加culturalScience明dTechnology
植物实时荧光定量PCR内参基因的选择
胡瑞波,
范成明,傅永福
(中国农业科学院作物科学研究所,国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程,北京100081)摘
要:实时荧光定量RT-PCR(real—time
quatltitative
Deverse
tr粕scriplionPCR,qRT-PCR)具有定量准确、灵敏
度高和高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析。常规qRT—PcR采用相对定量进行分析,其关键步骤是选择合适的稳定内参基因进行校正和标准化。持家基因被广泛用作内参基因,但在所有生理条件下均稳定表达的理想内参基凶并不存在。大多数传统内参基因已不能满足qRT-PcR准确定量的要求。基于基因芯片表达数据和EsT数据库并结合qRT—PcR,可以筛选稳定性好的新的内参基因。简要综述r植物qRT—PcR内参基冈的研究进展,并就内参基冈的选择中应注意的问题进行了探讨。
关键词:实时荧光定量RT—PCR;内参基因;geNo珊;基因表达
中图分类号:Q789
文献标识码:A
文章编号:1008旬8“(2009)06JD030旬7
ReferenceGeneSelectioninPlantReal-timeQuantitative
ReVerseTranscription
PCR(qRT—PCR)
Re80urce锄dGeneticIInprovemem,
HURui-bo,FANCheng—ming,FUYong—fu
(InstitIIte
of
Cr;0pScience,N8tional
ChineseAcaderny0f
Key
F∽ility
of
C∞pGene
AgIicul劬falscience8,Beijinglo008l,China)
sensitivilyand
Absl阳ct:Real一£imeh培h・山.ougllput
keepinggenes
quan£i£atjve
RT—PCR(qRT—PcR)£echnology,访thqu册titativeaccuracy,hjgll
ingene
or
ch煳cteristics,h船beenwideIyused
明alysis,qRT—pCRd如mustbenomalizedwith
are
expression卸alysis.
properandstable
Based
on
thereIativequantitative
House—
one
more
intemalreferencegenes.
But
not
a
customarilyused船endogenousreferencesforrelativequantification.single
gene
c肌act
酗auniversalreferencereportedso陆.MostofthetraditionaIhousekeepinggenesareunabIetoensureaccurateno珊alizationinqRT—PCR.B髂edonthetremendousgene・chipexpres¥iondataandpublicdepositedESTdata,new
refe咖ce
geneswith8uperior
qRT-PCR
was
8tability
genesinplalltdiscussed.
selectedandverifiedwithqRT—PCR.1’Ileresearchprogressofreference
reviewedandaspectstobeconsideredinfuturereferencegeneseIecti帆we陀also
were
Keywords:real—timequantitative
rever8e
tramcriptionPCR;ref每rencegenes;geNo珊;geneexpression
实时荧光定量RT—PCR(real—time
reverse
quantitative
tran8cription
PCR,qRT-PCR)是在传统
进行校正和标准化‘3,41。qRT.PCR结果的准确性在很大程度上取决于内参基冈的选择。本文就植物qRT—PCR内参基因的研究进展作简要综述。
1
PCR技术基础上发展起来的一种新的核酸定量技术,具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析¨,2J。在qRT—PcR中,为了去除不同样本在RNA产量、质量和反转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择内参基因
内参基因的选择标准
理想的内参基因应满足以下条件:①在不同
发育阶段和不同组织器官中稳定表达‘41;②表达
收稿日期:2009m3-25;修回日期:2009一lO-28
基金项目:国家863计划项日(2006AAlOAlll,2007AAlOzll9);国家转基因重大专项(2008zx0809JD01);“十一五”国家科技支撑
计划项目(2007BAD59肋2)资助。
作者简介:胡瑞波,博十研究生。研究方向为植物发育分子生物学。E.咖il:myhu@yaIIoo.cn。通讯作者:傅永福,研究员,主要研究
方向为植物发育分子生物学。1'el:010.82105867;E—mil:胁19cn@163.cm
6期
胡瑞波等:植物实时荧光定最PcR内参基因的选择
3l
不受细胞周期调控,不受诸如温度、光照、生物或非牛物胁迫等内源和外源信号的影响㈣;③其稳
定的表达水平与目标基因表达水平相近‘6|。但迄今为止,尚未发现这样的理想内参基因。
2传统内参基因的缺陷
在植物qRT—PCR研究中用的最多的内参基因通常是持家基因(housekeepinggenes),主要包括18SrRNA,3一磷酸甘油醛脱氢酶基因(甜只
DⅣ),转录延伸因子基因(朋-J仅),多聚泛素酶基
因(∞p),肌动蛋白摹因(Acr),0【微管蛋白基因
和B微管蛋白基因(删,形8)等"’4’6’7I。在前
基因组时代,人们之所以选择持家基因作内参基因是因为持家基因是牛物体维持生命活动所必需
的细胞器骨架的基本组分(Acm阴,刚曰等)或
参与牛物体的基本生化代谢过程(GA肋日,EF.
