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０１１年１２月１日第３６卷第１２期ＭｅｄＪＣｈｉｎＰＬＡ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１，２０１１解放军医学杂志２ ／姜黄素对人结肠癌耐药细胞ＨＣＴ８ＶＣＲ蛋白质双向电泳图谱的影响－
李雷，傅仲学，覃勇，卢伟东，王学虎，陈旺盛
［／摘要］姜黄素处理组ＣＴ８ＶＣＲ蛋白质表达谱的影响。方法 实验分两组， 目的 探讨姜黄素处理对人结肠癌耐药细胞Ｈ－／／，用２对照组加入相应体积的生理盐水。应用固相ｐＨ梯度双向凝胶电５ｍｏｌＬ的姜黄素作用于人结肠癌耐药细胞ＨＣＴ８ＶＣＲ２４ｈ－ μ／泳技术分离姜黄素处理组与对照组人结肠癌耐药细胞Ｈ凝胶银染显色，采集凝胶图像，用ＰＣＴ８ＶＣＲ的总蛋白，ＤＱｕｅｓｔ８．０软件分－ ／析并比较两者之间差异表达的蛋白质。结果 获得了背景清晰、分辨率高、重复性好的Ｈ姜黄素处理ＣＴ８ＶＣＲ细胞系２Ｅ图谱，－－Ｄ，组和对照组图像的平均蛋白质点数分别为１两者的差异点共３姜黄素处理组有８个蛋白点表达上调，０３０±６９和１０７０±９６３个，１８个／表达下调，２个在姜黄素处理组特异表达，５个在对照组特异表达。结论 建立了经或不经姜黄素处理的人结肠癌耐药细胞ＨＣＴ８－识别了３对这些差异蛋白点的进一步分析有助于研究姜黄素逆转结肠癌多药ＶＣＲ的双向凝胶电泳图谱，３个差异表达的蛋白质点，耐药的分子机制。
关键词］电泳，凝胶，双向；多药耐药相关蛋白质类；姜黄素；结肠肿瘤 ［ 蛋白质组学；
（）中图分类号］文献标志码］文章编号］７３５．３５０５７７７４０２２０１１１２１２８６０５ ［ Ｒ ［ Ａ ［ －－－
／Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｕｒｃｕｍｉｎｏｎ２ｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓｒｏｆｉｌｅｓｏｆｒｏｔｅｉｎｓｉｎｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｔＨＣＴ８ＶＣＲｃｅｌｌｓｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎ －Ｄ － － ｐｐｐｇｃａｒｃｉｎｏｍａ
＊
，，，，Ｗ，ＬＩＬｅｉＦＵＺｈｏｎｘｕｅＱＩＮ ＹｏｎＬＵ ＷｅｉｄｏｎＡＮＧＸｕｅｈｕＣＨＥＮ Ｗａｎｓｈｅｎ．ＴｈｉｒｄＤｅａｒｔｍｅｎｔ ｇｇｇｇｇｐ－－－－
，，，ＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｅｒＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｉｔａｌｏｆＣｈｏｎｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔＣｈｏｎｉｎ４０００１６Ｃｈｉｎａｏｆ ｇｙｐｇｑｇｙｇｑｇ
，：ｏｒｒｅｓｏｎｄｉｎａｕｔｈｏｒＥａｉｌｆｚｘ９９０５２１ｓｉｎａ．ｃｏｍ＊Ｃ－ｍ＠ｐｇ
［］／ｒｅｓｅｎｔｒｏｔｅｉｎｒｏｆｉｌｅｓＡｂｓｔｒａｃｔｂｅｃｔｉｖｅｈｅｓｔｕｄｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｔＨＣＴ８ＶＣＲ Ｏ Ｔ －ｐｐｐｙｇｐｇｊ －／ｃｅｌｌｓｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａｓｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔｃｕｒｃｕｍｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＭｅｔｈｏｄｓｈｅｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｔＨＣＴ８ＶＣＲｃｅｌｌｓｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎ Ｔ － ｇ－／，ｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｃｕｒｃｕｍｉｎａｔａｄｏｓａｅｏｆ２５μｍｏｌＬｆｏｒ２４ｈａｎｄｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｒｏｕｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｓｉｏｌｏｉｃａｌｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｇｇｐｐｙｇ
