现代医学对恶性肿瘤转移相关机制的研究进展

　　[摘要] 恶性肿瘤转移是恶性肿瘤发生和演变过程中最危险的阶段，是恶性肿瘤患者死亡的首要原因，临床上，60%以上的恶性肿瘤患者在发现时已经转移。近年来，现代医学对恶性肿瘤转移的机制研究取得突破性进展，从单纯的“解剖和机械”学说向“种子与土壤”学说迈进，再向微环境学说、肿瘤干细胞学说深入，特别是新兴的肿瘤干细胞学说成功解释了恶性肿瘤转移表现的肿瘤遗传异质性、失巢凋亡抗性、肿瘤休眠等现象，为恶性肿瘤转移的治疗提供了更多新的靶点与诊疗思路。 　　[关键词] 现代医学；恶性肿瘤；转移机制；上皮间质转化；肿瘤干细胞 　　[收稿日期] 2014-03-30 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目（81373603） 　　[通信作者] 龚婕宁，博士生导师，Tel：[1**********]，E-mail：[1**********]@163.com 　　[作者简介] 陈惠， Tel：[1**********]，E-mail：1060138599@qq.com 　　恶性肿瘤是危害人类健康的全球公共卫生问题之一，转移是恶性肿瘤发生和演变过程中最危险的阶段，为新世纪人类的第一杀手，临床上，60%以上的恶性肿瘤患者在发现时已经转移。我国作为一个发展中大国，随着工业化、城镇化和人口老龄化进程的加快，不良生活方式及环境污染等问题，导致恶性肿瘤转移呈上升趋势，因此，预防及抑制恶性肿瘤转移是迫切需要解决的关键问题。恶性肿瘤转移的机制认识、研究经历了漫长的过程，逐渐趋于成熟完善，中西医亦有互通互补之处，本文对恶性肿瘤转移相关机制的现代医学成果进行综述，以期为恶性肿瘤转移的防治提供更多理论依据及诊疗思路。 　　1 相关学说 　　1.1 “解剖和机械”学说 　　“解剖和机械”学说认为，某些原位肿瘤细胞随着血流或淋巴流在其最先到达脏器的毛细血管或毛细淋巴管发生机械性滞留，并穿过血管在局部增殖，从而形成转移灶。 　　1.2 “种子与土壤”学说 　　英国学者Paget于1889年提出了“种子和土壤”学说[1]，指出肿瘤细胞（种子）只能在为其提供舒适环境的相对特异的器官组织（土壤）中才能生长繁殖。 　　1.3 肿瘤遗传异质性 　　Fidler等[2]提出了肿瘤细胞的异质性学说，该理论认为在遗传表型各异的原发肿瘤内，大多数的原发肿瘤细胞转移能力很低，只有极少数细胞（估计少于千万分之一）由于突变而获得转移必须的表型，而这些细胞具备形成转移的必要条件，如细胞迁移能力、侵袭能力、蛋白溶解酶活性、促凝血、促肿瘤血管生成等。DNA突变、染色体重排和表观遗传学改变构成了肿瘤细胞基因组的内在不稳定性。细胞内在的基因组不稳定性和外部微环境适者生存的进化选择共同作用，导致肿瘤细胞对正常内环境的生长调控、免疫监视和环境抑制产生抗性，在此基础上发生连续突变和异常分化，形成肿瘤的异质性，通过有丝分裂在细胞间世代传递，且转移瘤往往比原发瘤中的细胞显示出更强的生长特性，细胞分裂指数增高。肿瘤的遗传异质性是肿瘤细胞逃避免疫监视、产生化疗抗性、形成转移复发的根源，是抗转移治疗中不可忽视的重要环节。 　　1.4 失巢凋亡抗性 　　细胞的趋化性与趋触性迁移皆依赖于细胞外基质，细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与方向。真核细胞，除成熟血细胞外，大多须黏附于特定细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为锚着依赖性，上皮细胞及内皮细胞一旦脱离了细胞外基质则会发生程序性死亡，这种因细胞与胞外基质之间失去交互作用而诱导的凋亡形式称为失巢凋亡[3]。