第五章 酶
第一节 概论
● 酶发展史简介：
● 我国公元前21世纪夏朝，酿酒，公元前12世纪周代，酱油（蛋白酶），饴糖（淀粉酶）。2000多年前，用曲治消化不良。 ● 西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。 ● 1857 巴斯德酒精发酵是酵母细胞活动的结果。
● 1897 Buchner兄弟证明了不含酵母的提取液也能使糖发酵。 ● 1913 米氏学说建立。
● 1926 Sumner年获得脲酶结晶。
● 1958 诱导契合学说建立。
●
● 1961 酶的变构模型建立。
● 1963 Hirs,Moore,Stein 测定了RNaseA 的氨基酸顺序。 ● 1965 Phillis测定了溶菌酶的三维结构。
● 80年代Cech, Altman 发现RNA 催化活性。
● 1986 Schultz,Lerner研制成抗体酶。
● 酶学研究的主要方向：
● 在酶的分子水平上揭示酶和生命活动的关系； ● 酶的应用研究。
一、 酶催化作用的特点
（一）酶与一般催化剂的比较
● 1、用量少、效率高、加速反应。
● 2、不改变化学反应平衡点。
● 3、可降低反应的活化能。
（二）酶作为生物催化剂的特点
● 1、酶易失活：
● 变性因素：碱、酸、有机溶剂、高温、压力等。、 ● 2、酶有很高的催化效率：生物体内的绝大多数反应是酶催化进行的。
● 通常用酶的转换数表示酶的催化效率。
● 酶的转换数：一定条件下，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，或每秒钟每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。
● 3、酶具有高度专一性：
● 酶对催化的反应和反应物有严格的选择性。和一般催化剂主要区别。
+ ● H 催化 淀粉 脂肪 蛋白质水解
● 淀粉酶 脂肪酶 蛋白酶 ● 糖苷键 酯键 肽键
● 4、酶活力的调节控制
（1）调节酶的浓度：
A 、诱导或抑制酶的合成
B、调节酶的降解
（2）通过激素调节酶的活性
激素通过与细胞膜或细胞内受体结合而引起一系列生物学效应，以此来调节酶活性，有些酶专一受激素调节。
● （3）反馈抑制调节酶的活性
● 许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成，催化此物质生成的第一步酶，往往被它的终端产物抑制，这种抑制叫反馈抑制。
● Thr B C D Ile(终产物）
● 苏氨酸脱氢酶
● （4）抑制剂和激活剂对酶活性的调节： ● 酶受大分子抑制剂和小分子物质抑制，从而影响酶活性，某些无机离子可对一些酶产生抑制对另一些酶产生激活，从而对酶起调节作用。
● （5）其他
● 还可通过别构调节，酶原激活，酶的可逆共价修饰和同工酶调节酶活性。
● 5、反应条件温和
● 体温、常压。
二、酶的化学本质及其组成
● （一）、酶的化学本质
● 1，大多数酶是蛋白质。
● 2、某些RNA 也是酶。
● （二）酶的化学组成
● 1、单纯蛋白质：活性仅决定它的蛋白质结构。如：脲酶、蛋白酶、淀粉酶等。
● 2、缀(结）合蛋白质：结合非蛋白组分才有活性。 ● 全酶=脱辅酶+辅因子。
● 酶反应的专一性取决于蛋白质结构。
● 辅助因子对电子、原子或某些化学基团起传递作用，决定反应类型。
酶的辅助因子：
● 辅酶：与蛋白质松弛结合，非共价，如B 族元素，用透析可以除去。
● 辅基：以共价键和酶蛋白牢固结合，透析不能去除。 ● 如细胞色素氧化酶与铁卟啉辅基结合牢固，辅基铁卟啉不易除去。
（三）单体酶、寡聚酶、多酶复合体 ● 1、单体酶：一般由一条多肽链。如：溶菌酶、胰蛋白酶。有的由多条肽链组成，链间以二硫键相连成一共价整体。
● 特点：只有三级结构。
● 2、寡聚酶：由两个或两个以上（多为偶数），由几个或几十个亚基
组成。
● 如磷酸甘油酸脱氢酶。
● 3、多酶复合体：是由几种酶彼此嵌合形成的复合体，它有利于一系列反应的连续进行。
● 如脂肪酸合成酶，丙酮酸脱氢酶系。
三 酶的分类及命名
● （一）、习惯命名法
● 原则:
● 1、根据底物：淀粉酶、蛋白酶。