，）ｓａｌｉｎｅ．Ｔｈｅｎｔｈｅｔｏｔａｌｒｏｔｅｉｎｓｏｆｂｏｔｈｒｏｕｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄ．ＳｏｌｉｄｈａｓｅＨｒａｄｉｅｎｔｂａｓｅｄ２ｅｌｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓ（２Ｅｗａｓｕｓｅｄｔｏ － －Ｄ －Ｄ ｐｇｐｐｐｇｇｐ－－／，ｒｏｔｅｉｎｓｅａｒａｔｅｔｈｅｔｏｔａｌｉｎｔｈｅｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｔＨＣＴ８ＶＣＲｃｅｌｌｓｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａｓｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔｃｕｒｃｕｍｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄ － ｐｐｇ－
，ｅｌｓｒｏｄｕｃｅｅｌｒｏｔｅｉｎｓｔｈｅｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｓｉｌｖｅｒ．Ａ ＧＳ８００ｓｃａｎｎｅｒｗａｓｕｓｅｄｔｏｔｈｅｉｍａｅｓａｎｄｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｅｘｒｅｓｓｅｄｗｅｒｅ － ｇｐｇｐｇｙｐ ／ａｎｄａｎａｌｚｅｄｕｓｉｎｔｈｅＰＤＱｕｅｓｔ８．０ｓｏｆｔｗａｒｅＲｅｓｕｌｔｓｈｅ２Ｅ ＨＣＴ８ＶＣＲｃｅｌｌｗｅｒｅａｃｕｉｒｅｄｗｉｔｈｃｌｅａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｒｏｒａｍ．ａｔｔｅｒｎｓ Ｔ －Ｄ－ ｙｇｑｐｇｐ ，，，ｂａｃｋｒｏｕｎｄｈｉｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｂｅｔｔｅｒｒｅｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅｔｈｅａｖｅｒａｅｒｏｔｅｉｎｓｏｔｓｏｆｔｈｅｉｍａｅｓｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔｃｕｒｃｕｍｉｎ ｇｇｐｇｐｐｇ，，ｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅ１０３０±６９ａｎｄ１０７０±９６ｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．Ｉｎｔｈｅｃｕｒｃｕｍｉｎｔｒｅａｔｅｄｒｏｕ３３ｐｒｏｔｅｉｎｓｏｔｓｗｅｒｅｆｏｕｎｄｔｏｂｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌ ｐｙｇｐｐｙ－，，，８ｗｅｒｅｕｒｅｕｌａｔｅｄａｎｄ１８ｗｅｒｅｄｏｗｎｒｅｕｌａｔｅｄ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒｏｎｌｔｗｏｒｏｔｅｉｎｓｏｔｓｗｅｒｅｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｃｕｒｃｕｍｉｎｔｒｅａｔｅｄｅｘｒｅｓｓｅｄ ｐｇｇｙｐｐｐｐ －
