实验四 同工酶分析
同工酶概述
酶是以蛋白质为主要成分的生物催化剂。在生物体内，有一些酶催化相同的反应，但其结构不同。它们对底物的浓度、pH 、温度等的最适要求不同，酶活力的调控反应及其所在的细胞分布也不一样。把催化相同反应而结构和理化性质不同的酶的分子类型称为同工酶（isozyme ）。
同工酶概念的提出，揭示了不同生物、同一生物不同器官和不同组织起源的酶可作用于同一底物，催化相同的反应，但在其他性质方面可以不尽相同。大量研究表明，同工酶在生物界是广泛存在的。在动植物和微生物体中、同一物种的不同个体、同一个体的不同器官、组织和细胞、同一细胞的不同部位、生长发育的不同阶段、不同的代谢条件下，都有不同的同工酶分布。现在已发现的酶中，有一半以上的酶已经发现有同工酶存在。可以进行同工酶分析的酶已有100多种。不同同工酶可以根据电泳迁移率予以区别和编号，以向阳极方向泳动最快的编为同工酶1。
从分子结构上看，同工酶的形成有以下学说或原因：
（一）亚单位结构学说 亚单位结构学说是研究同工酶理论并对作用机理阐述的较为
透彻的学说之一。该学说认为同工酶是由不同亚基按不同方式结合而成的。这个
学说有广泛的实验证据。如已经证明乳酸脱氢酶（LDH ）是由A 、B 两个亚基，
按不同比例结合成的四聚体，所以有5种同工酶：LDH 1（A 4）、LDH 2（A 3B 1）、
LDH 3（A 2B 2）、LDH 4（A 1B 3）、LDH 5（B 4）。
（二）不同基因编码 由不同的基因或等位基因编码会形成一级结构完全不同或有个
别氨基酸残基不同的多肽链。因而产生同工酶。由不同基因引起的同工酶存在于
同一物种的所有个体中，而由等位基因引起的同工酶以一定比率存在于同一族
中。
（三）单一亚单位聚合程度不同 有些同工酶的亚单位是完全相同的，如胆碱脂酶
（ChE ），但不同的酶分子中，亚基数目不同，这就形成分子量不同的5种同
工酶。经研究发现，目前发现的100多种同工酶，其组成比例不同，但以单体
（26%）、二聚体（52%）、四聚体（20%）较多，三聚体极少。
（四）多肽链的续发变化 多肽链合成后的续发变化与遗传因素无关。续发变化如果只
改变部分分子的非活性中心局部结构、组成或对部分分子影响程度不一，都回产
生不同的同工酶。常见的续发改变有脱氨基作用、甲酰或乙酰化作用、巯基氧化、磷酸基团相加、部分肽段脱落、多糖或辅酶的增减。
（五）酶空间构象的差异 组成、结构相同但空间构象不同的酶分子，其暴露在分子外
表的残基不同，会导致其理化性质上的差异，从而形成不同的同工酶。
从以上关于同工酶形成的来看，除了续发改变形成的次生同工酶外，可以说同工酶的差异都是由它们的基因决定的。因此同工酶作为基因表现的标记是可靠的。
同工酶多型性研究、原级和次级同工酶的鉴别、同工酶结构与功能关系的研究等，必须将不同的同工酶分子分离，区带电泳是分离同工酶的最佳方法之一，等电聚焦电泳可将一级结构相同而空间构象不同的同工酶分子分离开来，进而拓宽了该技术的使用范围。通过电泳分离出来的同工酶带，再采用酶组织化学技术染色形成酶谱即可进行分析鉴定。显色的主要方法有以下几种：
（一）呈色法 直接利用酶作用于底物产生有色产物。如以无色的磷酸酚酞作为底物，经酸性磷酸脂酶催化水解脱出酚酞，反应系统再改为碱性条件，酚酞即呈红色，直接标出同工酶带。同理，用兰色淀粉可测定淀粉同工酶谱，用联苯胺可测定过氧化物酶同工酶酶谱。
（二）化学反应显色法 采用不同的化学试剂使酶促反应的产物或尚未分解的底物显
色，借以指示出酶所在的位置和活力大小。如酯酶作用于萘酯，再用坚牢蓝和该酶反应产物作用显示出褐色，标出酶的位置。又如用化学染色剂NBT （硝基四唑氮蓝）照光后可还原成兰色的甲 ，而超氧化物歧化酶（SOD ）分布区域抑制了NBT 光还原作用，故在兰色的背景上呈现出清晰的SOD 谱带。前者称为阳性染色法，后者为阴性染色法。
（三）电子转移染色法 应用酶将电子转移给染料，通过染料变色显示出酶的区带。此法仅使用于脱氢酶、氧化酶同工酶的染色，如下图所示：