● 有时加上酶的来源及其他特点：胃蛋白酶、胰蛋白酶。 ● 2、根据反应的性质及类型：水解酶、转氨酶。
● 3、两者结合：琥珀酸脱氢酶。
（二）国际系统命名法：
● 1、系统名称的组成：底物名称、构型类型、反应性质、编号。 ● 如写草酸氧化酶（习惯名称）的系统名称：两个底物草酸和氧用“：”隔开，反应性质为“氧化”
● 即草酸：氧氧化酶
● 谷丙转氨酶（习惯名称）的系统名称：
丙氨酸： α-酮戊二酸氨基转移酶
● 另外，如底物之一是水可将水略去。
● 乙酰辅酶A 水解酶（习惯名）写成乙酰辅酶A ：水解酶（系统名）
● 还要加一个编号。
（三）国际系统分类法及编号
● 国际酶学委员会根据反应的性质把酶分为六大类。用1、2、3、4、5、6类表示。根据底物中被作用的基团或键的特点，每一大类又可分为若干亚类，亚类又可分为亚亚类。 ● 每个酶的分类编号有4个数字组成，用. 隔开。
（四）六大类酶的特征和举例
● （1）氧化还原酶：氧化还原反应
● （2）转移酶：功能基团的转移
（3）水解酶：水解反应
● 淀粉酶、蛋白酶、核酸酶、脂酶
● （4）裂合酶：从底物上移去一个基团而形成双键的反应或其逆反应
● （5）异构酶：同分异构体相互转换
● （6）连接酶：两种分子合成一种分子
四、酶的专一性
● （一）酶的专一性：
● 酶对它所作用的底物有严格的选择性。
1、结构专一性
● （1）绝对专一性：只作用于一个底物对其它不起作用。 ● （2）相对专一性：不只作用一种底物，对其中一个基团要求严格。
2、立体异构专一性：
● （1）旋光异构专一性：
● L —氨基酸 + H2O + O2 α—酮酸 + NH3 + H2O 2 ● （2）几何异构专一性：只对几何异构体中的一种起作用. L —氨基酸氧化酶
（二）关于酶作用专一性假说：
● 1、锁与钥匙学说：专一性地契入到酶活性中心部位，固定底物楔入与互补的酶表面。
● 2、诱导契合学说：二者接近时，酶蛋白受底物分子的诱导其构象发生有利于底物结合的构象变化，酶与底物在此基础上互补契合进行反应。
五 核酶
● （一）核酶的概念：
● Cech1982年发现，嗜热四膜虫转录产物rRNA 前体）中413个核苷酸的内含子，可使两个外显子拼接起来变成成熟的rRNA 。 ● 催化反应无蛋白酶存在下发生，称为自我拼接。 ● Cech 将这种具有催化活性的RNA 称为核酶（Ribozyme ）。
（二）核酶的种类
● 1、催化分子内反应
● （1）自我剪接：剪切+连接。
● （2）自我剪切：某些病毒的RNA ，剪切是转录后加工方式之一，是基因复制和表达所必需的。
● 2、催化分子间反应：如RNase P、 RNase P 由蛋白质和 RNA 组成，其中起催化活性的是RNA ，蛋白质起维持构象的作用
（三）核酶研究的意义及应用前景 ● 1、抗病毒和抗肿瘤药物的设计
● 设计核酶基因构建特定表达载体，已在不同的细胞表达成功。结果表明核酶基因导入细胞或体内可以阻断基因表达，用作抗病毒感染、抗肿瘤的有效药物。核酶基因导入已获得美国食品与药品管理局批准。即将在临床上使用。我国已在体外成功地剪切了乙肝，甲肝病毒等核酸片段。
● 2、推动分子生物学研究
● 在研究了核酶催化氨酰酯的水解可逆反应和转移反应指出，核酶很可能具有氨酰tRNA 合成酶和肽基转移酶活性，这些反应均与蛋白质生物合成有关，表明RNA 在翻译过程和核糖体功
能中起着非常重要的作用。
● 问题的突破将是对分子生物学的贡献。
● 3、生物进化的研究
● 具有催化功能RNA 的重大发现，表明RNA 是一种即能携带遗传信息又具有生物催化功能的生物分子。因此很可能RNA 早于蛋白质和DNA ，是生命起源中首先出现的生物大分子，而一些有酶活性的内含子可能是生物进化过程中残存的分子“化石”。酶活性RNA 的发现，提出了生物大分子和生命起源的新概念，无疑将促进对生物进化和生命起源的研究。
六、抗体酶
● 具有催化作用的抗体称为抗体酶，本质是免疫球蛋白。 ● 一、概念的提出：
● 比较以下两个概念：
● 1、酶：与另一种分子专一性结合具有催化活性。 ● 2、抗体：免疫系统产生的依靠专一性的结合部位与抗原结合。
● 催化的实质：酶与底物专一性结合并形成过渡态。 ● 设想：用过渡态类似物免疫动物可能产生有催化作用的抗体。
