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(收稿日期:2000212226)
反义核酸的研究进展
赵 倩
(天津医科大学药学院 天津300203)
摘 要 从反义核酸的作用机理、。反义核酸作为一种生化药物, 在治疗病毒感染性疾病、心血管疾病以及肿瘤、, 择性和高效低毒。
关键词 中图分类号:Q 52 文献标识码:A 04, 从而达到控制疾病的目的。反义技术是一种新的药物开发方法, 包括反义
反义RNA 等。利用这一技术研制的药物就称为反义药DNA 、
物。反义寡核苷酸[1](an tisen se o ligonucleo tide , A SON ) 是指那些能与特定的DNA 、RNA 以碱基互补配对的方式结合, 并阻止其转录与翻译的短核酸片段。1 反义核酸的作用机理
蛋白质在人体新陈代谢中扮演着非常重要的角色, 无论是宿主疾病(如肿瘤) 还是感染性疾病(如肝炎) , 几乎所有的人类疾病都是由蛋白质的变异所引起的。从DNA 向蛋白质的信息转移过程中可以知道在生物体内存在着许多寡聚核酸的潜在作用位点。在反义技术中, 寡聚核酸以信使RNA 的专一性序列作为靶物, 并由此阻止信使RNA 将信息翻译成蛋白质。
反义核酸的作用机理基于碱基配对原则, 可通过与靶RNA 进行碱基配对结合的方式参与对照相关基因表达的调控。其作用方式有:
(1) 反义RNA 与mRNA 结合形成互补双链阻断核糖核蛋白体同mRNA 的结合, 从而抑制了mRNA 翻译成蛋白质的过程。
(2) 反义DNA 能与靶细胞形成一种三链核酸(tri p le he 2增强lix nucleic acid ) , 它通过作用于控制基因转录的转录子、子和启动子区, 对基因的转录进行调控。
(3) 反义核酸与mRNA 的结合可阻挡mRNA 向细胞质的运输。
(4) 反义核酸与mRNA 结合后使得mRNA 更易被核酸酶识别而降解, 从而大大缩短了mRNA 的半衰期。
上述4种作用途径都可表现为对基因表达的抑制或调节, 且这种调节是具有特异性的[2～4]。2 反义核酸的药理作用
211 BC 122反义寡核苷酸对细胞凋亡的影响
21111 诱导胃癌细胞的凋亡 路平等[5]采用四唑蓝快速比色法(M T T ) 比较2条人工合成的反义寡核苷酸(A SODN ) 直接作用及其以脂质体(DO TA P ) 为载体对胃癌细胞的控制效果。应用流式细胞术和逆转录聚合酶链反应(R T 2PCR ) 检测A SODN 对BC 122蛋白质和mRNA 表达量的调控, 应用相差显微镜、电子显微镜及流式细胞术等方法, 观察BC 122A SODN 诱导BGC 2823胃癌细胞凋亡的效果。结果显示, 2条A SODN 抑制胃癌细胞增殖的作用呈浓度和与时间依赖性, 且靶位点于mRNA 蛋白编码区(A SODN 2) 和以DO TA P 为载体的A SODN 对胃癌细胞的增殖抑制效果为佳。A SODN 作用于胃癌细胞, 降低BC 122蛋白和mRNA 表达。BC 122
凋亡小体出现、A SODN 处理胃癌细胞, 观察到肿瘤细胞缩小、
染色质浓缩、凋亡峰等凋亡特征改变。由此可得出BC 122A SODN 可降低BC 122mRNA 和蛋白表达, 诱导胃癌细胞凋亡的结论。