／，／ｒｏｕ．ｒｏｆｉｌｅｓＨＣＴ８ＶＣＲｃｅｌｌｓｗｈｅｒｅａｓｆｉｖｅｗｅｒｅｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓｈｅ２ＥｏｆｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａＨＣＴ８ＶＣＲ－ Ｔ －Ｄ －ｇｐｐ，ｃｅｌｌｓｗｉｔｈａｎｄｗｉｔｈｏｕｔｃｕｒｃｕｍｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅｒｉｍａｒｉｌｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｎｄ３３ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｅｘｒｅｓｓｅｄｒｏｔｅｉｎｓｏｔｓｗｅｒｅｄｉｓｔｉｎｕｉｓｈｅｄ． ｐｙｙｐｐｐｇ Ｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅｓｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｅｘｒｅｓｓｅｄｒｏｔｅｉｎｓｏｔｓｍａｂｅｕｓｅｆｕｌｉｎｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｕｒｃｕｍｉｎｉｎｒｅｖｅｒｓｉｎ ｙｐｐｐｙｇｇ ｍｕｌｔｉｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｔｃｏｌｏｎｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓ． ｇ－
］；，，；；；Ｋｅｗｏｒｄｓｅｌｅｃｔｒｏｈｏｒｅｓｉｓｔｗｏｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｍｕｌｔｉｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｃｕｒｃｕｍｉｎｃｏｌｏｎｉｃｎｅｏｌａｓｍｓｒｏｔｅｏｍｉｃｓｅｌｒｏｔｅｉｎｓ ［ ｐ ｐｇｐｇｐｙ －－
）是从中药姜黄根茎中提取的一ｃｕｒｃｕｍｉｎ 姜黄素（种酚类色素，已被广泛用于食品色素和香料，具有抗抗氧化、抗衰老、消除自由基及抑制肿瘤生长等作炎、
］］１４５－
。研究发现，，用［姜黄素可以诱导结肠癌细胞凋亡［］６７－
，抑制结肠癌的侵袭和转移［笔者前期的研究也发现
］８９－
。本研究采用双向凝胶电泳技术对经的多药耐药［
／或不经姜黄素处理的结肠癌耐药细胞ＨＣＴ８ＶＣＲ蛋－白质进行分离，建立分辨率较高、重复性较好的双向电泳图谱，并采用计算机软件进行初步分析，找出耐药相关的差异蛋白，为确定姜黄素逆转人结肠癌多药耐药的相关蛋白奠定了基础。１ 材料与方法
１．１ 实验材料及仪器 人结肠癌耐长春新碱细胞系
／ＨＣＴ８ＶＣＲ购自上海润成生物科技有限公司。ＲＰ－－长春新ＭＩ１６４０培养基及胎牛血清为Ｇｉｂｉｃｏ公司产品；碱（为深圳万乐药业有限公司产品；姜黄素为ＶＣＲ），非线性，Ｓｉｍａ公司产品；ＩＰＧ干胶条（Ｈ３～１０ ｇｐ
、姜黄素可通过下调ＭＤＲ１Ｐｕｒｖｉｖｉｎ蛋白表达，－ｇｐ和ｓ
诱导肿瘤细胞凋亡等多种途径在体内和体外逆转肿瘤
［）基金项目］２００９１２ 重庆市卫生局中医药重点项目（－－
［作者简介］医学硕士。主要从事胃肠肿瘤方面的研究。Ｅ 李雷，－：ｍａｉｌｌｉｌｅｉｈａｏ１６３．ｃｏｍ＠－
［作者单位］李０００１６ 重庆 重庆医科大学附属第一医院外三科（ ４雷、傅仲学、覃勇、卢伟东、王学虎、陈旺盛）［：通讯作者］Ｅａｉｌｆｚｘ９９０５２１ｓｉｎａ．ｃｏｍ 傅仲学，－ｍ＠
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、，）、（两性电解质（１７ｃｍ）ＢｉｏＬｔｅＨ３１０３３ ～－［－胆酰胺ｙｐ－
）、尿素、十二烷基硫酸丙基）ＣＨＡＰＳ－二乙胺］－丙磺酸（
）、钠（四甲基乙二胺（ＳＤＳＴＥＭＥＤ）均为美国Ｂｉｏａｄ－Ｒ、公司产品；碘乙酰胺、二硫苏糖醇（三羟甲基氨ＤＴＴ）