● 3、抗体酶产生的过程：
● 如：酯酶水解过程
● 酶活性中心有关基团亲核攻击使底物形成中间过渡状态。 ● 用中间过渡状态模拟类似物免疫动物，得到专一性抗体，即可以水解酯键。
● 4、抗体酶研究的意义：
● 1）为过渡态理论提供有利的实验证据。
● 2）医学上，通过这种方法可以创建新的切割病毒分子和肿瘤分子抗体酶
● 3）制药工业，解决对映体的拆分问题
● 4）用于生物传感器的制造。
第二节、酶的作用机制
● 一、酶的活性部位
● （一）酶的活性部位的特点：
● 1、概念：三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活性部位。
● 活性部位有两个功能部位：
● 催化部位：决定催化能力。
● 结合部位：决定专一性。
● 对需要辅酶的酶，辅酶分子或辅酶分子上一部分结构往往也是活性中心的组成部分。
2、特点
● （1）活性部位在酶分子的总体只占相当小的部分（1-2%）。 ● （2）酶的活性中心是三维实体。
● （3）酶的活性中心并不是与底物互补的。 ● （4）酶的活性部位是位于酶分子表面的裂隙内的。 ● （5）底物通过次级键结合到酶上。
● （6）酶活性部位具有柔性。
（二）研究酶活性部位的方法
● 1、酶分子侧链基团的化学修饰：
● （1）非特异性共价修饰：某些化学试剂与酶 AA残基侧链基团发生氧化或还原等修饰反应，使基团结构和性质发生改变。 ● 鉴别标准：活力丧失程度与修饰剂浓度有正比关系；底物或可逆抑制剂与活性部位结合的可保护共价修饰剂的抑制作用。
● （3）亲和标记法：
● 修饰剂的特点：专一性引入酶活性部位, 与底物结构相似的修饰剂与活性部位某一基团共价结合。
● 酶必须空间结构完整，活性部位才能与亲和试剂结合，变性的酶或酶原不能结合。
（三）酶催化反应的独特性质
● 1、酶催化反应分两类：
● A 、电子转移。
● B：电子和质子两者或其它基团转移。
● 2、酶催化部位氨基酸：His,Ser,Cys,Lys,Glu,Asp 侧链功能基团。
● 3、酶催化最适PH 范围小。
● 4、与底物比 ，酶分子很大，活性部位比底物稍大，一个巨大的酶结构对稳定活性中心是必要的。
● 5、活性中心基团多，协同催化。
三、影响酶催化效率的有关因素
● （一）底物和酶的邻近效应和定向效应
● 邻近效应：反应速度与反应物浓度成正比。酶促反应中酶和底物充分靠近。酶的催化基团与底物结合于同一分子中而使有效浓度得以提高，使反应速率加快。
● 定向效应：，酶的催化基团与底物反应基团之间的正确取位产生的效应。
（二）、底物的形变和诱导契合
● 酶构象变化同时，底物分子也发生变形，形成酶与底物复合物，进一步转换成过渡态。
（三）、酸碱催化
● 酶行广义的酸碱催化，即质子供体与受体间催化。每一分子上氨基酸侧联基团可以为反应提供质子或接受质子，从而加速反应。
● 影响酸碱催化的反应速率的因素有两个： （1）酸或碱的强度；
（2）质子传递速率；
● 在中性条件下咪唑基，既可以作为质子供体，又可以作为质子受体。
● 咪唑基是催化反应最有效、最活泼的一个催化功能基团。
（四）、共价催化：
● 又称亲核催化或亲电子催化。
● 底物与酶形成一个反应活性很高的共价中间物，降低活化能，使反应加速。
（五）金属离子催化
● 1/3的酶催化活性需要金属离子。
● 金属离子起稳定中间物作用，避免逆反应。
（六）多元催化和协同效应
● 在酶催化反应中。几个基元催化反应配合在一起共同作用。如胰凝乳蛋白酶（ Ser195,His 57,Asp 102 ）电荷中继网、催化肽链水解、酸碱催化、共价催化共同作用，使酶反应加速。
（七）活性部位的微环境的影响
● 酶分子表面有一裂缝，活性部位位于疏水坏境的裂缝中。底物分子敏感键和酶催化基团间有很大作用力。两个带电基团静电力比在极性环境中显著提高，疏水微环境大大有利于酶的催化作用。
● 小结：以上讨论酶高效催化七因素，不是同时在一个酶中起作用，也不是一种因素在所有酶中起作用。更可能的情况是对不同的酶，起作用的因素不同，各有其特点，可能分别受一种或几种因素作用。
四、催化反应机制实例
● （一）溶菌酶