,a,蝴p等),因此持家基因应该在所有的细胞和
生理状态下都较稳定地表达。但是,最近一些研
究表明,持家基因在不同细胞类型和不同生理状态下的表达并不是恒定不变的¨。.9J。这就使持家基因作为qRT—PcR内参基因的功能受到挑战。
但是长期以来,人们在没有更好的内参基因供选择的情况下,仍采用传统的持家基冈作内参
基因而不去考虑在该实验条件下持家基因的表达是否会发生变化。这主要是由于以往的基因表达
分析中,人们主要依赖于Norhtem杂交、组织化学
染色或RT—PCR,而这种分析基本上是定性分析
或相对定量分析,持家基因由于表达丰度高,如果
目标基因表达被上调或下调就能明显表现出来。但是qRT—PCR是对基冈表达的准确定量分析,传统的持家基因就不能满足定量分析对内参基因的
要求。再者,持家基凶在某些组织器官、发育时期或生理状态一般是稳定表达的,而当实验条件改
变时它们的表达也会发生变化,而且不同类型的样品(如不同器官问的比较)持家基因的表达也不一样。如果考虑小到内参基因表达的变化就会导致qRT—PcR的结果准确性降低甚至得到卡H反或错误的结论¨¨12J。例如18SrRNA基因常被用
来作内参基因,但是并不是十分理想JJ。其一,
18s
rRNA表达丰度很高,当目标基因丰度较低
时,定量结果准确性较低;其二,18SrRNA要求反
转录必须使用随机引物,而目标基因反转录常使用ol培odT,这可能会使二者的反转录效率不同而影响基囚表达水平的可比性;其三,不同生理状态的组织器官中rRNA与mRNA的比例并不是恒定不变的,mRNA通常占总RNA的5%一10%【l
3|。
虽然rRNA合成的调节独立于mRNA,rRNA的转
录易受到各种生物因素和药物的影响,其表达水平也并不是恒定不变的,在有丝分裂期间,18S
rRNA明显减少或停止表达。再者,RNA的部分
降解对18srRNA的表达水平的影响似乎要小于
对mRNA的影响¨4|。
Gutierrez等【1列分析了拟南芥10个传统内参基因(AC珐,AC刀,AC飓,AP",e几a,e,群a,
TUB2,TUB6,TUB9,UBQ4,UBQ5,UBQlo,
珊QJJ)在14个不同组织器官中的表达稳定性,
结果表明不同内参基因的稳定性存在显著差异,
AJp"和池∞的稳定性相对最好,而刑腼的稳
定性最差。
Kim等。叫分析了4个水稻内参基因(18s
rRNA,甜PD日,AC丁,刚B)表达稳定性,结果表明
18S
rRNA无论是在不同发育时期的黄化苗,还是
在不同品种和紫外伤害下的黄化苗,表达均最为
稳定。Jain等|16J分析了10个常用内参基因(18S
rRNA,25S
rRNA,硼C,瑚∞,叩Q,D,AC丌,,
GAPD日,EFJd,e伊4仅和?础)在25个水稻样品中的表达稳定性,结果表明邶∞和EF,a在不
同发育时期和组织器官中稳定性最好,而18s
rRNA和25SrRNA在逆境胁迫样品中的稳定性最好。
李钱峰等Ⅲo以6个籼粳稻品种胚乳为研究
材料,分析了7个常用持家基因(eE几如,胛4口,
瑚}C,甜尸D日,船9巧,观和AC死)表达稳定
性,通过geNo唧分析表明:不同的品种间,eEF勘
和AC"的表达最为稳定,咄c的表达变化最为
明显。
Hong等¨引分析了9个短柄草内参基因
(ACT7.RCA,EFl仅,GAPDH,s伍mDC,TUA6,
叩cJ8,叩钟,昭QJ)在21个不同发育时期组织
器官在逆境胁迫(干旱、盐、冷、热)和激素条件下的表达稳定性,geNo肿和NoHnFinder分析表明泛素结合酶基因18(u占c,8)在所有供试样品中表
达稳定性最好,船僻和ⅧQJD在不同组织器官