因此，转移细胞必须对失巢凋亡以及凋亡本身产生抗性，以使自身在播散和异位定植的过程中得以存活。有研究显示，肿瘤细胞中多种有效的抗凋亡基因（如Bcl-2，Bcl-XL）出现异位过表达，使它们对死亡刺激信号产生高度抗性，且往往伴随survivin途径的激活、基质金属蛋白酶（MMP）的上调、局部黏着斑激酶（FAK）的过表达以及p53的失活，从而增加了转移效率[4]。 　　1.5 血管与淋巴管生成 　　肿瘤转移这一复杂的过程包括：原发瘤发展为侵袭性肿瘤，肿瘤细胞侵袭基底膜，肿瘤细胞进入淋巴系统和血液循环系统并随之在体内转移，在循环系统中形成瘤栓并转运到远处靶器官，滞留于靶器官微血管中，穿出血管并形成微小转移灶，肿瘤血管形成并在继发组织器官继续生长这几个阶段[5]。肿瘤细胞进入血液淋巴系统后就离不开血管与淋巴管，血管与淋巴管生成关系到肿瘤细胞能否在转移器官安家，因为没有血管与淋巴管提供充足的养分，肿瘤细胞无法增殖，转移灶自然无法继续长大，肿瘤生物学证据表明，肿瘤生长、侵袭与转移高度依赖新生血管的形成，当瘤体增长至2～3 mm3时，如果没有新生血管形成，肿瘤组织将保持休眠或退化状态，因此，抑制血管与淋巴管新生是控制转移的一个关键点。 　　活血化瘀中药在抗肿瘤血管新生方面具有良好疗效，其机制[6]主要为：抑制肿瘤血管生成促进因子（血管内皮生长因子VEGF、微血管密度MVD等）的表达；直接抑制内皮细胞增殖，如雷公藤红素、槲皮素、白芨提取物等；抑制胞外基质金属蛋白酶（MMP）的活性途径，如蝎毒多肽提取物、姜黄素；与健脾益气中药的协同作用，两者结合可改善机体内环境，抑制肿瘤血管生成。 　　1.6 肿瘤休眠 　　肿瘤细胞离开原发灶到达转移靶器官定居后可继续生长，短期内形成新的肿瘤灶，但并不是所有的具有形成转移能力的肿瘤细胞到达转移靶器官后就立即开始进入增殖的细胞周期，而是部分作为静息期的细胞定居下来，在相当长的时间内处于稳定状态而不会形成新的转移灶，即肿瘤细胞休眠[7]。临床统计发现，患者原发肿瘤根治性切除后，可在数年乃至数十年后再次增殖形成转移灶，原发乳腺癌手术切除后20年间无肿瘤复发临床症状的患者血液中仍能检测到休眠肿瘤细胞，这些为肿瘤休眠提供了直接证据。 　　目前研究发现，免疫逃逸是肿瘤休眠发生或激活的关键机制之一[8-9]，中医防止肿瘤术后复发和转移治疗上强调“扶正祛邪”、“截断传舍”，和肿瘤休眠有异曲同工之妙，也就是通过增强免疫监视将残癌细胞维持极低数量并且促进尽可能多的残癌细胞处于休眠状态，已证实健脾化瘀治疗有这方面效应。 　　1.7 微环境 　　恶性肿瘤的研究与治疗从原来针对单一的肿瘤细胞向微环境演进，相应地治疗也更有靶向性，目前提出了多种治疗靶点：血管生成抑制剂、信号传导通路抑制剂、细胞因子抑制剂、细胞外基质 （ECM）降解抑制剂、肿瘤干细胞抑制剂等[10]。 　　肿瘤转移过程复杂，在转移过程中，肿瘤细胞的游离、迁移、侵袭、适应和重新黏附涉及到基质降解酶和各种细胞活动，每一步的进行都有微环境的参与，其中的微环境包括间质细胞、细胞外基质、不同部位的肿瘤微环境、不同部位肿瘤微环境的相互作用，另外还有各种生长因子、转录因子等的调节，肿瘤细胞与微环境之间似乎上演着正邪的斗争，肿瘤细胞是一团邪气，微环境是正气，两者之间微妙的斗争共同决定病情的转向。 　　中医药通过调控肿瘤微环境稳态从而影响复发转移，主要表现在[11-12]：扶助正气为主中医调控免疫微环境；活血化瘀为主中药调控肿瘤微环境，“肿瘤血管新生”机制影响肿瘤转移；消痰散结为主中药调控黏附分子表达进而调控肿瘤微环境。 　　