21112 促进乳腺癌M CF 27细胞凋亡 细胞的凋亡如同细胞的增殖一样受多种基因(如BC 122、C 2M YC 、P 53等) 调控[6]。Hockenbery 等[7]认为BC 122基因族在细胞凋亡控制中的作用最具重要意义。近年来研究表明该基因还具有细胞周期抑制功能。郑军等[8]使用电转染法将合成的针对BC 122mRNA 的反义寡核苷酸导入M CF 27乳腺癌细胞, 用荧光显微镜、电镜、免疫组化法及流式细胞仪检测反义寡核苷酸对乳腺癌细胞凋亡、BC 122表达及细胞周期的影响。结果显示, 经BC 122反义寡核苷酸作用后, M CF 27细胞BC 122基因表达降低, 凋亡细胞数增多。作用前后差异有显著意义(P
有连续的特异性。这与抑制细胞周围和细胞内bFGF 的表达有关。bFGF 再合成的减少由于外源性bFGF 的加入而部分可逆。此作用可持续48～72小时, 随后消失。如果24小时后反义寡脱氧核苷酸的介质被游离的寡核苷酸取代, 则胸腺结合速度恢复到可控制的水平。在相同的条件下, 相对应的正义寡脱氧核苷酸产生可忽略的非特异性抑制作用。15位残基反义寡脱氧核苷酸的抗增生作用由于在反义寡核苷酸15位残基324非碱对鸟核苷的加入而显著增加。平滑肌细胞的增生过程以及bFGF 特异性反义寡核苷酸有效和特异的抗增生作用的资料均与bFGF 有关。总之, 反义方法的使用在抑制血管成形术后再狭窄方面可能会成为一种新的治疗方法。
214 反义核酸抑制白介素21生物学效应 转录因子核因子2KappdB (N F 2KappaB ) 通过调控白介素21(I L 21) 诱导的前列腺素和黏附分子等炎症因子合成而影响炎症疾病的发生与发展[13～16], 因此, N F 2KappaB 作为一个炎症治疗靶位日益受到重视。郭甫坤等[17]采用L i pofectin 激酶2(I RA 2) 。用Sand 2w EL ISA 法测定I 2, EL 1(I CAM 21) , R T 2PCR 法检测I CAM 21mRNA 和I K 2mRNA 表达水平。结果显示, 反义I RA K 22寡核苷酸呈浓度1～4m g ～24小时依赖性的抑制N F 2ϑ活L 和时间5
化, PG I 2合成和I CAM 21蛋白表达, 反义I RA K 22寡核苷酸3m g L 与细胞共孵育8小时抑制效果最好; 反义I RA K 22寡核苷酸抑制I CAM 21mRNA 表达; 反义I RA K 22寡核苷酸抑制
由此, 反义I RA K 22寡核苷酸通过抑制I RA K 22mRNA 表达。
I RA K 22表达抑制I L 21生物活性, 预示反义I RA K 22寡核苷酸是一种可供选择的抗炎新策略。3 反义核酸的化学修饰
反义核酸作为基因表达的反义和反基因抑制剂, 正发展成为一类直接以基因为靶位点的、直接阻止基因转录和翻译或直接导致靶基因失活的新一代高选择性的化疗药物。实现抑制某些疾病的基因表达以达到治疗的目的。反义核酸应具有选择性、稳定性、溶解性[2]。未加修饰的天然反义核酸难以满足全部要求, 因此还存在着一些需要解决的问题[18]。见图1
。
期细胞减少, 而G 2～M 期、S 期细胞增多。因此, BC 122反义寡核苷酸经电转染法导入乳腺癌细胞后, 可以获得较好的瞬时表达, 降低BC 122功能, 促进细胞凋亡。在肿瘤研究中, BC 122可作为一个有用的靶基因。
212 反义核酸对多药耐药逆转的研究 多药耐药(m u l 2tidrug resistance , M DR ) 是肿瘤化疗的重大障碍。从分子生物学上理解, M DR 的形成过程如下:
m drl 基因2转录→m drl mRNA 2翻译→P 糖蛋白(Pgp ) →M DR 表型
