第１７卷第１６期２００７年８月
中国现代医学杂志
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｄｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅ
１００５－８９８２（２００７）１６－１９２７－０４
Ｖｏｌ．１７Ｎｏ．１６
Ａｕｇ．２００７
文章编号：
论著・・
重组人脂联素真核表达载体的构建及表达＊
佘其美１，石献忠２，王长江３，王佑民３，代
芳３，杨明功３
（１．北京市石景山医院内分泌科，北京１０００４３；２．北京大学医学部人体解剖学教研室，
北京１０００８３；３．安徽医科大学第一附属医院内分泌科，安徽合肥２３００２２）
摘要：目的
为进一步研究脂联素（ＡＤＰＮ）的功能提供实验基础，构建含重组人脂联素（ｈＡＤＰＮ）真核表
酶切载有人脂联素ｃＤＮＡ的重组克隆质粒ｐＭＤ１８－Ｔ和真核表达质粒
达载体的３Ｔ３－Ｌ１细胞株。方法
转化大肠杆菌ＪＭ１０９，筛选阳性克隆，经酶ｐｃＤＮＡ３．１＋，回收目的基因片段与线性化的真核表达质粒，经连接、
切和核苷酸序列测定鉴定。脂质体法转染３Ｔ３－Ｌ１细胞，Ｇ４１８筛选阳性细胞克隆扩增，通过ＲＴ－ＰＣＲ的方法逆转录合成脂联素基因片段。结果重组真核表达质粒酶切后获得５．４ｋｂ和８００ｂｐ两个片段，大小与理论值一致。并经核苷酸序列测定证实。ＲＴ－ＰＣＲ产物经凝胶电泳后于紫外分析仪下可见在２５０ｂｐ前有一清晰条带，和扩增目的基因片段长度２３４ｂｐ一致。结论成功地构建了人重组脂联素真核表达质粒并在３Ｔ３－Ｌ１细胞中稳定表达。
关键词：
脂联素；真核表达；３Ｔ３－Ｌ１细胞
中图分类号：
Ｒ５８９．２；Ｒ３９４．３文献标识码：Ａ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｗｉｔｈｈｕｍａｎｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｃＤＮＡ＊
ＳＨＥＱｉ－ｍｅｉ１，ＳＨＩＸｉａｎ－ｚｈｏｎｇ２，ＷＡＮＧＣｈａｎｇ－ｊｉａｎｇ３，ＷＡＮＧＹｏｕ－ｍｉｎ３，ＤＡＩＦａｎｇ３，ＹＡＮＧＭｉｎｇ－ｇｏｎｇ３
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ＳｈｉｊｉｎｇｓｈａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＢｅｉｊｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４３，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ；２．
Ａｎａｔｏｍｙｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｃｅＣｅｎｔｅｒ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８３，Ｐ．Ｒ．
Ｃｈｉｎａ；３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＡｎｈｕｉ
ＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ２３００２２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｔｏｐｒｏｖｉｄｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇｏｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ（ＡＤＰＮ）ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｗｈｏｓｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ３Ｔ３－Ｌ１ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．【Ｍｅｔｈｏｄｓ】Ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉ－ｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＭＤ１８－Ｔ／ｈＡＤＰＮａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐｃＤＮＡ３．１＋ｗｅｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙｔｗｏｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅｅｎ－ｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｎｄｈＡＤＰＮａｎｄｌｉｎｅａｒｐｃＤＮＡ３．１＋ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ，ｔｈｅｎ，ｔｈｅｙｗｅｒｅｌｉｎｋｅｄａｎｄｔｒａｎｓｌａｔｅｄｉｎｔｏＪＭ１０９，ａｎｄａｔｌａｓｔ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｃＤＮＡ３．