1.8 上皮间质转化与肿瘤转移 　　1.8.1 EMT概念 上皮间质转化（EMT）是指具有极性的上皮细胞转换成具有活动能力、能够在细胞基质间自由移动的间质细胞的过程，它以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为重要特征[13]，这种表型的转换允许肿瘤细胞摆脱细胞――细胞间连接而表现得更具侵袭性。 　　1.8.2 EMT的发生机制 EMT的发生是一个动态的、多步骤的过程，包括细胞间黏附的丧失、肿瘤基底膜和细胞外基质的破坏以及细胞骨架的重构而导致细胞运动性增强和迁移的产生[14]。EMT的发生涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，目前，其具体机制尚未完全阐明，可能与钙连接素、生长因子、转录因子及微环境等有关。 　　钙连接素：钙连接素（cadherin）是一种跨膜糖蛋白，主要参与细胞间的连接，分为E-cadherin，P-cadherin和N-cadherin 3种，其中E-cadherin被视为EMT的主要调控者，其表达的下调是EMT发生的限速步骤，E-cadherin通过细胞内外黏附功能，维持细胞间连接及上皮细胞诸多功能。也有专家研究发现，N-cadherin可促进肿瘤细胞迁移和转移，而且其作用可以和E-cadherin介导的细胞间黏附作用相当[15]。 　　生长因子：EMT的发生受多种生长因子的调控，如肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等，这些生长因子可与上皮细胞表面的相应受体结合，经不同的信号转导通路，影响细胞黏附分子与细胞骨架的功能。TGF-β是在大多数癌细胞中过度表达的多功能细胞因子，其在肿瘤发展中具有双重作用。在肿瘤发生的早期，TGF-β可抑制原发肿瘤的生长；而在肿瘤发展后期，通过促进EMT、侵袭和细胞迁移来促进肿瘤演进[16]。HGF是原癌基因C-met的配体，可以通过改变癌细胞表面E-cadherin的分布和活化PI3K与ERK1/2信号途径而促进肿瘤癌细胞的侵袭与转移[17]。IGF可以诱导β-连环素从上皮细胞表面转移到核内，同时使胞内E-cadherin的表达降低，促进EMT的快速转化[18]。EGF可以促进受损表皮的修复与再生，活化蛋白激酶（MAPK）及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K-Akt）途径，促进乳腺癌细胞EMT的发生[19]。还有研究表明， VEGF除参与血管生成外，也可以通过自分泌促进肿瘤细胞EMT的发生[20]。 　　转录因子：转录因子在信号转导中位于蛋白激酶下游，目前发现Snail，Slug，Twist，EF1/ZEB1，SIP1/ZEB2，E12/E47，Smad，NF-κB等转录因子与EMT密切相关。Snail与Slug同属于一个转录因子家族，两者不仅可以与Smad的相互作用蛋白（sip1）竞争性结合E-cadherin启动子区的E-box连接基序，抑制E-cadherin的表达及促进波形蛋白的表达，也可以经由形成β-连环-T细胞因子-4（TCF-4）转录复合体来促进EMT的发生[21-22]。Snail是引发EMT的核心转录因子，RTKs，TGF-β，Notch，Wnt，TNF-α和BMPs通过激发Snail进而促进EMT发生[23]。Twist蛋白也通过与E-box序列结合来抑制E-cadherin的表达，诱导EMT的发生[23]。