和发育时期样品中表达最为稳定,S一腺苷甲硫氨
酸合成酶基因(疏mDC)在环境胁迫样品中的表
32
中国农业科技导报ll卷
达最为稳定。
Jian等【1引分析了10个大豆内参基因(AC呓/
7.ACTll。TUA,TUB,ELFl仅,UBC2,ELFlb,CYP2,
伤PD,叩QJ『D)在21个不同发育时期、组织器官
等样本中的表达稳定性,结果表明lO个内参基因的表达稳定性存在显著差异,在所有供试样品中
脱几6和C凇稳定性最好,笳尸D和叩p,O的
稳定性最差。在不同的组织器官或发育时期样品
中,其稳定性也不同,脱F,6和C脚适合于组织
器官样品的表达分析,而AC挖/7和丁蚴在不同
发育时期的样品中表达稳定性最好。
涂礼莉等Ⅲ1分析了7个内参基因(18S
rRNA,胍幻棚,ⅧQ7,Ac£i以,C冲,叩QJ,叩Q2)
在棉花不同组织和不同发育时期的表达稳定性,发现在纤维发育的后期这些基因的表达都下调,而纤维发育后期特异表达基因AGP的表达则上
调。舰£o棚,咄Q和叩QJ在棉花纤维发育过程
中稳定性较好,而Ac眩和昭Q2稳定性最差。
Nicot等【l¨分析了7个传统内参基因(Acr,
APRr,18S
rRNA,E川仅,兀倡,C,rP,R沾傩DmoZ
p厂o£e流L2)在马铃薯生物胁迫(晚疫病)和逆境胁
迫(盐、干旱)条件下的表达稳定性,结果表明EFJd的稳定性最好。以不同稳定性的内参基因
作标准,目标基因丘啦D.2的表达水平变化很大,用稳定性差的内参基因作内参导致^啦D.2的表
达水平有较大的误差。
Iskandar等旧¨分析了4个内参基因(ACr,
rⅧ,翻JpJ|)片,25S
rRNA)在甘蔗不同组织器官和
不同品种中的表达稳定性,结果表明25S
rRNA
在不同样品间的表达水平最为一致,以P嬲在不
同组织器官中稳定性最好。
Bmnner等【81分析了lO个传统内参基因
0UBQll.IUA,18srRNA。AC您.UBQ7.EFlb。lUB。
Ac"J,剧丹6,C印)在杨树8个不同发育时期样
品中的表达稳定性,发现不同的内参基因的稳定性存在显著差异,18s
rRNA表达丰度最高,删
表达丰度最低,ⅧQJJ『和r泓在不同样品间变异
系数最小,表达最为稳定,而cyP稳定性最差。
综上,已有研究结果表明,不同植物和不同样品间的qRT—PcR内参基肉的稳定性存在显著差
异。因而,针对特定的实验条件和样品类型选择合适的内参基因进行标准化对于得到准确的基因
表达结果至关重要。
3
内参基因筛选的新策略
合适的内参基因的选择应取决于研究者的实
验条件,因此在一种实验条件下合适的内参基因并不一定适用另一种实验条件,或者不同植物间的内参基因_HJ.能也是不同的。因此在qRT—PCR中有必要对内参基因的表达稳定性进行评价并选出适合不同实验条件下使用的内参基因。Vande—sompele等悼2o开发.r专门用于分析内参基因稳定
性的程序geNo珊(http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/geno咖),不但可以分析内参基因在不
同样品中的表达稳定性,计算出内参基因表达稳定性的M值,肘值越大稳定性越差,反之,稳定性越好。还可计算引入1个新的内参基因后标准化
因子(no咖alizationfactor)的配对变异(pairwise
variation)y值,并可根据‰/‰+l比值来判定引入1个新的内参基因是否会对标准化因子产生显著影响,默认的y值为0.15,如果‰/‰+1大于O.15,则有必要引入第乃+1个基冈,反之,则不必
引入新的内参基因。在内参基因的稳定性分析中,可以利用geNo彻程序来确定准确定量所需要