、基甲烷（丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Ｔｒｉｓ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白定量检测试剂盒、ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、ＰＭＳＦ均为上海生工生物工程公司产品；其他试剂均为国产分析纯。
ＰｒｏｔｅａｎＩＥＦＣｅｌｌ型等电聚焦仪、ＰｒｏｔｅａｎＩＩＸＩＣｅｌｌ 型垂直电泳槽、ＧＳ８００扫描仪、ＣｈｉｍｉＤｏｘＲＳ凝胶成－－Ｘ像仪、ＰＤＱｕｅｓｔ８．０图像分析软件均为Ｂｉｏａｄ公司产 －Ｒ
酶标仪为品，Ｍｉｌｌｉｉｌｌｏｒｅ公司产品，ｐ－Ｑ超纯水仪为Ｍ
Ｔｈｅｒｍｏ公司产品，２Ｋ１５型低温高速离心机为Ｓｉｍａｇ公司产品。
１．２ 方法
／１．２．１ＣＴ８ＶＣＲ细胞生长于含 细胞培养及处理 Ｈ－
于３１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液中，７℃、５％ 饱和湿度条件下用０培ＣＯ．２５％胰酶消化传代培养，２、
／养液中加入２实验前１周０００ｎｍｌＶＣＲ以维持耐药， ｇ／撤药培养。取对数生长期结肠癌耐药细胞ＨＣＴ８－每瓶细胞７ＶＣＲ１０瓶，０％融合。随机选取５瓶细胞加
／于３饱入终浓度为２５ｍｏｌＬ的姜黄素，７℃、５％ＣＯ２、μ（；和湿度条件下作用２姜黄素处理组）其余５瓶加入４ｈ。倒置显微镜下观对照组）相应体积的生理盐水处理（
察细胞的形态。
１．２．２ 细胞收集和总蛋白质制备 分别取处于对数生长期的两种细胞，经４用细℃预冷的ＰＢＳ洗涤３次，，胞刮匙刮下细胞后，于４收集℃下８００×ｇ离心５ｍｉｎ／吸尽残留液体。加入１到１．５ｍｌ的ＥｍｍｏｌＬｐ管中，，）和１／苯甲基磺酰（ｈｅｎｌｍｅｔｈｌｓｕｆｏｓｌＰＭＳＦｍｍｏｌＬｐｙｙｙ漩涡振荡，液氮反复冻融３～４次，加入２ＥＤＴＡ，０／／，ｍｌＤＮａｓｅＩ和５ｍｌＲＮａｓｅＡ，４℃下作用３０ｍｉｎ ｇｇμμ按细胞裂解液体积比∶１∶１０加入细胞裂解液，４℃下作
，用３期间每隔１０ｍｉｎ０ｍｉｎ振荡１次。于４℃下１２０００
／，收集上清，ｒｍｉｎ离心３０ｍｉｎＢｒａｄｆｏｒｄ法测定提取液中
］１０
，的蛋白质浓度［样品分装，保存于－８０℃冰箱备用。
／ＩＰＧ胶条分别放入５ｍｌ平衡液Ⅰ（６ｍｏｌＬ尿素、２％
、／、ＨＳＤＳ０．３７５ｍｏｌＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ８．８２０％甘油、２％ ｐ／、和５ｍｌ平衡液Ⅱ（６ｍｏｌＬ尿素、２％ＳＤＳ０．３７５ＤＴＴ）／、ｍｏｌＨＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ８．８２０％甘油、２．５％ＩＡＡ）中各平 ｐ
。将平衡好的胶条转移至１衡１５ｍｉｎ０％聚丙烯酰胺凝胶上端，用０待凝固后将胶板．５％低熔点琼脂糖封顶，
，以每一胶条１转移入电泳槽中，０ｍＡ恒流电泳３０ｍｉｎ待溴酚蓝前沿移入ＳＤＳ胶时，２５ｍＡ恒流电泳直至溴酚蓝前沿抵达距胶底边缘约０．５ｃｍ时停止电泳。１．２．４ＤＳＰＡＧＥ 硝酸银染色 先用去离子水漂洗Ｓ－
；胶５在４ｍｉｎ０．０％甲醇和１０．０％冰醋酸混合液中固定
１ｈ或过夜；３０．０％甲醇、３．１４‰硫代硫酸钠、６．８％无水；；去离子水洗３次，每次５乙酸钠敏化３０ｍｉｎｍｉｎ２．５０‰
；；硝酸银染色２去离子水洗２次，每次１０ｍｉｎｍｉｎ２．５％
碳酸钠、立即加入０．０４‰甲醛显影至蛋白质点清晰；；；去离子水洗３次，每次５１４．６‰ＥＤＴＡ终止１０ｍｉｎｍｉｎ最后用１０．０％甘油保存备用。１．２．５ｉｏａｄ公 图像扫描和分析 染色后的凝胶用Ｂ－Ｒ司的ＧＳ８００扫描仪进行扫描后获得蛋白质点图谱，应－用Ｐ图像分析过程包ＤＱｕｅｓｔ８．０软件进行图像分析，
匹配、背景消减、量化和Ｉ括蛋白点的检测、Ｄ校正等，对数据进行分析，最后生成报告。分别对姜黄素处理
组和对照组的２然后对２Ｅ图谱进行重复性检测，－Ｄ－ＤＥ图谱的蛋白点进行差异分析。数据统计分析采用ＳＰＳＳ１０．０软件和Ｅｘｃｅｌ软件进行。 ２ 结 果
／２．１ＣＴ８ＶＣＲ形态的变化 对 人结肠癌细胞株Ｈ－照组培养２细胞已达９数量明显增加，４ｈ后，０％融合，细胞呈梭形或椭圆形，大小不一，边界清楚，少见漂浮／死亡的细胞。姜黄素处理组ＨＣＴ８ＶＣＲ细胞培养－