● 1、溶菌酶一级结构有129个氨基酸残基，四个二硫键、三级结构不紧密。
● 极性基团分布于表面，非极性基团在内部。
● 有一个狭长的凹穴，谷氨酸、天冬氨酸位于活性中心 。
● 底物：N-乙酰氨基葡萄糖（NAG) ，N-乙酰氨基葡萄糖乳酸(NAM)的共聚物。
● NAG 与NAM 通过β—1，4糖苷键交替排列，六个单糖位于溶菌酶凹穴中。
2、催化机制
● 酶与底物结合变形： Glu提供质子，糖苷键断裂成为正碳离子，Asp 52-COO-稳定碳正离子. 。
● Asp52与Glu 35的协同作用，表现为酸碱催化。
● 经测定发现，酶与底物构象都发生变化，
● 底物由椅式到船式。
35
(二）丝氨酸蛋白酶
● 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、凝血酶、纤溶酶。
● 1、催化部位：丝氨酸附近AA 酸顺序完全一样。
弹性蛋白酶裂解小的中性氨基酸残基肽链。
这三种酶分子量约25000，且具有相似的顺序和三级结构，紧密椭球体，专一性差别原因与结构有关。
第三节酶促反应的动力学
● 各种因素对酶促反应速度的影响
● 一、底物浓度对酶反应速度的影响——米氏学说
1、米氏公式的推导（略）
1913年M i c h a e l i s 和M e n t e n 提出酶学基本原理的数学表达式——米氏方程如下：
2、动力学参数意义
● （1）、米氏常数的意义：
● A 、Km 是酶的特征常数，只与酶本身性质有关，而与酶浓度无关。
● C 、 Km值最小时为最适底物， Km值可以判断酶的专一性和天然底物，1/Km值可近似的表示酶对底物亲和力。 ● D 、Km 值实际用途：若已知某个酶的Km ，就可以算出在某一底物浓度时，其反应速度相当于Vmax 的百分率
● E 、Km 值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径。 ● 当一系列不同的酶催化代谢过程的连锁反应时，确定各种酶的Km 及相关底物浓度，可有助于寻找限速步骤。
● A B C D
● Km 10
● mol/L -2 10 10
-4-4-4-3-4● [S] 10 10 10
● 可推知限速步骤A B
● (2)Vmax
● 对特定的底物也是一个特征常数， pH、温度和离子强度等也影响Vmax 。
3、米氏常数的求法
● (1)、Lineweaver - Back双倒数作图法
(2) 、 E a d i e -H o f s t e e 作图法
作图法
(3）E i s e n t h a l 和C o r n i s h -B o w d e n 直线作图法
二、酶的抑制作用
● 抑制作用：非变性，有选择性。
● 失活作用：变性，无选择性。
● (一）抑制作用类型：
● 1、不可逆抑制作用
● 与酶蛋白上基团共价结合，使之失活，不能用超过滤、透析的方法去除。
● 分为专一性抑制作用，非专一性抑制作用。
2、可逆抑制作用：
● 抑制剂与酶结合是可逆的，可以用透析除去。 ● （1）竞争性抑制作用：抑制剂与底物竞争，从而阻止底物与酶的结合。
● 如丙二酸和戊二酸能与琥珀酸（丁二酸）脱氢酶结合，但不能催化脱氢。
（2）非竞争性抑制：
酶抑制剂可以同时与底物及抑制剂结合，两者没有竞争作用。 E I +S E I S E S +I E I S
（3）反竞争性抑制
● 酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。 ● ES+I ESI ESI P
● 反竞争抑制常见于多底物反应中。
（三）可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别 ● 1、透析、超滤、凝胶过滤法是否除去抑制剂区别可逆抑制和不可逆抑制。
● 2、动力学方法：加入一定量的抑制剂，测不同浓度的反应速
度，以初速度对酶浓度作图，与无抑制剂时对比，根据他们之间的差别判断可逆、不可逆抑制。
（四）可逆抑制的动力学常数
● 1、竞争性抑制： Vmax不变，Km 变大，表示酶对底物的亲和力减小。
● 2、非竞争性抑制：Km 不变，Vmax 变小
● 3、反竞争性抑制，Vmax ，Km 均变小