的合适的内参基因数目。Andersen等旧纠也开发
了同类的程序No咖Finder。与geNo珊的计算方法不同,No咖Finder是基于方差分析对内参基因
的表达稳定性进行直接评价。在哺乳动物、酵母和细菌中,已有很多研究用该类软件去评价内参基因的稳定性并筛选合适的内参基因ⅢJ。但是在植物基因表达分析中,相关的研究还较少。
3.1
基于基因表达芯片数据发现新的内参基因大量基冈表达芯片数据为新的内参基因的选
择开辟了一条新的途径。通过对基因芯片数据的分析可以发现在不同生理条件或细胞类型中稳定表达的基因。Czechowski等【12l利用拟南芥全基因组AffymetrixATHl基因芯片数据,筛选r
22
个在不同发育时期、逆境胁迫(盐分、干旱、冷害)、生物胁迫、激素、营养缺乏(硫素、碳源、磷)和不同光照条件下稳定表达的基因,并用qRT—PcR比较了该22个新的内参基因与5个传统的
常用内参基因(AC眩,r班珩,朋一Ja,咖Q,0,GAP-
朋)在不同生长条件和逆境胁迫下的表达稳定
性。结果表明,多数新的内参基因的表达稳定性
均显著优于传统的内参基因,7删J(A确筘铊7D),
6期
胡瑞波等:植物实时荧光定量PcR内参基凶的选择
33
鲥^口(4砣晓舳9D)和PP2A(AtJg,刀加)可以作为新的内参基因,而在以前的基因表达分析中广
泛使用的4C跎是稳定性最差的。而且一些新的
内参基因(如艘弘)的表达丰度要明显低于传统
的内参基因,这对定量表达丰度较低的目标基因
时尤为有效。
Lihault等陋1通过分析大豆已发表的基因芯片数据,发现,多达200个稳定性较好的基因,并
对其中18个基因在不同发育时期、组织器官、逆
境胁迫(创伤、激素、锈病)130个样本进行了
qRT—PCR表达分析,结果表明多数基因的稳定性优于传统内参基因Acr和s班},2。但是,肽酶
5J6基因和呼吸爆发氧化酶基因的稳定性最差,
说明通过基因芯片数据筛选到的基因必须经过qRT—PcR实验的验证。筛选出了4个新的大豆
内参基因,分别为ABC转运凶子基因,F-box家族
基因,胰岛素降解酶基因和cDPK蛋白激酶基因。
但是,czechowski等¨副的研究结果并没有引起人们的足够重视,在过去几年中,很多研究者在
进行植物基囚表达分析时仍倾向于使用传统的持
家基因作内参,而没有在各自的实验条件下对这些内参基因的稳定性做任何验证分析。3.2基于EST数据库发现新的内参基因
Faccioli等Ⅲ1建立了一套从大麦EsT数据库筛选新的内参基因的方法。首先根据cDNA文库来源对大麦公共数据库中的EsT序列进行分类,
从中寻找在特定cDNA文库中出现频率高即表达
丰度较高的EsT序列,再结合网络搜索得到这些
基因在不同实验条件下(如逆境胁迫)的表达谱,筛选出了一批稳定性较好的候选内参基因,并通过qRT—PcR验证得到4个大麦的新的内参基因
分别为S一腺苷蛋氨酸脱羧酶基因、甜PD日、热激蛋白^印9D基因和一个未知功能基因
(TCl39056)。
Coker等12川统计分析了番茄EST数据库中
的127个基因在不同cDNA文库中的出现频率,
并据此来判断基因的表达稳定性,得出5个稳定性最好的基因:Dan—J蛋白基因,肿瘤蛋白基因,TUA。CYP瓢GAPDH。
4新的内参基因的表达稳定性评价
Remans等‘圳分析了拟南芥在铜(Cu)和镉
(Cd)胁迫条件下10个内参基因表达的稳定性,