数量无明显增加，但细胞变圆、变２４ｈ后约有７０％融合，）。小且见少量漂浮死亡的细胞（图１
／２．２ＣＴ８ＶＣＲ双向电泳图谱 人结肠癌耐药细胞Ｈ－的重复性 通过上述方法得到了分辨率较高、重复性／较好的人结肠癌耐药细胞ＨＣＴ８ＶＣＲ总蛋白双向电－泳图谱。在相同的实验条件和参数设置条件下分别对
两组样品进行３次双向电泳，发现３次重复的蛋白斑点分布模式非常相似，蛋白质点主要分布在ｐＩ为３．５～、。经Ｇ相对分子质量为２８５～１００ｋＳ８００图像采集和－
对ＰＤＱｕｅｓｔ８．０软件对所得的双向电泳图谱进行分析， ／照组和姜黄素处理组人结肠癌耐药细胞ＨＣＴ８ＶＣＲ３－块凝胶的平均蛋白质点数分别为１０７０±９６和１０３０±。选取其中一张点最多并且条纹最少的胶作为参考６９
胶，其他图谱与其进行匹配分析，软件分析平均匹配达到８５．６％，２Ｅ图谱匹配率检测的蛋白斑点分布图见－Ｄ，蛋白点主要集中在两倍上调和两倍下调之间，图２表
１．２．３Ｈ梯度双向凝胶电泳 固相ｐ
电泳 从－８１．２．３．１ＩＥＦ）０℃冰箱中取 等电聚焦（／／２００７ｍｏｌＬ尿素、２ｍｏｌＬＴｈｉｏ ｇ总蛋白质与水化液（－μ
、、／、痕ｕｒｅａ４％ＣＨＡＰＳ６５ｍｍｏｌＬＤＴＴ、０．２％ＢｉｏＬｔｅ ｙ－，沿聚焦盘槽的边缘至左而右量溴酚蓝）混合至３８０ｌμ
）的线性加入样品，揭去ＩＰＧ干胶条（１７ｃｍ，３～１０Ｈ ｐ保护膜，胶面向下放入槽中，覆盖２～３ｍｌ矿物油。水
化和等电聚焦在ＰｒｏｔｅａｎＩＥＦｃｅｌｌ上于１７℃下自动进 ，，，行，程序设置为：被动水化１５ｈ１００Ｖ４ｈ２５０Ｖ２ｈ５００Ｖ，，最后稳定在２ｈ１０００Ｖ３ｈ５ｈ线性升压至１００００Ｖ， １００００Ｖ，６００００Ｖｈ下进行等电聚焦。 将１．２．３．２ＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳 等电聚焦结束后， Ｓ－
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０１１年１２月１日第３６卷第１２期ＭｅｄＪＣｈｉｎＰＬＡ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１，２０１１解放军医学杂志２ ／）图１倒置显微镜×ＣＴ８ＶＣＲ细胞形态学变化（２００ 两组Ｈ－
对照组细胞呈圆形或椭圆形，细胞数量增多；姜黄素处理组细胞变圆、变小且见少量漂浮死亡的细胞Ａ．Ｂ．
／（）ｒｏｕＦｉ．１ｏｒｈｏｌｏｉｃａｌｃｈａｎｅｓｏｆＨＣＴ８ＶＣＲｃｅｌｌｓｉｎｃｕｒｃｕｍｉｎｔｒｅａｔｅｄａｎｄｃｏｎｔｒｏｌＩＭ ×２００
Ｍ － ｇｐｐｇｇｇ－
有２个蛋白点在姜黄素处理组中特异表达，外，５个蛋这些特异表达的差异蛋白白点在对照组中特异表达，
，点的放大图谱及其中１个蛋白点的３Ｄ模式图见图４。特异表达的蛋白质的等电点和分子量见表１３ 讨 论
结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和目前多采用以手术为主结合病死率呈逐年上升趋势，
放疗、化疗等手段的综合治疗。化疗在肿瘤的治疗中有着非常重要的作用，但肿瘤细胞的多药耐药是导致化疗失败的主要因素。多药耐药性（ｍｕｌｔｉｄｒｕｒｅｓｉｓｉｇ －
图２ 蛋白质斑点分布的重复性检测
Ｆｉ．２ｅｅｔｉｔｉｖｅｔｅｓｔｉｎｆｏｒｓｃａｔｔｅｒｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｒｏｔｅｉｎｄｏｔｓ Ｒ ｐｇｐｇ
，ＭｔａｎｃｅＤＲ）是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐
药性的同时，对其他许多结构、功能相关的抗肿瘤药物亦产生交叉耐药现象，从而使抗肿瘤药物的疗效大大
］１１
。结肠癌多药耐药形成的机制非常复杂。目前降低［
明蛋白点具有较好的重复性。
２．３ 双向电泳图谱蛋白点的差异分析 人结肠癌耐
／。对电泳图谱药细胞ＨＣＴ８ＶＣＲ蛋白质图谱见图３－进行分析，识别了３３个差异表达的蛋白质点。与对照组相比，姜黄素处理组有８个蛋白点表达上调（相差两，。另倍以上）相差两倍以上）１８个蛋白点表达下调（