ZEB1与SIP1同属ZEB家族，ZEB1与SIP1均能结合TGF-β信号通路中的R-Smads，并在TGF-β信号刺激下，与R-Smads-smad4复合体直接结合，调节SMA，p21，p15等多个与EMT相关的基因转录[24]。Lander等发现Ppa蛋白通过与F-box序列结合来调控Twist，Snail，Slug及Sip1，是EMT发生的普遍调节因子[25]。 　　信号转导调节：Wnt信号转导途径是一条重要的EMT信号转导通路，当Wnt蛋白与跨膜受体Frizzled结合，GSK-3β被抑制，细胞质内的β-连环蛋白不再降解而得到积累，当其积累到一定水平便转移进入核内与转录因子LEF/TCF结合并激活靶基因，引发EMT的发生[26]。另外，Wnt信号可通过下调E-cadherin被激活或者通过激活PI3K/Akt和ILK，抑制GSK-3β而达到积累β-连环蛋白，MAPK/Erk也可使GSK-3β失活而导致β-连环蛋白积累[27]。也有研究发现HMGA2，SFRP4可以激活Wnt信号通路，促进EMT发生[28-29]。所以，E-cadherin，ILK，PI3K/Akt，MAPK，HMGA2，SFRP4等都可以影响Wnt途径，共同促进EMT的诱导和维持。 　　microRNA：microRNA是一类长度为19～25个核苷酸的短链非编码RNA，参与调控肿瘤的进展，特别是侵袭与转移[30]，与肿瘤EMT相关基因表达关系密切，已成为肿瘤研究领域的热点。越来越多的参与EMT的microRNA被发现，如microRNA-200[31]，microRNA-21[32-33]，microRNA-203[34]，microRNA-655[35]等。研究较为透彻的是microRNA-200，其通过抑制ZEB1和ZEB2表达影响EMT，在发生EMT的细胞中microRNA-200表达明显下降， microRNA-200系列的microRNA-200a[36]，microRNA-200c[37]也发现与EMT相关。 　　肿瘤微环境：肿瘤微环境是指在肿瘤细胞周围区域中与其相互作用的非肿瘤细胞与基质，包括细胞外基质、成纤维细胞、肌纤维母细胞以及免疫细胞等。肿瘤细胞能够从周围微环境中募集成纤维细胞，使其激活并通过细胞外基质、生长因子、血管因子和蛋白激酶等影响肿瘤细胞的生长、侵袭和转移[38]。另外，肿瘤微环境中与肿瘤转移相关的还有转化生长因子、肿瘤相关巨噬细胞、趋化因子及其受体、凝血酶等，当肿瘤细胞在其微生态位中与纤维原细胞、粒细胞、巨噬细胞等不同基质的细胞接触时，这些细胞能释放信号物质诱发EMT发生，导致肿瘤细胞侵袭力增强[39]。肿瘤微环境在促进肿瘤转移时主要发挥三方面的作用，抑制免疫反应、促进血管新生和孕育肿瘤干细胞[40]。肿瘤的侵袭和转移是肿瘤细胞、宿主和肿瘤微环境之间一系列复杂、多步骤、多因素相互作用的贯序过程。 　　1.8.3 EMT的中医药研究 中药单体及复方表现出优良的抗EMT效果，目前已经发现的有效单体有姜黄素、槲皮素、木犀草素、白藜芦醇、丹参酮ⅡA等，复方有胃肠安、扶正抑癌方、肺岩宁等[41]。其具体机制和上诉机制相似，多靶点、多通路，但较之放化疗药物毒副作用小、耐药性弱。 　　1.9 肿瘤干细胞与肿瘤转移 　　1.9.1 概念 2006年美国癌症研究协会肿瘤干细胞研究小组一致将肿瘤干细胞定义为“存在于肿瘤组织中的具有无限自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞”[42]。 　　1.9.2 肿瘤干细胞的特点 肿瘤干细胞兼具干细胞和肿瘤细胞两者的特点，肿瘤干细胞的特征主要表现为[43]：第一，肿瘤干细胞具有无限的自我更新和分化潜能，但不受微环境对肿瘤干细胞增生的抑制作用调控，肿瘤干细胞扩增性生长，肿瘤干细胞数目增加。