乳酸杆菌及嗜热链球菌脉冲场凝胶电泳分子分型方法建立及应用
董银苹
崔生辉
于红霞
李凤琴
［摘要］ 目的 建立乳酸杆菌及嗜热链球菌的ＰＦＧＥ分子分型方法，并对北京市售酸奶中分离的乳酸杆菌及嗜热链球菌进行分子分型。方法 选取ＡｐａⅠ、ＮｏｔⅠ、ｓｆｉⅠ、ＸｂａⅠ和ＳｍａⅠ共５种ＰＦＧＥ分析中常用的限制性内切酶，对从北京市售酸奶中分离到的５２株乳酸杆菌、嗜热链球菌以及相应的标准菌株进行酶切，优化ＰＦＧＥ限制性内切酶种类及电泳条件，并用优化出的实验条件对菌株进行分子分型，同时进行聚类分析，与生化鉴定及１６ｓ ｒＲＮＡ基因鉴定结果进行对比分析。结果 限制性内切酶ＮｏｔⅠ对保加利亚乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌和德氏乳酸杆菌的酶切效果较好，而限制性内切酶Ａｐａ Ⅰ对嗜热链球菌、嗜酸乳酸杆菌及干酪乳酸杆菌的酶切效果较好。２４株保加利亚乳酸杆菌被分为８个ＰＦＧＥ型，１５株嗜热链球菌被分为８个ＰＦＧＥ型，７株嗜酸乳酸杆菌被分为３个ＰＦＧＥ型，２株德氏乳酸杆菌分属于２个不同的ＰＦＧＥ型。结论 建立的ＰＦＧＥ方法分析结果与生化鉴定及１６ｓ ｒＲＮＡ基因鉴定结果高度符合，所建方法适用于乳酸杆菌及嗜热链球菌的分子分型。
乳酸杆菌属；链球菌，嗜热；细菌分型技术；电泳，凝胶，脉冲场
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ １０００５０， Ｃｈｉｎａ
Ｉ ＤＯＮＧ Ｙｉｎ－ｐｉｎｇ ＣＵＩ Ｓｈｅｎｇ－ｈｕｉ ＹＵ Ｈｏｎｇ－ｘｉａ Ｌ
Ｆｅｎｇ－ｑｉｎ Ｉｎｓｔｈｕｔｅ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ
［ Ａｂｓｔｒａｃｔ ］ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｐｕｌｓｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＰＦＧＥ） ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｄ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ （Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） ａｎｄ ｔｏ ａｐｐｌｙ ｉｔ ｉｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｙｏｇｈｏｕｒｔ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂｅｉｊｉｎｇ ｓｕｐｅｒｍａｒｋｅｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｍｏｓｔ ｕｓｅｆｕｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＡｐａ Ⅰ ，Ｎｏｔ ］ ，Ｓｆｉ Ⅰ ，Ｘｂａ Ⅰ ａｎｄ Ｓｍａ Ⅰ ｗｅｒｅ ｃｈｏｓｅｎ ｔｏ ｃｕｔ ＤＮＡ ｏｆ ５２ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ， Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｔｒａｉｎｓ． Ｔｈｅ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＰＦＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｄ Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｓｏｌａｔｅｓ． Ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＰＦＧＥ ｄａｔａ ｗａｓ
ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ． Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＦＧＥ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ １６ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｎｏｔ Ⅰ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ Ｌ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ，Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ ａｎｄ Ｌ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ． Ｗｈｉｌｅ Ａｐａ Ⅰ ｗａｓ ａｎ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｏｒ Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ，Ｌ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｄ Ｌ． ｃａｓｅｉ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ２４ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｌ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ ａｎｄ １５ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ
Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｗｅｒｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ ８ ｔｙｐｅｓ ｂｙ ＰＦＧＥ ｍｅｔｈｏｄ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｗｈｉｌｅ ７ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｌ． ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ
ｗｅｒｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ ３ ｔｙｐｅｓ ａｎｄ ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｌ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｗｅｒｅ ｇｒｏｕｐｅｄ ｉｎｔｏ ２ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＰＦＧＥ ｔｙｐｅｓ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＦＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｒｅ ｉｎ ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ １６ｓ ｒＲＮＡ ＰＣＲ ａｎｄ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ＰＦＧＥ ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｂｏｔｈ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｄ Ｓ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ．
［ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ； Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ； Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｙｐｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，
ｇｅｌ ，ｐｕｌｓｅｄ－ｆｉｅｌｄ
１０． ３７６０／ｃｍａ． ｊ． ｉｓｓｎ． ０２５３－９６２４．２０１１．１２． ００８
“十一五”国家科技支撑计划（ ２００９ＢＡＤＢ９ Ｂ００）
作者单位：１０００５０北京，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所（董银苹、李凤琴）；中国食品药品鉴定研究院食品化妆品处
（崔生辉）；山东大学公共卫生学院营养教研室（于红霞）
结 果
讨 论
＠＠［１］吴蜀豫，冉陆．ＦＡＯ／ＷＨＯ《食品益生菌评价指南》．中国食品卫生
杂志，２００３，１５：３７７ －３７９．
＠＠［２］董银苹，崔生辉，于红霞，等．北京市售酸奶中益生菌的分离鉴定及
耐药性检测．卫生研究，２０１０，３９：５５２－５５５． ４５４－４５８，４６５．
＠＠［３］董银苹，崔生辉，于红霞，等．乳酸杆菌及嗜热链球菌的种水平鉴
定—１６ｓ ｒＲＮＡ基因ＰＣＲ扩增及序列分析．卫生研究，２０１０，３９：
＠＠［４］ ＣＤＣ． ＰｕｌｓｅＮｅｔＰｒｏｔｏｏｏｌｓ［ ＥＢ／ＯＬ］． ［２０１１－７－１］．ｈｔｔｐ：／／￣ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／
ｐｕｌｓｅｎｅｔ／ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． ｈｔｍ．
＠＠［５］ Ｒｏｄａｓ ＡＭ，Ｆｅｒｒｅｒ Ｓ，Ｐａｒｄｏ Ｉ． Ｐｏｌｙｐｈａｓｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｗｉｎｅ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ： ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｅｖｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００５，５５：
１９７－２０７．
＠＠［６］ Ｃｏｅｕｒｅｔ Ｖ， Ｇｕｅｇｕｅｎ Ｍ， Ｖｅｒｎｏｕｘ ＪＰ． Ｎｕｍｂｅｒｓ ａｎｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ
ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ｉｎ ｓｏｍｅ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１，２００４，９７：
１４７－１５６．
＠＠［７］ Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ Ｍ， Ｈｕｙｓ Ｇ， Ｌｅｆｅｂｖｒｅ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｒａｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎｔｅｎｄｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｕｓｅ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｒｉｇｉｎ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，
２００６，７２：５３７６－５３８３．
２０１１－０７－０５
乳酸杆菌及嗜热链球菌脉冲场凝胶电泳分子分型方法建立及应用
作者：作者单位：
董银苹， 崔生辉， 于红霞， 李凤琴， DONG Yin-ping， CUI Sheng-hui， YU Hong-xia， LI Feng-qin
董银苹,李凤琴,DONG Yin-ping,LI Feng-qin(中国疾病预防控制中心营养与食品安全所,北京,100050)， 崔生辉,CUI Sheng-hui(中国食品药品鉴定研究院食品化妆品处,北京,100050)， 于红霞,YU Hong-xia(山东大学公共卫生学院营养教研室,北京,100050)
中华预防医学杂志
Chinese Journal of Preventive Medicine2011,45(12)
刊名：英文刊名：年，卷(期)：
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zhyfyx201112008.aspx