研究发现多药耐药的产生主要与以下几个方面有关：）对化疗药物的外排以及ＰＬＲＰＰ①肺耐药相关蛋白（－ｇ
）和多药耐药相关蛋白（引起的耐药；ＭＲＰ②谷胱甘肽－、蛋白激酶Ｃ（系统活性增高，Ｓ转移酶（ＧＳＴ）ＰＫＣ）
）活性下降；③ｂ、ＤＮＡ拓扑异构酶（ＤＮＡ ＴＯＰＯｃｌ２
Ⅱ－
／图３银染）ＣＴ８ＶＣＲ蛋白质双向电泳图谱（ 人结肠癌细胞Ｈ－
、对照组；姜黄素处理组；标数字的点为差异点，Ａ．Ｂ．１１８为在对照组中表达上调的蛋白点，１９２５３１为在姜黄素处理组中表～～、达上调的蛋白点，２６３０为在对照组特异表达的蛋白点，３２３３为在姜黄素处理组特异表达的蛋白点～
／）Ｆｉ．３ｈｅ２ＥＧＥｏｆｔｏｔａｌｒｏｔｅｉｎｓｏｆＨＣＴ８ＶＣＲｃｅｌｌｓ（ｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎｎｉｎ Ｔ －Ｄ － ｐｇｇ
０１１年１２月１日第３６卷第１２期ＭｅｄＪＣｈｉｎＰＬＡ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１，２０１１解放军医学杂志２ ·１２８９·
图４ 特异表达蛋白质点的放大图谱
、、、、、、对照组；姜黄素处理组；图中数字为特Ａ、ＢＣＤ、ＩＪＫ．Ｅ、ＦＧ、Ｈ、Ｍ、Ｎ、Ｏ．ＬＰ为３３号点的３Ｄ模式图；异表达的蛋白质点编号
Ｆｉ．４ｈｅｒｏｔｅｉｎｓｏｔｓｓｅｃｉｆｉｃａｌｌｅｘｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅｅｎｌａｒｅｄｒｅｉｏｎｓ Ｔ ｐｐｐｙｐｇｇｇ
表１ 图３中特异表达的蛋白质的等电点和分子量
Ｔａｂ．１ＩｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｏｉｎｔｓａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｏｆｔｈｅｓｅｃｉａｌｓｏｔｓｓｈｏｗｎｉｎＦｉ．３ ｐｐｐｇ
编号２６ ２７ ２８ ２９ ３０ ３２ ３３
ＡＳｏｔ ｐ８１０９ ２５０２ ３００８ １００１ ４８０１ ９２１４ ８０１２
３）相对分子质量（×１０
等电点８．６７５．６１６．２３５．３８６．３６９．１３８．６４
２ＥＧｅｌ－Ｄ
对照组表达表达表达表达表达不表达不表达
姜黄素处理组
不表达不表达不表达不表达不表达表达表达
２６．３５ ６５．４１ １３．８５ ２４．８９ １０１．８９ ２８．４８ ９．７６
／ＡＳｏｔ．ＨＣＴ８ＶＣＲ细胞２Ｅ图谱蛋白点的ＩＤ编号 注： －－Ｄｐ
、突变型ｐａｓ５３等凋亡相关基因高表达以及凋亡基因Ｆ导致肿瘤耐药的ｂａｘ表达降低也是抑制肿瘤细胞凋亡、］１２１４－
。通过药物逆转肿瘤多药耐药是提高化重要因素［
疗效果的重要手段，但目前许多逆转剂如维拉帕米、环孢素Ａ等因具有明显的毒副作用，在临床上的应用受到限制。因此，寻找高效低毒的耐药逆转剂成为近年
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０１１年１２月１日第３６卷第１２期ＭｅｄＪＣｈｉｎＰＬＡ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１，２０１１解放军医学杂志２ 来研究的热点。姜黄素由于自身不良反应少、作用靶可调节和提高机体免疫功能且长期应用无明显点多、
毒副作用而日益引起人们的重视。近年来研究发现姜
］１５
。笔者前期研究发现黄素能逆转肿瘤的多药耐药［
【参考文献】
［］Ｐ，Ｋ，Ｙ，１ｒａｋｏｂｗｏｎＳｈｏｏｎｔａｗａｄＪｏｎｖａｎｉｔＰｅｔａｌ．Ｃｕｒｃｕｍｉｎｄｅ ｇｇ －
ｃｒｅａｓｅｓｃｈｏｌａｎｉｏｃａｒｃｉｎｏｅｎｅｓｉｓｉｎｈａｍｓｔｅｒｓｂｓｕｒｅｓｓｉｎｉｎｆｌａｍｍａ ｇｇｙｐｐｇ －ｔｉｏｎｅｄｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｅｎｔｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｍｕｌｔｉｓｔｅｃａｒｃｉｎｏｅｎｅｓｉｓ ｐｇ －ｍ［］，，（）：Ｊ．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ２０１１１２９１８８１００． －