（四）荧光染色法 借助酶促反应使无荧光底物变成高荧光的产物或使有荧光的底物转变成荧光熄灭的产物，用荧光仪进行检测。其中又有阳性和阴性染料之分：
阳性荧光染料应用较广泛的是4-甲基伞形酮的衍生物。在水解酶催化过程中，在酸性或中性条件下得到的水解产物4-甲基伞形酮，用氨气熏蒸或用碱性缓冲液将反应系统调成碱性，则出现强烈荧光。该法灵敏度高，但易弥散，必须及时检测并记录酶谱。
阴性荧光染料是利用还原型NADH 和NADPH 在紫外线照射下能产生黄色荧光，而氧化态的NAD +和NADP +不产生荧光的原理，在氧化还原酶作用的底物内加入定量的还原态NADH 和NADPH ，在紫外灯照射下，有没存在区域NADH 或NADPH 变成氧化态（NAD +或NADP +），显示出暗带或弱荧光谱带。
（五）偶联酶显色法 有些酶促反应的底物或产物均不能显色，在反应体系中加入特异性的酶，即可使产物显色。如要分离鉴定己糖激酶同工酶，可偶联6-磷酸-葡萄糖脱氢酶催化反应，只要检测脱氢酶的电子转移反应，即可测出己糖激酶的存在。
上述显色后的同工酶谱放置时间过长易退色，必须用照相或光电扫描仪等手段适时记录。
免疫化学法是分离同工酶的另外一种方法，多基因位点与复等位基因决定的同工酶间，其氨基酸组成有较大的差异，故有不同的抗原性。利用分离、纯化的同工酶，通过免疫学方法制备出相应的抗血清，再加到同工酶混合样品之中，该抗体即可与相应的同工酶抗原形成免疫复合体沉淀，而将免疫性不同的同工酶留在样品液中，从而达到分离的目的。有时可以从沉淀中回收全部酶活力。如肌酸激酶同工酶，只要测出上清夜中残余酶活力，再从不加抗体样品中测出总活力，两者之差即为被沉淀同工酶的活力。
采用免疫学方法鉴定同工酶，由于抗原抗体反应特异性强，灵敏度高，可对同工酶进行定性、定量分析，但此法仅适用于抗原性差异比较大的同工酶的鉴定。
层析法可用于同工酶之间分子量比较接近，表面电荷差异较大的同工酶的分离。最后用一般酶活测定方法分别测定洗脱液中同工酶的活力。利用亲和层析鉴定同工酶，依据同工酶和相应的配基（如底物、辅酶、抑制剂、抗体等）亲和力不同的原理，将同工酶混合样品液缓缓流过固相配基层析柱，进行亲和吸附，然后再选用不同的缓冲液将吸附程度不同的同工酶顺次洗脱下来，从而达到分离的目的。层析法样品承载量大，操作条件温和、简单，更适于纯化或制备不同型的同工酶，是研究同工酶结构、功能的重要手段。
同工酶技术广泛应用于医学、生理学、分类学、病理学、遗传学及育种学中。同工酶技术在遗传育种中的应用主要体现在种质资源的研究、杂交优势的预测、体细胞融合杂种的鉴定等方面。（1）按照一个基因编码一个同工酶亚基的理论，可以从同工酶的表现型变异而直接推测其基因的变异水平。测定酶活力即可反应出DNA 结构差异，甚至是DNA 上一个碱基的微小差异。因此，同工酶分析技术是研究物种起源、演化及变异程度的最有价值的手段之一。种质资源在品种改良中的应用，关键在于对收集材料的鉴定研究的程度。对栽培植物和近源野生植物材料同工酶谱进行分离和鉴定，依据同工酶谱相同值大小，直观而科学地确定物种亲缘关系远近，演化过程中的变异程度。（2）在杂种优势的预测中，具有优势的杂种，常出现新的为双亲所不具备的同工酶谱。通过PAGE 并染色后会发现，有优势的杂种一代除出现双亲的酯酶谱型之外，还出现了新的“杂种酶带”。这种新酶谱在代谢中，具有比亲代
更高的活性。同工酶分析技术还可用于遗传基因定位、远缘杂种鉴定、雄性不育等领域。植物生长发育的不同阶段，不同组织、不同器官不仅酶分子表现出阶段特异性和组织特异性，同工酶也有同样的趋势。种子活力、组织与器官分化、生长及胚胎发育、环境因素和植物激素等均可额影响同工酶的变化，使得同工酶技术在生理学中也得到了广泛的应用。同工酶技术还广泛应用于病理诊断和临床治疗中。同工酶是生物体中的天然标记物，根据同工酶的变化，可以反映生物体的感病情况。如在正常人的血清中，乳酸脱氢酶的存在是LDH 2＞LDH 1＞LDH 3＞LDH 4＞LDH 5。若LDH 1失常即LDH 1＞LDH 2，为急性心肌梗塞、心肌损伤、心肌病及溶血性贫血的征兆；若LDH 5＞LDH 4，多见于肝脏损伤、皮肌炎、肌肉损伤等疾病。同工酶技术还可作为植物抗病性鉴定和筛选的生化指标。当病原微生物侵染生物体后，可引起组织内的代谢变化，进而可诱导产生许多新的同工酶，而且新产生的同工酶带活性高，病情越重同工酶数目越多，染色也就越浓。因此同工酶的活性和数量变化可作为生物抗病性鉴定的生化指标。