(五) 一些重要的抑制剂
● 1、不可逆抑制剂:
● （1）非专一性不可逆抑制剂
● A 、有机磷化合物：
● a 、抑制某些蛋白酶及脂酶活力，与酶分子活性部位的Ser-OH 共价结合，使酶失活。
● b 、强烈抑制乙酰胆碱脂酶活力，使乙酰胆碱不能分解为乙酸和胆碱。使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过度兴奋状态，引起神经中毒症状——神经毒剂。
● B 、有机汞、砷化合物：抑制含-SH 的酶。
● C 、氰化物：与酶中金属离子形成较为稳定的络合物，如含铁卟啉酶（细胞色素氧化酶）中的铁离子结合，使酶失活而阻止细胞呼吸。
D 、重金属：Ag Cu Hg Pb Fe
● 高浓度时，能使酶蛋白变性失活。低浓度时对某些酶活性产生抑制作用。
● E 、烷化剂：含活泼卤素原子，如碘乙酸，2，4二硝基氟苯，被作用基团有巯基，氨基，羧基，咪唑基，硫醚基。 ESH + ICH2COOH ESCH2COOH + HI
● +2+2+2+ 3+
● （2）、专一性不可逆抑制剂
● ①亲和标记试剂：
● 具有底物类似结构与相应酶结合，还带有一活泼基团能与酶分子的必需基团反应，抑制酶的活性。
● 因抑制是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记，称亲和标记试剂。
● ②自杀性底物:
● 此类抑制剂具有与天然底物类似的结构，而且本身与酶结合可以发生变化，变化使潜伏活性基团暴露，作用于酶活性部位必须基团或辅基，使酶不可逆失活。
2、可逆抑制剂
● 竞争性抑制剂为最多
● （1）磺胺药
● 磺胺药是对氨基苯磺酰胺，是对氨基苯甲酸 的竞争性抑制剂。对氨基苯甲酸 是叶酸结构的一部分，叶酸和二氢叶酸是核酸的嘌呤核苷酸合成中的重要辅酶——四氢叶酸的前身，缺少四氢叶酸，细菌生长繁殖受影响。
● 人体能直接利用食物中的叶酸，某些细菌不能直接利用外源叶酸，只能在二氢叶酸合成酶的作用下，利用对氨基苯甲酸为原料合成二氢叶酸，而磺胺药物可与对氨基苯甲酸相互竞争，抑制二氢叶酸的合成酶的活性，影响二氢叶酸合成，导致细菌生长繁殖受抑制，从而达到治病的效果。
● 抗癌药物阿拉伯糖苷也是利用这一原理设计出来的 。
三、温度对酶反应速度的影响
● 是钟型曲线，恒温动物35~40 。C ； 植物40~50 ；某些高。C 温酶70
● 温度的影响是两方面的：
● 1、温度升高反应速度加快；
● 2、温度升高酶变性，变性。
。C
四、p H 对酶反应速度的影响
● 最适pH 非特征常数，受许多因素影响，
● 随着底物浓度、缓冲液不同而不同。
p H 值影响酶活力的原因
● 1、过酸过碱影响酶蛋白的构象，使酶变性失活。 ● 2、pH 变化不剧烈时，酶虽未变性，但活力受影响。pH 影响酶活性基团和底物的解离状态，也可能影响到中间产物的形成，不利于催化生成产物。
● 3、pH 影响维持酶分子空间结构有关基团解离，影响酶活性构象。
五、激活剂对酶反应速度的影响 ● 激活剂：凡能提高酶活性的物质。大部分为无机离子，或简单的有机化合物。
++2+2+2+2+。 ● 金属离子：K Na Ca Mg Zn Fe
----3-● 阴离子：Cl Br I CN PO4 。
● 镁离子是多数激酶，合成酶的激活剂。氯离子是唾液淀粉酶的激活剂。
● 1、激活剂的选择性：对一种酶可能是激活，对另一种酶可能是抑制的彼此间拮抗作用。
++2+2+● K Na Ca Mg
● 2、激活剂的浓度效应：浓度升高可由激活转变为抑制。
● 3、小分子有机化合物可作为酶的激活剂
● （1）某些还原剂：半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、氰化物等， ● （2）螯合剂：EDTA ，去除重金属对酶的抑制。
第四节 酶活性的调节控制
● 一、别构调控
● 1、别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆的非共价结合后发生构象的变化，进而改变酶活性状态。 ● 别构酶：具有这种调节作用的酶称别构酶，凡使酶发生别构作用的物质称效应物。
● 效应物：通常是小分子代谢物或辅因子。（别构剂） （调节物 ）