［］Ｓ，２ｒｉｖａｓｔａｖａＲＫ，ＣｈｅｎＱ，ＳｉｄｄｉｕｉＩｅｔａｌ．Ｌｉｎｋａｅｏｆｃｕｒｃｕｍｉｎｉｎ ｑｇ－－
ｄｕｃｅｄｃｅｌｌｃｃｌｅａｒｒｅｓｔａｎｄａｏｔｏｓｉｓｂｃｃｌｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉ ｙｐｐｙｙｐ －－（／Ｗ／）［］，，（）：ｔｏｒＡＦ１ＣＩＰ１Ｊ．ＣｅｌｌＣｃｌｅ２００７６２３２９５３２９６１．２１ －ｙｐ［］Ｓ，Ｃ３ｈｉｓｈｏｄｉａＳｈａｔｕｒｖｅｄｉＭＭ，ＡａｒｗａｌＢＢ．Ｒｏｌｅｏｆｃｕｒｃｕｍｉｎｉｎ ｇｇ
［］，，（）：ｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａＪ．ＣｕｒｒＰｒｏｂｌＣａｎｃｅｒ２００７３１４２４３３０５． －ｐｙ［］Ｐ，４ａｔｅｌＢＢＧｕｔａＤ，ＥｌｌｉｏｔｔＡＡ，ｅｔａｌ．ＣｕｒｃｕｍｉｎｔａｒｅｔｓＦＯＬＦＯＸ －ｐｇ
［］ｓｕｒｖｉｖｉｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｖｉａｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＥＧＦＲｓａｎｄＩＧＦ１ＲＪ． －ｇ ，，（）：ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ２０１０３０２３１９３２５． －
［］Ｗ，Ｈ５ａｔｓｏｎＪＬｉｌｌＲ，ＬｅｅＰＷ，ｅｔａｌ．Ｃｕｒｃｕｍｉｎｉｎｄｕｃｅｓａｏｔｏｓｉｓｉｎ ｐｐ
［］ＨＣＴ１１６ｈｕｍａｎｃｏｌｏｎｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｎａ２１ｉｎｄｅｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒＪ．－ － ｐｐ，，（）：ＥｘＭｏｌＰａｔｈｏｌ２００８８４３２３０２３３． －ｐ
［］Ｋ，，６ｕｎｎｕｍａｋｋａｒａＡＢＡｎａｎｄＰＡａｒｗａｌＢＢ．Ｃｕｒｃｕｍｉｎｉｎｈｉｂｉｔｓｒｏ ｇｇｐ－
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［］Ｍ，７ｕｄｄｕｌｕｒｕＧ，ＧｅｏｒｅｉｌｌｉａｍＪＮ，ＭｕａｌａＳｅｔａｌ．Ｃｕｒｃｕｍｉｎｒｅ ｇｐｐｇ－Ｗ－
ｕｌａｔｅｓｍｉＲ２１ｅｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｓｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓｉｎｃｏｌｏ － ｐ－［］，，（）：ｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒＪ．ＢｉｏｓｃｉＲｅ２０１１３１３１８５１９７． －ｐ
［］覃勇，傅仲学，卢伟东，等．姜黄素逆转人结肠癌细胞株Ｈ／８ＣＴ８－
］，（）：ＶＣＲ多药耐药的实验研究［Ｊ．中国生化药物杂志，２０１１３２３１７３１７５．－
［］卢伟东，傅仲学，覃勇，等．姜黄素逆转结肠癌裸鼠移植瘤多药９
］，（）：耐药的研究［Ｊ．第三军医大学学报，２０１１３３４３７６３８０．－［］Ｂｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ１０ｒａｄｆｏｒｄＭＭ．Ａｒａｉｄａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｏｆ ｑｐ
［］ｏｆｕｔｉｌｉｚｉｎｔｈｅｏｆｄｅｂｉｎｄｉｎＪ．ｍｉｃｒｏｒａｍｒｏｔｅｉｎｒｉｎｃｉｌｅｒｏｔｅｉｎ ｇｙｇｇｐｐｐｐ －，：ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１９７６７２２４８２５４． －
［］Ｌ，１１ｏｎｌｅＤＢＪｏｈｎｓｔｏｎＰＧ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｙｇ
［］，，（）：Ｊ．ＪＰａｔｈｏｌ２００５２０５２２７５２９２． －