１＋／ＡＤＰＮｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄａｎｄｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｄｉｇｅｓｔｏｆｒｅｓｔｒｉｃｔｉｖｅｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅａｎｄｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ３Ｔ３－Ｌ１ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇＳｕｐｅｒＦｅｃｔＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）．ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔｂｙＧ４１８，ａｎｄｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄａｇａｉｎ．ＴｈｅａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｃＤＮＡｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙａｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｂｙｕｓｉｎｇｔｈｅｔｏｔａｌＲＮＡａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ，ａｎｄｔｈｅｎｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗａｓｓｙｎ－ｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙＰＣＲｂｙｔｈｅｃＤＮＡａｓａｔｅｍｐｌａｔｅ．【Ｒｅｓｕｌｔｓ】８００ｂｐｆｒａｇｍｅｎｔａｎｄ５．４ｋｂｆｒａｇｍｅｎｔｗｅｒｅｃｏｎｓｉｓｔａｎｔｗｉｔｈ
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ＴｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｔｈｅｏｒｅｔｉｃｖａｌｕｅｓａｆｔｅｒｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｗａｓｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＨｉｎｄⅢａｎｄＥｃｏＲⅠ．【
ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｗｉｔｈｃｏｍｐｌｅｔｅａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｃＤＮＡｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ；ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ；３Ｔ３－Ｌ１ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ
目前认为脂肪组织不仅是一个能量储存库，还
收稿日期：２００７－０３－０８
能产生多种调控机体代谢和能量平衡的分泌性蛋
＊基金项目：安徽省自然科学基金资助（０３０４３７１９）
中国现代医学杂志第１７卷
白，影响机体的代谢。新近发现的脂联素（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，质粒。
ＡＤＰＮ）是脂肪组织分泌的一种特异性蛋白质，由于
其新的功能不断地被研究和发现，人们对它的认识愈来愈深入，普遍认为脂联素是与肥胖和胰岛素抵抗有关的一个重要脂肪因子。本研究旨在构建含重组人脂联素真核表达载体的３Ｔ３－Ｌ１细胞株。为进一步研究脂联素的功能及调控机制提供实验基础。
１．．２．４重组ｐｃＤＮＡ３．１＋－ｈＡＤＰＮ稳定转染３Ｔ３－Ｌ１
在超净工作台上按照ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ
细胞与筛选
ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ操作说明使重组ｐｃＤＮＡ３．
１＋－ｈＡＤＰＮ转染３Ｔ３－Ｌ１细胞，改用含６００μｇ／ｍＬ
双抗的ＤＭＥＭ高糖筛选培养液筛选Ｇ４１８、１０％ＦＢＳ、阳性细胞集落。
１
１．１
材料与方法
材料
载有人全长脂联素编码区ｃＤＮＡ的重组克隆质
１．．２．５转染的鉴定按ＱＩＡＧＥＮ公司提供Ｒｎｅａｓｙ
Ｍｉｎｉｋｉｔ说明书进行操作提取３Ｔ３－Ｌ１细胞总ＲＮＡ量。根据二步法ＲＴ－ＰＣＲ试剂盒要求，进行逆转录
及ＰＣＲ反应。逆转录反应体系为２０μＬ反应体积的混合物如下：ＲＮＡ２μＬ（１μｇ），５×ＡＭＶＢｕｆｆｅｒ
粒ｐＭＤ１８－Ｔ／ＡＤＰＮ系本实验室构建［１］，限制性内切酶ＨａｎｄⅢ、引物、核糖ＥｃｏＲⅠ、ＡＭＶ反转录酶ＸＬ、核酸酶抑制剂、ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ酶、ｄＮＴＰｓ和ＤＮＡ
４μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）８μＬ，Ｒｎａｓｉｎ（４０ｕ／μＬ）０．５μＬ，ＡＭＶ（５ｕ／μＬ）２μＬ，Ｏｌｉｇｏｄ（Ｔ）１８（３０．５ｐｍｏｌ）２．５μＬ，ＤＥＰＣ－ｔｒｅａｔｅｄｗａｔｅｒ１μＬ。混匀，短暂离心１５ｓ。室温下放置１０ｍｉｎ。４２℃静置１．５ｈ。９９℃
静置５ｍｉｎ。冰水中冷却５ｍｉｎ。ＰＣＲ反应体系总体积５０μＬ，ｃＤＮＡ１０μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，