● 正效应物（别构激活剂）：活性增强。
● 负效应物（别构抑制剂）：活性减弱。，
● 别构酶是代谢途径的调节酶。
● 别构调节普遍存在于生物界。许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控制代谢途径之间的平衡。
● 同促效应：底物对别构酶的调节作用。
● 异促效应：非底物对别构酶的调节作用。
● 2、别构酶的结构特点：
● （1）别构酶一般是寡聚酶，多个亚基，亚基间非共价结合。 ● （2）除活性中心外还有别构中心。
● 3、别构酶的性质：
● （1）调节部位与活性部位通过构象变化产生协同效应。 ● （2）动力学：不符合米氏方程。
（2）序变模型：
● A 、只有当与别构酶结合后才诱导T 态向 R态的转变。 ● B 、别构酶的构象以序变方式进行的。
● C 、亚基之间的相互作用可以是正协同也可以是负协同。
二、酶原激活
● 体内合成的不具有活性的蛋白质称为前体，经专一性水解后可变成活性蛋白质，如活性蛋白质是酶，这个前体称酶原。该活化过程是生物体的一种调控机制。这种调控的特点由无
活性状态转变为活性状态，是不可逆的。
● 1、消化道系统蛋白酶原的激活
● 胰凝乳蛋白酶，弹性蛋白酶和羧肽酶以酶原形式在胰脏中产生。如在胰脏中以活化形式存在。胰脏会被水解而破坏，因此胰脏有保护措施，防止它们提早活化，胰脏中酶原激活都要通过胰蛋白酶作用。胰蛋白酶关键，胰脏中存在较丰富的胰蛋白酶抑制剂，抑制胰蛋白酶活性，酶原在胰脏中提早活化是胰腺炎特征，严重可以致命，胰蛋白酶的抑制剂可治疗胰腺炎。
● 2）胃蛋白酶原的激活：
● 胃蛋白酶原由胃壁细胞分泌，392AA 组成，在胃酸氢离子作用下，低于pH5时，酶原自动激活，从氨基端失去44AA 残基---碱性前体片段后，转变为高度酸性，有活性的胃蛋白酶。胃蛋白酶在胃中消化蛋白质，最适pH 值为2。
● 3）胰蛋白酶原的激活：
2+● 由胰腺细胞分泌，进入小肠后，在Ca 作用下被肠激酶激活，
从氨基端水解下酸性6肽，构象变化成活性形式，胰蛋白酶是胰脏所有蛋白酶的共同激活剂。
三、可逆的共价修饰
● 这种调控通过共价调节酶进行。
● 共价调节酶通过其它酶对多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，可以使其在活性与非活性之间转变，从而调节酶的活性。
● 目前已有5~6种类型可逆修饰酶：磷酸化、腺苷酰化、尿苷酰化、ADP —核糖基化、甲基化。
● eg:蛋白质的磷酸化
● 蛋白质的磷酸化与脱磷酸化是生物体内的一个普遍的调控方式。
● 蛋白质 ________ 蛋白质—nPi
● 正逆反应的酶不同
● 底物蛋白质磷酸化AA 残基有两类：
● （1）Thr 、Ser 、 Tyr 、Asp 、Glu ……P —O 键连接。 ● （2）Lys 、Arg 、His ……P —N 键连接。
● 主要磷酸化Ser 、Thy 、个别为Tyr ，被磷酸化的残基可以是一个、两个或多个。
四、同工酶
● 1、概念：这类酶有两个或两个以上的亚基聚合而成，他们催化同一反应，但分子结构、理化性质及反应机理不同。 ● 同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织中，也可存在于同一组织和细胞中。
● 2、举例：乳酸脱氢酶。
● 乳酸 丙酮酶
● 五种同工酶，全酶四个亚基，五种酶在不同组织，器官中含量不同。临床医学常利用这些同工酶在血清中相对含量的改变作为某脏器病变，鉴别诊断的依据。
● 3、同工酶的理论和实践意义
● ①调控代谢过程：微生物中某些同工酶在分支代谢调节中起重要作用。
● ②遗传，发育等。
● 思考题：酶活性的调节方式有哪些？
第五节、酶的活力测定和分离纯化
● 一、酶活力的测定
● 酶活力指酶催化一定化学反应的能力。
● 1、酶活力与酶反应速度：
● 测定酶活力即测定酶反应速度, 即测定单位时间、单位体积底物减少量或产物增加量来表示。
● 2、酶活力单位（active unit)：
● 酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位（U).