实验方法
同工酶的提取与一般蛋白质提取原则相同，电泳方法同聚丙烯酰胺凝胶电泳，不再陈述。以下介绍几种同工酶染色方法。
1. 酯酶同工酶
染色液配制：称取坚牢蓝RR 盐30毫克，溶于30毫升pH 值6.4磷酸缓冲溶液中，过滤后，加2毫升1%α-醋酸萘酯（少许丙酮溶解后，用80%酒精配）， 1毫升2%β-醋酸萘酯（同上）于滤液中。
染色方法：电泳完毕将脱去的凝胶立即转移至染色液中，37℃10—15分钟，即可呈现出棕红色的酯酶同工酶谱带，然后用水漂洗几次，置于7%醋酸中保存。酯酶的不同同工酶对醋酸-α萘酯和醋酸-β萘酯有不同的亲和力，而且这种亲和力是稳定的，即每次先与醋酸-α萘酯或醋酸-β萘酯作用的同工酶，每次都显褐色或红色，如果是醋酸-α萘酯和醋酸-β萘酯同时能作某些同工酶的底物，则该同工酶带总是染成紫褐色。
2. 过氧化物同工酶
染色液的配制：以下三种染色液中任选一种。
①0.1%联苯胺（在0.1mol/L,pH5.6醋酸缓冲液100ml 中含0.1g 联苯胺）100ml, 临用前加1.0ml3%过氧化氢。
②2%联苯胺（2g 联苯胺溶于18ml 冰醋酸，加蒸馏水至100ml ）20ml ，抗坏血酸70.4mg ，20ml 0.6%过氧化氢和60ml 水，临用前混合。
③联大茴香胺250mg 溶于140ml95%乙醇中，加水20ml ，临用前加过氧化氢4~5ml（13%）。
固定保存液：甲醇：冰醋酸：水=5：1：5
染色：
将配好的染色液倒入白瓷盘内（或试管内）的凝胶板（或柱）上，室温放置1~5分钟即显现出兰色区带。以无离子水漂洗数次，放在固定保存液中，区带渐渐变成棕色。
3. 乳酸脱氢酶同工酶
染色液的配制
临用前按20∶1的比例混合下列甲、乙二试剂：
试剂甲：于一棕色瓶中加入碘化硝基四唑蓝（INT ）20mg ，加蒸馏水8ml ，避光置50 ℃水浴中作用30min ，不时振摇助溶，溶解后加入CoI20mg ，乳酸锂0.2g ，乙氨基乙 甲基1、3丙二醇缓冲液2ml ，全部溶解后冰箱储存，至少可用两周。
试剂乙：取吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS ）配制1mg/ml溶液，置棕色瓶中保存。此溶液 不宜久置，显微红色即弃取。
甲、乙二液混合配制好后应立即使用，整个显色过程都应该避光。
染色方法：
约于电泳终止前10min ，将甲、乙两种溶液混合，待电泳结束后，将凝胶浸如染色液 中37℃保温染色。保温1hr 可显现蓝紫色的同工酶区带。
改进的染色方法
改进的染色方法的原理是：以PMS 为介体使乳酸脱氢酶催化的反应中产生的NADH 将K 4Fe （CN ）6，在利用K 4Fe （CN ）6与FeCl 3生成普鲁氏蓝的性质来实现染色的。
经典染色方法：NAD + 25mg 、，NBT15mg 、PMS1mg 、1mol/L乳酸钠（pH7.0）5ml 、0.1mol/LnaCl 2.5ml 、0.5mol/L Tris-HCl 缓冲液（pH7.1）7.5ml 和蒸馏水35ml ，新鲜配制。将电泳后的凝胶条浸入染色液中，于37℃保温30~60分钟，即可显示蓝紫色区带。 染色新法：染色液A ：仅将经典染色液的NBT15mg 换成61mmol/L的K 3Fe （CN ）62.1ml ，相应地将35ml 蒸馏水该成32.9ml 蒸馏水。染色液B ：7.5mmol/L的FeCl 3。将电泳后的凝胶条于染色液A 中浸泡20~30min后取出，放入染色液B 中浸泡，直至显出近于蓝绿色区带。