传统的M DR 逆转剂都是作用在Pgp 水平, 不仅效率低而且副作用大。近年来发展起来的反义技术为M DR 的逆转提供了新的思路[9], 使从分子水平在M DR 形成的最上游来阻止M DR 的发生成为可能。
21211 逆转人肺腺癌细胞多药耐药性 以m drl c DNA -9～+6) 为靶位点, 合成反义核酸(A TCCA TCCCGA CCTC ) , 并用正义链作为对照(GA GGTCGGGA T GGA T ) 。通过脂质体将其导入肺腺癌细胞A 549 流R , 采用逆转录聚合酶链反应、式细胞仪、罗丹明试验及药敏试验观察2组细胞的m drl
罗丹明聚集和对阿霉素敏感性。mRNA 、P 糖蛋白表达、
反义核酸处理的细胞m drl mRNA 下降和对照组细胞无明显变化, 制量(I C 50) 0、01118m g 。这表明, 经反义m drl mRNA 和细胞的Pgp 表达明显低于正义组和对照组, 罗丹明明显聚集, 药敏试验提示其对抗癌药的敏感性提高20倍, 而反义核酸和脂质体在在实验条件下其本身未对A 549细胞产生毒性作用。说明反义核酸具有明显的逆转肺癌M RD 作用, 其作用水平在mRNA 或DNA 水平, 使Pgp 的表达受到明显抑制[10]。
21212 逆转人白血病多药耐药细胞株耐药性 陈颖等[11]采用M T T 法检测K 562 ADM 细胞对阿霉素的I C 50, 用流式细胞仪分析细胞内的柔红霉素含量, 用免疫细胞化学染色方法确定P 170的表达水平, 用R T 2PCR 法检测m drl 2mRNA 的相对水平(m drl 与ΒΒM G ) 。结果浓度2微球蛋白之比, m drl 22为2Λmo l L 的反义核酸使K 562 ADM 细胞对阿霉素的I C 50从处理前的25172m g L 降至处理后的6197m g L , 相对逆转效率为73101%。反义核酸亦使K 562 ADM 细胞内的柔红霉素含量增加。P 170表达阳性率从处理前的(98126±1135) %降到处理后的(1813±615) %, m drl ΒM G 亦由处理22前的2107±0. 16降到1157±0. 14, m drl 2mRNA 相对水平有所下降。反义核酸通过下调m drl 基因, 阻断P 170的表达, 从而降低K 562 ADM 的耐药性。
213 反义核酸对冠脉平滑肌细胞增生的抑制作用 A nnette 等人[12]认为碱性成纤维细胞生长因子(bFGF ) 作为有效的动脉平滑肌有丝分裂原, 在动脉硬化和由于刺激血管平滑肌细胞增生物产生的再狭窄的发病机制上具有重要作用。他们发现在011～2. 0Λmo l L 范围内, 15位残基部分硫代磷酸脂修饰的反义寡核苷酸作为对bFGF mRNA 的代偿物, 具有剂量依赖性的作用, 可阻断培养的人和牛冠脉平滑肌细胞的生长和分裂。这种作用在较低的非毒性浓度011～015Λmo l L 具
图1 反义核酸的化学修饰
此外, 为了改善在生理条例条件下通过三螺旋的形成, 寡聚核酸对双螺旋DNA 进行识别的亲合性, 或拓广这种识别的序列范围, 或为了在体内实现那些通过螺旋结构的形成而实现的反基因技术。人们尝试对能形成三螺旋的寡聚核酸进行各种各样的改性。这些改性方法主要包括核酸骨架改性、碱基改性以及将一些嵌入分子共价连接在寡聚核酸的末端。
311 骨架修饰 正常的A SON 链中磷酸二酯链的结构在生