● 酶单位（U) 的定义：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物的酶量。
● 国际单位（IU ）：最适条件下，在1分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需酶量。即1IU=1μmol/min
● Kat 单位：最适条件下，每秒钟催化1微摩尔底物转化为产物所需酶量定义为1Kat （1Kat=1mols ）。
6● 换算：1Kat=60*10IU
1IU=1/60μKat=16.7nKat
● 3、酶的比活力（specific activity):每毫克蛋白质所含酶的活力单位数量。
● 比活力=活力U/mg蛋白=总活力/总蛋白mg 数。 -1
● 4、酶活力的测定方法：
● 测定酶活力就是测定产物的增加或底物的减少。主要根据产物或底物的物理化学性质来决定具体酶催化反应的测定方法。
● （1）分光光度法：利用底物或产物在紫外或可见光部分的光吸收不同。选择一适当波长，测定反应中反应进行的情况。 ● 优点：简便，节省时间和样品。
● 酶活力测定中最重要的方法。
● 几乎所有的氧化还原酶都可以用此法。如:脱氢酶的辅酶NADPH 在340nm 有吸收高峰，而氧化型则无，因此对这类酶活力测定可以测340nm 处光吸收变化。
● 2、荧光法：
● 根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定。 ● 优点：灵敏度高。
● 缺点：易受其它物质干扰。
● 3、电化学分析法：
● PH 测定法，用PH 计测定PH 变化测定酶反应速率。 ● 4、化学分析法：
● 测某一时刻t 底物或产物浓度。
● 还有旋光法、量气法、量热法、同位素测定等方法。
● 二、酶的分离提纯
● 两方面目的：研究酶的性质、作用、反应动力学、结构和功
能的关系、阐明代谢途径；生化试剂、药物。
● 酶绝大多数是蛋白质，酶的分离纯化方法也就是蛋白质提纯的方法。
● 酶提纯主要包括：1、酶制剂浓缩；
● 2、杂蛋白和杂质去除。
分离纯化方法衡量指标：
1、总活力回收
2、比活力提高的倍数
● （1）选材：含有所需酶的材料。
● （2）破碎细胞：渗透压、捣碎、超声波
● （3）抽提：低温下，以水或低盐缓冲液从组织匀浆中抽提酶，得粗酶制剂。
● （4）分离及纯化：低温0---5C
● （5）结晶：
● （6）保存：低温。
第六节酶工程简介
● 1、酶工程的主要研究内容有：
● 自然酶的进一步开发和大规模应用，通过化学的和遗传学的修饰，进一步探求酶的结构与功能的关系;
● 2、大力改善工业、农业、医学和科研用酶制剂的热稳定性、对氧的稳定性、对重金属的稳定性、对pH 的稳定性，提高催化效率; 改变反应的最适pH 值等等。
● 3、研究设计制造优质的超自然酶; 研制模拟酶催化功能的催化剂。目的是获得高活力、高稳定性及高应用潜力的酶 ● 从解决问题的手段来看，可以概括为化学和生物学两个大类型，分别称为化学酶工程和生物酶工程，
一、化学酶工程
● 主要是由酶学与化学工程技术相互参透和结合形成的。 ● 1、天然酶的开发应用
● 目前己经发现和鉴定的酶，约有3000多种，小批量生产的商品酶约有800多种，大规模生产和应用的酶仅约20~30种。
● 自然酶的来源是微生物、动物和植物，其中以微生物为主，动植物来源的酶次之，工业酶制剂更是以微生物来源为主。 ● 目前遗传工程中研究过的各种限制性核酸内切酶、连接酶等已超过1000种，绝大多数都来源 于原核细胞。
● 2、化学修饰酶
● 在酶工程中，酶的化学修饰，其目的主要在于加强酶的稳定性;
