3T3-L1细胞培养
一、复苏冻存的3T3-L1细胞
1 从液氮罐中用镊子拿出冻存的细胞,迅速放入37 ℃浴中,溶解约1min 取出(要留小部分冰不融化)。
2 打开前用75%的酒精清洗冻存管外壁,打开后,移入小号培养瓶,立即加入4~5mL培养基,稀释DMSO,然后放入培养箱。
二、冻存的3T3-L1细胞
1 当细胞长到70~80%时,消化细胞。去除培养基,用5mL 1*PBS 洗去残留培养基,加入1mL 胰酶,轻晃培养瓶,使胰酶覆盖整个培养瓶底部,放入培养箱消化2~3min。 2 加入3~4mL DMEM(10%NBS) 终止消化,轻轻吹打使细胞均匀。
3 取1/5的量移入大培养瓶继续培养。
4取700uL加入冻存管中,,向冻存管中加入100uL DMSO,200uL FBS。放入程序降温盒,再放入-80度冰箱过夜,第二天拿出放入液氮罐,记录存放位置。
5 每消化一次,细胞代数增加一次,要记录清楚。
三、3T3-L1细胞换液
1 新复苏或消化的细胞,在种入新培养瓶5~6h或过夜后,观察细胞贴壁情况。 2 每两天换一次液;待细胞长到70~80%时,进行消化,消化步骤如上所述。
四、种入24孔板
1 种入24孔板前,细胞要进行消化,步骤如上所述。
2 计算好传代和种入板中的量。如:大号培养瓶中细胞长到70~80%进行消化,加入
1.5mL胰酶消化,加入4mL 培养基终止消化。其中0.5mL用于继续培养,剩余5mL, 每一24孔板需要1/5的量。
3 24孔板事先铺0.5%的明胶。
注意事项:
1 从液氮中拿出冻存管时尽量不要用手碰,以免冻伤。
2 冻存管取出后迅速放入水浴中,培养基使用前可以先用37度预热。
3 冻存管打开前要用酒精消毒,防止污染。
4 尽快加入培养基稀释DMSO,防止DMSO对细胞毒性作用。
5 冻存复苏细胞遵循“慢冻快融”原则。
6 程序降温盒内是异丙醇,用5次更换一次异丙醇。
7 若没有程序降温盒,可将细胞放入4度冰箱1h,-20度冰箱1h,再放入-80度过夜。 8 贴壁细胞早期开始冻存,70~80%进行消化冻存。
五、3T3-L1细胞培养专用培养基
10%NBS 500mL, 10%FBS 500mL
DMEM:Dulbecco’s Modified Eagle Medium (High glucose; 粉末)
With : L-glutamine
Pyridoxine hydrochloride
Sodium pyruvate
Sodium bicarbonate
1 DMEM粉末(13.4g)+3.7g NaHCO3+双蒸水定容至1L。
2 加入抗生素10mL(1%),分成两个500mL, 一个加入NBS 50mL(10%),另一加入FBS 50mL(10%),调pH至7.2~7.4。
3 先在外面过滤培养基,0.45um的滤膜过滤一遍,0.22um的滤膜再过滤一遍。
4 再将培养基纳入超菌台中,用事先灭菌的过滤器过滤一遍(两层0.22um滤膜),过滤完后装入500mL试剂瓶中,4度保存。
P.S. 1 3T3-L1细胞培养时用含10%NBS的培养基,诱导时用含10%FBS的培养基。 2 过滤时可先过滤含NBS的培养基,再过滤含FBS的培养基。
六、明胶处理培养板
1 0.5%明胶: 0.5g 明胶,100mL DW 溶解,高压灭菌,再用0.22um过滤器过滤一次。 2 每孔加入0.5 mL明胶,待全部加完后,再一次吸出(回收),将培养板置于无菌台内干燥2~3h,期间紫外照射。
3 封板,用保鲜袋将处理好的培养板无菌封闭,储存备用。
七、 固定细胞,油红染色
1 将24孔板中培养基吸出后,用1*PBS 0.5mL/孔清洗两遍。
2 用4%甲醛固定细胞,暗处1h。
3 用无菌水0.5mL/孔洗两遍,再用100%丙二醇0.5mL/孔清洗2min。
4 加入0.5%油红0.5mL/孔染色。
5 染色结束后,吸出染液,用98%丙二醇清洗一遍,5min。
6 用85%丙二醇洗三遍,每遍5min。
7 加入1*PBS,拍照。
8 拍照完成后,加入无水乙醇0.2mL/孔,洗出油红,5min。每孔吸出150uL加入96孔板中,测OD值。