Ｍａｒｋｅｒ购自大连宝生生物工程有限公司，Ｔ４ＤＮＡ连
质粒提取试接酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，胶回收试剂盒、
剂盒及总ＲＮＡ提取试剂盒（ＲｎｅａｓｙＭｉｎｋｉｔ）购自
ＱＩＡＧＥＮ公司，ＪＭ１０９菌种和真核表达质粒ｐｃＤ－
ＮＡ３．１＋载体由安徽医科大学寄生虫教研室惠赠。３Ｔ３－Ｌ１细胞株购自中国科学院生科院细胞资源中
心。高糖ＤＭＥＭ培养液购自ＧＩＢＣＯＢＲＬ公司产品，ＴＢＤ特级胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所。
Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ上游引物２μＬ，Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ下游引物２μＬ，β－ａｃｔｉｎ上游引物２μＬ，β－ａｃｔｉｎ下游引物２μＬ，Ｔａｑ酶０．５μＬ，１０×ＴａｑＢｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋）５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ２４．５μＬ。９４℃预变性１ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ、５８℃退火３０ｓ、７２℃延伸１ｍｉｎ（共循环３０次），最后７２℃延伸４ｍｉｎ。
１．２方法
１．２．１ｐＭＤ１８－Ｔ／ＡＤＰＮ和ｐｃＤＮＡ３．１＋的双酶切
根据真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１＋上的多克隆位点和
２
２．１
结果
克隆ｐＭＤ１８－Ｔ／ＡＤＰＮ的双酶切
ｐＭＤ１８－Ｔ／ＡＤＰＮ质粒酶切位点图谱，选定ＨａｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ分别做双酶切。酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，按ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ操作步骤分别回收目的基因片段和线性化ｐｃＤＮＡ３．１＋。紫外分光
光度计测定其浓度。
ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ双酶切ｐＭＤ１８－Ｔ／ＡＤＰＮ，得约２．６ｋｂ和８００ｂｐ，与理论值一致，见图１。２．２质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１＋的双酶切
ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ双酶切质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１＋，得约５．４ｋｂ和４２ｂｐ，见图１。
５
４
３
２
１
７５００ｂｐ５０００ｂｐ２５００ｂｐ２０００ｂｐ１０００ｂｐ７５０ｂｐ５００ｂｐ
１．２．２连接反应按照载体与目的基因的量为１∶３比例，取３μＬ线性化载体ｐｃＤＮＡ－３．１＋和４μＬ回收的脂联素目的基因片段混匀，再加入Ｔ４ＤＮＡ连接酶及连接缓冲液１５℃连接过夜。１．２．３
转化和克隆挑选
取大肠杆菌ＪＭ１０９按氯
化钙法制备感受态细胞［２］。将连接反应液１０μＬ加入２００μＬ新鲜感受态细菌中，冰上置３０ｍｉｎ，４２℃热休克９０ｓ，冰上置２ｍｉｎ，加入８００μＬＬＢ液体培养基，温和振摇１ｈ，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃去大部分上清，留２００μＬ充分混匀后均匀涂在含氨卞青的选择性ＬＢ培养基上，３７℃恒温培养１６ｈ，筛选阳性克隆，小量提取质粒后，初步筛选出可能的重组
注：１泳道：２０００＋１５００ｂｐＭａｒｋｅｒ；２泳道：重组脂联素真核表达质粒ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ的双酶切；３泳道：重组脂联素真核表达质粒
ＨｉｎｄⅢ的单酶切；４泳道：质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１＋ＨｉｎｄⅢ的单酶切；５泳道：质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１＋
图１ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲＩ酶切图谱
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第１６期佘其美，等：重组人脂联素真核表达载体的构建及表达
２．３真核表达重组子的酶切分析
ＨｉｎｄⅢ、ＥｃｏＲＩ双酶切真核表达重组子，得约５．４ｋｂ和８００ｂｐ，ＨａｎｄⅢ单酶切得６．２ｋｂ，均与理论值一致，见图１。
２．４重组片段的ＤＮＡ测序分析
人ＡＤＰＮ核苷酸测序证实是定向插入，见图２。可判定脂联素的全长片段是正向插入真核表达载体中。
ＮＡ３．１＋－ｈＡＤＰＮ的３Ｔ３－Ｌ１前脂肪细胞总ＲＮＡ为模板，特异性地扩增出约２３４ｂｐ和３７３ｂｐ２条目的条
带，与理论值相吻合。而未转染和转染空载质粒组只特异性地扩增出３７３ｂｐ１条目的条带，见图５。
１
２０００ｂｐ７５０ｂｐ５００ｂｐ２５０ｂｐ１００ｂｐ
３７３ｂｐ２３４ｂｐ
２
３
４
图２人ＡＤＰＮ测序的部分结果注：１：ＤＮＡＤＬ２０００分子量标准；２：转染脂联素真核表达质粒的
２．５ｐｃＤＮＡ３．１＋－ｈＡＤＰＮ稳定转染３Ｔ３－Ｌ１细胞