这10个基因包括3个传统的常用持家基因和7个Czechowski等¨纠报道的新的内参候选基因,分析结果表明并非所有的新的内参基因的表达稳定性均优于传统内参基因,A巧GJ57,D(F-box蛋白基因),A呓晓韶9D(鲥ⅣD)和4巧6D829D(yLs8)可作为今后该类实验中的新的内参基因。而在以往研究中广泛使用的内参基因Ep,a和AC挖因稳定性太差不应再继续使用。但是新的内参基冈
孤wJ,溜C和PPR即∞£基因在铜(Cu)和镉
(Cd)胁迫条件的表达稳定性最差,反而不如传统内参基因。
Exp6sito—RodrIguez等Ⅲ1分析了4个新的候
选内参基因(卯丹.f,酗ⅣD,cAC和SGⅣ.叩拍。卿)
AP丁,D^H.,,M)在番茄27个不同发育时期的组
和7个传统持家基因(甜PDH,E盯a,船尸,彤瑚,
织器官中的表达稳定性,应用geNo瑚,No丌nFinder
和变异系数(coefficient
of
v撕ation)进行分析,结
果表明4个新的候选内参基因的稳定性均显著优于传统内参基因,明c和孤w,的稳定性最好,而
胛Jd和咒从的稳定性最差。
Reid等m1分析了14个内参基因(A丹7,
CYP,EFlo【,GAPDH,MDH,PP2A,sAND,TlP4l,
r以,71凇,叩C,叩Q.厨D,咖Q,D)在葡萄浆果发
育过程中的表达稳定性,其中包括3个新的内参
基因JP_P2A,sA彻和"刚J是拟南芥新的内参基
因的同源基因。对不同年份的2组共18个不同
浆果发育时期的样品分析结果表明,甜肋日,
Ac丁,E,,a和鲥ⅣD的总体稳定性较好。但是,把2组样品单独分析时内参基因的稳定性却并不一致,对第一组样品来说,内参基因的稳定性排序为TlP4l,AP47>GAPDH>MDH>sAND;对筛二
组样品来说则是AC彤EFJd>甜PDⅣ>叩Q一
群D>肘DH。在拟南芥中稳定最好的内参基因尸_P24和死wJ,在葡萄浆果发育过程中的稳定性反不如传统内参基因。由此可见,稳定好的内参基因并不是通用的,其选择需根据不同物种和不
同实验条件而定。
Gutie仃ez等¨纠分析了4个内参基因在杨树中的表达稳定性,其中2个为传统内参基因
咄p,D和18SrRNA,另外2个是拟南芥新的内参
基因A群驴铊70和A蛹哪3舳的同源基因。在8
个不同的发育时期样品中,杨树A群驴铊7D和
A确筘3380同源基因的稳定要高于叩QJD和18s
中国农业科技导报
1l卷
rRNA。但在不同形成层样品中,A群驴4270同源
基因是不存在的。内参基因的稳定性是相对的,不同的内参基因在不同生理条件的表达通常不是恒定不变的。在一种实验条件表现稳定的内参基因不一定适用于另一种实验条件(表1)。研究者
基因和咖Q,0的稳定性最好,A两筘338D同源基
因的稳定性较差。用不同的内参基因对杨树
A删陋Gm循Ⅳ刚(AⅣr)基因进行表达分析会得出
截然不同的结论。
5
必须结合各自的实验条件和样品类型来选择合适
的内参基因。
同一基因家族内不同成员问的表达稳定性也可能不同。泛素基因是一类持家基因,在细胞的
内参基因选择应注意的几个问题
已有研究结果表明,在所有组织器官、发育时
蛋白质降解中发挥重要作用,并广泛用作内参基
期、生理状态逆境条件下均稳定表达的理想内参
表l
Tablel
因。真核生物中,编码泛素蛋白的主要有多聚泛
已报道的植物qRT-PCR内参基因
“stofrepor【edreferencegenesforqRT—PCRinplants
6期胡瑞波等:植物实时荧光定量PcR内参基因的选择
35
Rubisco活化酶基因(R甜)
胁慨lD击啪Develop啪ntalstages,t汹e/orga啮,
d厶tⅡc,iyon
abiofic
短柄草
发育时期组织器官和逆境胁迫(干旱,盐,高温,低温)、激素
stress(dmught,