理条件下对核酸酶非常敏感, 在体内半衰期仅数分钟。因此在正常A SON 未与靶基因结合前既已降解, 根本无法发挥其功能。基于A SON 发挥特异性抑制基因表达的关键在于碱基的排列顺序, 与易降解的磷酸二酯骨架无关。所以替换这一部分成为增强A SON 稳定性的主要方法。另外, 通过对骨架的修饰, 还能影响A SON 其它的性质, 如可望提高与RNA 的亲和力、细胞的通透性和吸收等[19]。其中, 一类为磷酸二酯基的修饰, 包括离子型修饰(图2所示) 和非离子型修饰(图3所示) 。研究表明含硫代磷酸酯(图3) 的寡聚核酸的物化性质与正常DNA 片段相似。它可通过受体作用完整地进入细胞内, 其抗细胞内核酸酶的能力很强, 可以与互补的靶基因形成较稳定的双链复合物以抑制mRNA 的翻译; 同时, 它还能激活RN ase H , 进而通过在体内专一性的切割RNA ・DNA 杂交体中的RNA 链, 促进mRNA 的降解。因此, 它被认为是第一代寡核苷酸类似物的代表。另一类多为肽核酸(pep tide nucleic acids , PNA s ) , 它是以多肽骨架结构替代寡核苷酸中的糖2磷酸骨架, 并采用改进的固体多肽合成法, 合成的以肽为骨架的核酸模拟物。它与天然DNA 构特征, 其核苷酸单元间的化学链数与骨架中的化学链数相同, 同, 和构象刚性, 的碱基配对。在体内试, 成为一种有潜力的反义分子
[20,21]
应基偶联物, 此修饰可对靶病毒RNA 和mRNA 序列进行专一性切割。此外, 在3’或5’端或在核苷之间的磷酸酯基偶联上具有反应性的基团可增强反义和反基因寡聚核酸的效果。4 反义核酸的问题与展望
由于近年来对致癌基因的研究大有进展, 反义核酸无疑最终用于抗癌方面。当前, 更大的发展还是在其抗病毒作用的研究。目前在医药领域进行的研究主要集中在反义核酸的合成及化学修饰, 绝大部分是在体外进行药理试验。因此, 反义核酸的研究尚处在初级阶段。现在需要解决的问题是:①设计并合成效果更好的反义寡核苷酸; ②制备大量的寡核苷酸以满足研究与治疗需求; ③降低合成成本以尽快成为实用型药物。
反义核酸作为基因治疗的药物, 虽然研究的时间不长, 但发展很快。随着人类基因计划的逐步完成, 各种疾病基因的不断被发现, 可以预见在不久的将来, 反义核酸作为具有高度专。
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图3 磷酸二酯基的非离子型修饰
312 碱基修饰 碱基是A SON 与靶基因通过氢链形成又是A SON 发挥功能的主要条件。因此, 该部位的修饰应以不影响氢链形成为前提。热力学分析表明52甲基化胞嘧啶的引入能增强形成的三螺旋DNA 的稳定性, 是最常用的碱基修饰方法。Robetr A 等[22]研究发现, 2’2O 22基修饰的反义寡核苷酸具有比硫代磷酸酯反义寡核苷酸更强的对基因表达的抑制作用。
313 (分子共价键嵌入修饰) 寡聚核苷酸偶联物 为了增强反义寡核苷酸与它们互补的单链DNA RNA 结合的亲合性, 将核酸小分子嵌入剂共价连接在寡核苷酸的磷酸酯基(3’端或5端或3’, 5’端) , 组成寡聚核苷酸的偶联物。根据小分子配基的作用, 可将它们分为2类:①寡聚核苷酸2嵌入基偶联物, 它可以大大增加形成三螺旋的稳定性; ②寡聚核苷酸2反
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大豆异黄酮的抗癌作用
孙家莉Ξ
(天津市医药科学研究所 天津300070)
摘 要 大豆异黄酮是豆科植物的重要成分, 。、化学
结构、化学性质; 抑制肿瘤细胞增殖及抑制肿瘤生长作用; 制酪氨酸激酶活性和抑制拓扑异构酸 ; 。