［］Ｌ，，Ｍ１２ａｂｉａｌｌｅＳＧａｅｔＬａｒｔｈｉｎｅｔＥ，ｅｔａｌ．Ｔｒａｎａｃｒｉｔｉｏｎａｌｒｅｕｌａｔｏｔｓ ｙｐｇ
：［］ｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｍｕｈｉｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ１ｇｅｎｅｒｅｃｅｎｔｖｉｅｗｓＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ｇ ，，（／）：Ｐｈａｒｍａｃｏｌ２００２６４５６９４３９４８．－
［］Ｅ，１３１ｓｔａＡ，ＫａｎｔｈａｒｉｄｉｓＰＺａｌｃｂｅｒＪＲ，ｅｔａｌ．Ｐｒｅｃｉｉｔｏｕｓｒｅｌｅａｓｅｏｆ－Ｏ ｇｐ
ｍｅｔｈｌＣＧｂｉｎｄｉｎｒｏｔｅｉｎ２ａｎｄｈｉｓｔｏｎｅｄｅａｃｅｔｌａｓｅ１ｆｒｏｍｔｈｅ ｙｐｇｐｙ －）ｍｅｔｈｌａｔｅｄｈｕｍａｎｍｕｌｔｉｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｅｎｅ（ＭＤＲＩｏｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｙｇ ［］，，（）：Ｊ．ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ２００２２２６１８４４１８５７． －
［］Ｗ１４ｉｎｈｏｌｄｓＪ．Ｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｃａｕｓｅｄｂｍｕｈｉｄｒｕｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｓｓｏｃｉａｔ ｊｇｙｇ －－
［］，，：ｅｄＪ．ＮｏｖａｒｔｉｓＦｏｕｎｄＳｍ２００２２４３６９７９．ｒｏｔｅｉｎｓ －ｙｐｐ［］英焕春，张淑兰，吕靖．姜黄素逆转卵巢癌耐药细胞株Ｃ／１５ＯＣ１
］，（）：ＤＤＰ耐药性级机制的研究［Ｊ．现代肿瘤医学，２００７１５５６０４－６０７．
（；）收稿日期：修回日期：２０１１０８０５２０１１１０１７－－－－
／可增强人结肠癌耐药细２５ｍｏｌＬ姜黄素作用２４ｈ后，μ
／抑制多药耐药基因胞ＨＣＴ８ＶＣＲ对ＶＣＲ的敏感性，－提高细胞对化疗药物的ｍｄｒ１ｍＲＮＡ及其蛋白的表达，
］８
。但姜从而逆转结肠癌细胞的多药耐药性［敏感性，
黄素逆转肿瘤多药耐药的机制非常复杂，以前的研究仅强调单个或者少数几个分子的大多基于基因水平，
作用，在蛋白质水平上缺乏系统性和整体性。
目前，蛋白质组学技术已经被广泛应用于寻找新的药物治疗靶点、评述药物的疗效以及发现肿瘤标志物等方面。蛋白质是细胞生命活动及其功能的主要执行者。蛋白质组学通过对细胞全蛋白特性进行大范围的研究，包括蛋白表达水平、转录后修饰和蛋白间相互可在蛋白水平上对细胞活动、网络联系以作用等方面，
及疾病过程等获得全面认识。利用２Ｅ联合质谱技－Ｄ从蛋白质组学的角度对结肠癌的多药耐药进行研术，
究，有可能发现一些与结肠癌耐药相关的蛋白质，有利于了解结肠癌的多药耐药机制。另外，一些新发现的耐药相关蛋白有可能成为多药耐药逆转剂的药物靶点。因此，采用蛋白质组学技术研究结肠癌的多药耐药具有重要意义。
本实验利用蛋白质组学的思路和技术平台，比较姜黄素处理组和对照组蛋白质组的差异，寻找耐药相姜黄素处理关的蛋白。对双向电泳图谱的分析发现，
组和对照组共有３其中在姜黄素处理组中３个差异点，８个表达上调，１８个表达下调，２个蛋白点在姜黄素处
理组特异表达，５个蛋白点在对照组特异表达。两组之间存在如此多的差异蛋白表明结肠癌的多药耐药并不而是大量蛋是某种或者少数几种蛋白质作用的结果，
／白质相互作用的结果。那些在ＨＣＴ８ＶＣＲ细胞中高－表达的蛋白质可能促进了结肠癌细胞多药耐药的形成，而那些在姜黄素处理组高表达的蛋白质则可能与逆转结肠癌多药耐药有关。目前这些差异蛋白质的等电点和分子量已经初步确定，但它们是已知的结构蛋白还是尚未发现的新蛋白，尚需通过质谱技术进一步以明确其生物学功能，了解姜黄素逆转肿瘤进行鉴定，
细胞多药耐药的机制并最终找到多药耐药逆转剂的药物靶点，从而达到逆转结肠癌多药耐药的目的。
（责任编辑：张金桐）