第二，肿瘤干细胞突破正常干细胞迁移性的局限，呈侵袭性生长，是肿瘤浸润和转移的基础。第三，肿瘤干细胞在肿瘤中的含量低，但具有高致瘤性，且对治疗药物不敏感。 　　1.9.3 肿瘤干细胞与肿瘤转移的机制探讨 肿瘤干细胞以其独有的特性成功解释了肿瘤转移的休眠现象、遗传异质性等难题，成为肿瘤研究的热点。随着肿瘤干细胞研究进程的推进，转移肿瘤干细胞[44]、癌前干细胞[45]、静止肿瘤干细胞、迁移的肿瘤干细胞[46]等概念被提出，对肿瘤干细胞的分类更细致，功能定位更明确，认为迁移的肿瘤干细胞是诱发转移的主要因素。但肿瘤干细胞与转移的机制尚待进一步深入研究探讨。 　　肿瘤干细胞的特性决定了“种子”的顽强生命力。肿瘤干细胞的自我更新、分化与迁移性：Luzzi等[47]研究发现，尽管90%的肿瘤转移细胞在开始时能从原发瘤处“逃逸”，但最终到达预转移处形成微转移灶的却只有不到2%的细胞，而最后能产生临床上明显的转移灶的肿瘤转移细胞仅为0.02%。这充分说明了肿瘤转移是一个无效率的行为，同时，这也意味着能完成这一完整过程的肿瘤细胞具备一定的内在特性，能在转移处的微环境中维持自我生长并大量增殖，而肿瘤干细胞正是这种细胞的最佳候选者。因为肿瘤干细胞来源于多次突变的细胞或肿瘤细胞，具有异质性，其又有分化潜能，当受到微环境刺激时，激活静止的肿瘤干细胞，活化、分裂、增殖，浸润转移，形成转移灶。 　　肿瘤干细胞的耐药性：张英等[48]将肿瘤干细胞的耐药机制总结为①对常规放化疗的耐药。由于肿瘤干细胞同正常干细胞一样，处于相对静止状态，多处于GO期，而大多数细胞毒药物治疗癌症的靶点都是处于S，M或G2期的细胞，所以肿瘤干细胞可以逃避药物的杀伤作用，在传统的针对增殖性肿瘤细胞的各种治疗中得以存活。②对免疫治疗药物的耐药。免疫治疗的靶细胞表面必须表达肿瘤特异性蛋白，而这些蛋白只能选择性地表达于分化的肿瘤细胞，而肿瘤干细胞并不表达这些抗原，所以可以在免疫治疗中幸存。③对分子靶向药物的耐药。所有的这些耐药机制，使肿瘤干细胞能在常规的肿瘤治疗后存活。虽然瘤体变小、肿瘤细胞被清除，但残留的肿瘤干细胞具有自我更新及多向分化功能，在适宜的条件下又可以再度增殖导致肿瘤的复发和转移，这也就是很多肿瘤患者5年之后仍会转移的原因。 　　肿瘤干细胞微环境决定了“土壤”的适宜性。肿瘤干细胞微环境由肿瘤血管床、间充质细胞及细胞外基质等多种细胞及组织结构组成，其内部的支持细胞与正常干细胞微环境的支持细胞在表型和功能方面都不同，是癌化的间质细胞[49]。干细胞功能受内在和外在的双重机制调控，Wnt，notch，shh等促细胞增殖通路参与多种干细胞自我更新功能调控，被视为干细胞的内在调控机制；微环境的信号因子，如BMP，TGF-β等，通过微环境细胞间的旁分泌作用调控干细胞的功能，被视为干细胞外在的调控机制[43]。 　　通常情况下，微环境通过提供抑制细胞增殖和生长的信号来保持干细胞最初的休眠状态，只有在接受刺激信号后，可以理解为微环境的改变超过可调控限度，干细胞才活化、分裂和增殖。肿瘤干细胞微环境维持肿瘤的稳态，肿瘤干细胞则处于静止状态，肿瘤和人体和平相处，而一旦微环境稳态破坏，其又促进肿瘤干细胞的增殖分化及转移。 　　中医药对肿瘤干细胞的干预治疗。中医药对肿瘤干细胞的干预治疗尚处于研究阶段，已发现的干预机制有[50]：逆转肿瘤干细胞耐药、诱导肿瘤干细胞凋亡、影响肿瘤干细胞增殖分化、影响肿瘤干细胞信号转导通路、调节机体免疫功能。 　　