关键词 :3:A 文章编号:1006-5687(2001) 02-0010-03isoflavones ) 是大豆中一类重要非营养素成分, 近年来研究显示其具有显著的防治癌症效果。流行病学调查表明, 西方发达国家居民的乳腺癌、前列腺癌和直肠癌发病率显著高于发展中国家, 其发病率是东南亚人的4～10倍。显示居民摄入豆制品量与癌症发生率呈负相关。动物实验和细胞实验亦证实, 大豆异黄酮具有抑制乳腺癌、前列腺癌、白血病及一些肝癌和胃癌细胞系的生长繁殖。鉴于大豆异黄酮在以上方面的突出作用, 笔者将近期国内外有关大豆异黄酮抗癌方面的研究作一综述。1 大豆异黄酮的成分、结构和性质
大豆中异黄酮主要有3种[1]:染料木苷(gen istin ) 、大豆苷(daidzin ) 和62甲氧基大豆苷(glicitin ) , 其总量约占大豆重的0125%。在大豆加工、微生物发酵或体外酸水解作用下, 释放出异黄酮苷元, 即染料木素(gen istein ) , 是最具代表性的三羟异黄酮, 此外, 还有大豆素(daidzein ) 和62甲氧基大豆素(glicitein ) 。苷与苷元均有生理功效。大豆种子中异黄酮含量在1200～4200Λg g [2]之间变化, 且主要以葡萄糖苷形式存在。游离的异黄酮只占总异黄酮的百分之几。大豆异黄酮溶解于含水乙醇。当50℃、pH 6的条件下产生的异黄酮化合物最多, 且在Β2葡萄糖苷酶的作用下, 有大量的染料木素和大豆苷原产生, 使豆制品苦味增大。如低温并加入葡糖酸2∆内酯可抑制葡糖苷酶活性, 使苷原产生减少。
不同国家的大豆, 由于生长环境、存储条件和时间的差异, 各种异黄酮的含量有一定的变化。豆制品加工过程的蒸
煮, 不易使异黄酮成分破坏, 烘烤后使染料木素和大豆黄素分别丢失21%和15%, 未发酵的大豆制品以苷形式存在, 发酵食品以苷元形式存在, 平均含量016～1. 4Λg 对比发现, 发g 。酵比未发酵豆制品有更高的生物利用率[3]。2 抗肿瘤动物实验研究
大豆抗癌作用的动物实验研究国外报道很多, 结果显示以含大豆的饲料喂养动物, 可降低肿瘤的发生率, 延长肿瘤的潜伏期, 减少肿瘤的发生数目。现有的动物实验资料不仅涉及到乳腺癌、前列腺癌和结肠癌, 对其它的癌症如肝癌、皮肤癌、胃癌等也进行了研究。大豆异黄酮有抗肿瘤作用, 特别是与激素相关的肿瘤。Po l 2
lard [4]发现用大豆异黄酮饲料喂饲可使甲基硝基尿(M NU ) 诱导的L obund 2W istar 鼠的癌变灶数量下降, 在
诱导前喂饲可减少前列腺肿瘤的发生, 降低对前列腺精液囊转移性腺癌的敏感性。Barnes 等[5]实验证明, 大豆提取蛋白能抑制二甲苯蒽诱导的SD 大鼠乳腺癌模型的肿瘤发生, 包括肿瘤数量减少, 潜伏期延长。根据郑杰[6]文章列表表示的染料木素对动物肿瘤的影响显示, 以7, 122二甲基苯并蒽诱导的乳腺癌及乳腺肿瘤注射染料木素; 以氧化偶氮甲烷和1, 22二甲基肼诱导的大鼠结肠肿瘤用染料木素01075～0115g kg 喂饲; 以7, 122二甲基苯并蒽和十四烷酰佛波醋酸酯诱导W istar 大鼠皮肤肿瘤通过染料木素给药等, 均可抑制肿瘤生长。个别动物实验不具抗癌作用是由于豆制品制备方法对异黄酮含量的影响, 或与染料木素难溶于水有关[7]。
Ξ孙家莉, 女, 1950年2月出生, 天津市人, 1975年毕业于天津纺织工学院染化系, 1980年在南京药学院进修, 副研究员, 多年从事抗肿瘤药物研究
。