Rubiscoactivatingenzlm圯
encodinggene
堋C馏,AC刀
S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因[18]
salt,heat,
(&,棚C)
S.ad朗osvlme“1ionine
synt|let鹊eencodmggene
cold),hornlo眦
组织器官,发育时期,光周期,品种
DevelopmentaI
stages,tissue/orga璐,
删6,cy挖G酐)D,晒Q,D
[19]
photoperiodic
treatInents,cultivars
迫
憩蕉
Cotton
擞㈣一酬瞄一嗍剃咒.|l|
一慧妻羰慧黧m。以…。。
甥舢一
躺伉瞻出|!
Devel叩mentalstages,tissue/o嘴ms
~一一~~一茎一
Hist。neH1stone
3,瑚Q,唧
j,“dV,u廿叫
一~一一~一一
Ac砣,晒Q2肌1z'u6叫
[20]L删J
沣:a.末通过qRT—PCR验证;b.未用geNom或N0fTnFinder分析.
Note:a.denotenotVerified
byqRT—PCR;b.denote
not
an{Ilyzedby
geN锄盯N唧Finder舶f£ware.
定适用于另一种植物的所有样品类型。比如在拟
南芥中表达稳定的孤wJ和PP2A在葡萄浆果的
素(polyubiquitin)和泛素延伸蛋白(ubiquitinpmtein)两类基因。在拟南芥中研究发
现,泛素基因家族不同成员的表达稳定性存在明
extension
发育过程中的稳定性较差,”WJ在铜和镉胁迫
条件下的表达稳定最差,反倒不如传统的内参基
显差异,一些泛素结合酶基因(如A确眵796D)和E3泛素连接酶基因(如A£J975盯D)的稳定性较
因。同理,在杨树中不同形成层样品中sA肋的
稳定性也较差(表1)。
好,而一些多聚泛素基因(如咄QJO和凇QJ)稳
定性较差,而另一些多聚泛素基因(如叩钟和
咖∞)被证明在拟南芥、短柄草和水稻中稳定性
较好(表J)。肌动蛋白基因家族也被广泛用作内
选择两个以上的内参基因作参照有助于得到更为可靠的表达结果,这在大豆¨5l、马铃薯【291、葡萄口叫和杨树¨纠中已被证实。因此在追踪基因表达的微小变化时,单独使用一个内参基因往往不能得到准确的定量结果,必须几个内参基因结合使用。
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在Tubulin基因家族中,删的稳定性也普遍高
内参基因在不同物种间没有绝对的通用性,不同物种间同源的内参基因的稳定性也不同,在一种植物中稳定性表现非常好的内参基因也不一
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植物实时荧光定量PCR内参基因的选择
作者:作者单位:刊名:英文刊名:年,卷(期):被引用次数:
胡瑞波, 范成明, 傅永福, HU Rui-bo, FAN Cheng-ming, FU Yong-fu
中国农业科学院作物科学研究所,国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程,北京,100081
中国农业科技导报
JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE AND TECHNOLOGY2009,11(6)14次
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