2 各种学说与恶性肿瘤转移的关系 　　“解剖与机械”学说的提出理论似乎有其合理性，但对大量恶性肿瘤转移的临床特征缺乏其合理性，如其不能解释某些肿瘤对转移脏腑具有亲和性，而不是就近原则，也不能解释肿瘤休眠、肿瘤遗传异质性、失巢凋亡抗性等现象。 　　“种子与土壤”学说在提出后的很长一段时间里未被予以足够重视，人们过度关注肿瘤细胞，忽视了肿瘤细胞生存的“土壤”。直至EMT、微环境学说的提出，人们开始认识到“土壤”的重要性。 　　肿瘤遗传异质性、失巢凋亡抗性、血管与淋巴管生成、肿瘤休眠等现象的发现增进了人们对肿瘤转移的认识，也是其他学说提出的基础。 　　肿瘤干细胞学说是“种子与土壤”学说的深化，可以认为Paget当时所说的“种子”可能就是肿瘤干细胞，而肿瘤干细胞的原发部位及转移部位的微环境（小生境）就是其生长的“土壤”。肿瘤干细胞学说不仅将肿瘤转移的各种机制串联起来，而且对传统的肿瘤治疗策略进行了一次洗礼，从杀灭肿瘤细胞向靶向杀灭肿瘤干细胞转变，为肿瘤治疗提供了一个新方向。 　　大多数恶性肿瘤转移伴随EMT的发生，可以认为EMT是转移的初始阶段，发生了EMT的肿瘤细胞更具侵袭转移能力。EMT和肿瘤干细胞学说关系密切， EMT可使肿瘤细胞获得自我更新能力而具有干细胞的特性，从而促进肿瘤干细胞的产生[51]；肿瘤干细胞也可发生EMT成为转移的肿瘤干细胞从而促进转移的发生。将EMT和肿瘤干细胞学说相融合，可以加快恶性肿瘤机制及其治疗的研究进程。 　　3 展望 　　以上多种学说并不是孤立的，而是一脉相承，逐步深入，相互联系，越来越接近肿瘤转移的本质。肿瘤干细胞学说目前被普遍认可，如果可以明确肿瘤干细胞与肿瘤侵袭转移之间的关系，消灭或阻断肿瘤干细胞从原发灶通过肿瘤间隙侵入血管、循环系统血管和淋巴管并迁移定居中任何一步，使得肿瘤局限于原发灶，这样便可完整切除肿瘤，提高患者术后生存率和生活质量。如果能成功开发研制靶向杀灭肿瘤干细胞的药物，如果能改变肿瘤干细胞生存所必须的微环境，如果能阻断肿瘤干细胞发生EMT等，如果能发现肿瘤干细胞的血液标志物，恶性肿瘤转移发生率会大大降低。 　　然而，肿瘤干细胞与肿瘤转移的机制尚不明确，肿瘤干细胞的分化、自我更新、休眠或再次增殖、对炎症因子的趋化性、对细胞毒性药物的抵抗性都是由各种复杂的分子机制调控的。目前虽然发现多种恶性肿瘤转移的发生均伴有EMT的发生，但EMT发生涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，其具体机制尚未完全阐明。 　　虽然恶性肿瘤转移的分子调控机制不甚明了，但是已经取得突破性进展，研究者需要坚定信心，开拓思维，并要充分吸收中医药抗肿瘤的优势，加大中医药抗肿瘤的机制研究。 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The emerging ″cancer stem cell″ theory successfully explains phenomenon such as tumor genetic heterogeneity， anoikis resistance， tumor dormancy， providing more new targets and ideas for the diagnosis and treatment of cancer metastasis. 　　[Key words] modern medicine； cancer； metastasis mechanism； epithelial-mesenchymal transition； cancer stem cell 　　doi：10.4268/cjcmm20141507 　　[责任编辑 陈玲]