● 对于医学上的治疗用酶，还有一个目的，是降低或消除酶分子的免疫原性。
● 在基础酶学研究中，化学修饰法是探讨酶活性中心性质的重要手段。
● 从应用角度考虑，常用下述三种途径对酶蛋白进行化学修饰，以改善其性能。
● （1）化学修饰酶的功能基
● 酶分子中的可离解基团如氨基、羧基; 羟基、琉基、咪唑基等，都是可能修饰的基团。
● 为了改善酶的稳定性，通过脱氨基作用，消除酶分子表面氨基; 通过酰化反应改变侧链羟基性质。
● 这些修饰反应可稳定酶分子有利的催化活性现象; 提高抗变性的能力，
● 例如：抗白血病药物天冬酰胺酶，经修饰后可使其在血浆中的稳定性提高数倍，因而延长了疗效．
● （2）交联反应
● 某些双功能试剂如二异硫氰酸酯(S=C=N一N=C=S)、戊二醛(OHC-CH2一CH2一CH2-CHO) 其分子两端的功能基团(如醛基) ，可与酶分子中或分子间肽链的二个游离氨基分别发生反应，使它们交联起来。
● 例如：交联后的人α-半乳糖苷酶A ，其热稳定性和抗蛋白酶的性能都有明显增加，但酶活性不丧失
● （3）大分子修饰作用
● 酶与某些蛋白质、多糖、聚乙二醇(PEG)等高分子化合物结合后，可以增加酶的稳定性。
● 例如α-淀粉酶在65℃时的半寿期为2.5分钟。当其与葡聚糖结合后，半寿期延长至.63分钟。
● 白血病治疗素(Leukenon)对急性淋巴细胞白血病有良好治疗作用，此药就是经聚乙二醇改造过的酶。
● 目前美国Enzon 公司已用PEG 技术改善了30多种酶，预料将有一些药用改良酶应市。
● 3、固定化酶
● 1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用固定化酶(immobilized enzyme)这一名称。
● 固定化酶：是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。
● 酶的固定化方法，多种多样，但主要有四大类:吸附法、载体偶联法、交取法和包理法。
● 在吸附法中报道了电吸附法;
● 在载体偶取法中，发展了多种无机多孔材料。
● 交联法的双功能试剂，也有一些新的试剂被采用; ● 微胶聚法也是包埋法的一种，也在材料和方法上有所进展。
4、人工模拟酶
● 所谓人工酶(artificial enzyme) 是指模拟酶的催化功能，用化学方法合成的一类有机催化剂。
● 这类催化剂的研制，近十年来吸引了许多化学家、化学工程师和生化工程师，现已用年合成法和全合成法制成一些人工酶。
● 例如E.T.Kaiser 小组1984成功地合成了一种" 黄素木瓜蛋白酶(flavo一papain) ，他们是用半合成法完成的。先从木瓜汁中分离出蛋白酶，然后用8-溴乙酰黄素与之结合而成。 ●
● 全合成酶不是蛋白质类大分子; 而一些小分子有机物，其中环糊精(cyclodextrin简称CD) 是受到人们青睐模型分子。 ● 将环糊精接上咪唑基，所得双咪唑基β-CD, 具有核糖核酸酶A
的催化性质，甚至反应的最适pH 值都几乎与RnaseA 相同。
● 根据胰凝乳蛋白酶活性部位由Ser 、His 和Asp 组成的特性，设计合成的接上咪唑基、苯甲酸基和羟基的β-CD ，也表现了该酶催化的某些特征 19557l02
二、生物酶工程
● 生物酶工程又称高级酶工程，它是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。
● 生物酶工程的诞生充分体现了基因工程对酶学的巨大影响。
● 生物酶工程主要包括三个方面:
● （1）用基因工程技术大量生产酶(克隆酶);
● (2)修饰酶基因，产生遗传修饰酶(突变酶)
● (3)设计新酶基因，合成自然界不曾有的新酶。