实验组的器皿中长出多个细胞集落，见图３，而
３Ｔ３－Ｌ１细胞的ＲＴ－ＰＣＲ产物电泳图；３：转染空载质粒的３Ｔ３－Ｌ１细胞的ＲＴ－ＰＣＲ产物电泳图；４：未转染的３Ｔ３－Ｌ１细胞的ＲＴ－ＰＣＲ产物电泳图
的筛选
阴性对照组器皿中无细胞集落生长。
图５３Ｔ３－Ｌ１细胞的ＲＴ－ＰＣＲ产物电泳图
３讨论
脂肪组织分泌的一ＡＤＰＮ是由ａｐＭ１基因编码、
种类胶原样蛋白质，Ｃ末段结构同胶原Ⅹ、Ⅷ和Ｃ１ｑ显著相似［３］。在正常人血浆ＡＤＰＮ浓度约１．９￣１７．０
ｍｇ／ｍＬ，女性血浆中ＡＤＰＮ的含量高于男性，而在肥胖人群中较低，约３．７ｍｇ／ｍＬ［４］。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析显
示ａｐＭ１ｍＲＮＡ仅在脂肪组织中表达，在骨骼肌、小
图３
Ｇ４１８筛选阳性细胞克隆
２．６总ＲＮＡ的质量和浓度
用７５４紫外分光光度计测得：Ａ２６０＝０．１２５，Ａ２８０＝
肠、胎盘、子宫、卵巢、肾脏、肝、肺、脑或心脏中未检其基因定位于３ｑ２７，长１６ｋｂ，由３个测到其表达［３］。
外显子和２个内含子构成。该基因编码产物为２４４个氨基酸多肽，包含一个公认的氨基末端信号序列、一个小的非螺旋区、一段２２个胶原重复延伸序列和一个球型区域［３，５］。
０．０６９，总ＲＮＡ的浓度＝Ａ２６０×４０×稀释倍数
／１０００＝１μｇ／μＬ，总ＲＮＡ的总量＝浓度×１０＝１０
取３Ｔ３－Ｌ１细胞总ＲＮＡ，经凝胶电泳后，紫外灯μｇ。
下呈现清晰的２８、１８和５ｓ３条带，２８ｓ／１８ｓ约为
２∶１，表明总ＲＮＡ无降解，见图４。
ＨＥＩＬＢＲＯＮＮ等［６］发现给大鼠注射重组脂联素
能增加肌肉对葡萄糖的摄入和脂肪酸氧化，减少肝脂肪酸摄入和糖异生产生，以及改善整体胰岛素抵抗。在许多研究中，低水平血脂联素显示与胰岛素
２８ｓ１８ｓ
抵抗和各种临床代谢综合症有关。在青少年中也发现脂联素有此作用［７］。ＹＯＫＯＴＡ等［８］研究证实脂联素有可能成为炎症性疾病的一个新治疗措施。此外，脂联素是目前被发现胰岛素抵抗下调的唯一物质。如果将脂联素基因连到载体上，通过有效的途径导入体内提高起表达量以改善胰岛素抵抗。但脂联素病理生理作用及其作用机制尚未明确，它作用于靶组织及细胞，特别是对脑、肝和骨骼肌的作用机制、
５ｓ
图４３Ｔ３－Ｌ１细胞总ＲＮＡ电泳图
２．７ＲＴ－ＰＣＲ产物电泳分析
根据已知序列设计的引物，以稳定转染ｐｃＤ－
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中国现代医学杂志第１７卷
受体及其结构、对胰岛素抵抗的改善及其抗动脉粥样硬化的作用机制以及与游离脂肪酸、瘦素、抵抗素等脂肪组织分泌物质的相互作用关系正在深入研究，特别是在中国人群中的研究日益受到关注［９］。
本实验中真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１是一种高效
＋
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ，２００４，３９（２）：１１６－１１８．Ｃｈｉｎｅｓｅ［２］
ＤＥＶＩＳＬＧ，１９９４：１４７－１４８．
［３］ＭＡＥＤＡＫ，ＯＫＵＢＯＫ，ＳＨＩＭＯＭＵＲＡＩ，ｅｔａｌ．ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ
ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌａｄｉｐｏｓｅｓｏｅｃｉｆｉｃｃｏｌｌａｇｅｎ－ｌｉｋｅｆａｃｔｏｒ，ａｐＭ１（ａｄｉｐｏｓｅｍｏｓｔａｂｕｎｄａｎｔｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ１）［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏ－ｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１９９６，２２１（２）：２８６－２８９．
［４］ＡＲＩＴＡＹ，ＫＩＨＡＲＡＳ，ＯＵＣＨＩＮ，ｅｔａｌ．Ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌｄｅｃｒｅａｓｅｏｆ
ａｎａｄｉｐｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，ｉｎｏｂｅｓｉｔｙ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１９９９，２５７（１）：７９－８３．
［５］ＳＡＩＴＯＫ，ＴＯＢＥＴ，ＭＩＮＯＳＨＩＭＡＳ，ｅｔａｌ．Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
ｇｅｎｅｆｏｒｇｅｌａｔｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＢＰ２８）［Ｊ］．Ｇｅｎｅ，１９９９，２２９（１－２）：６７－７３．
［６］ＨＥＩＬＢＲＯＮＮＬＫ，ＭＥＫＡＣＳ，ＭＥＤＩＮＡＫＬ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｉｎ－
ｓｕｌｉｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇｒｏｌｅｏｆｔｈｅｆａｔｄｅｒｉｖｅｄｈｏｒｍｏｎｅａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ［Ｊ］．ＣｕｒｒＰｈａｒｍＤｅｓ，２００３，９（１７）：１４１１－１４１８．
［７］ＮＥＭＥＴＤ，ＷＡＮＧＰ，ＦＵＮＡＨＡＳＨＩＴ，ｅｔａｌ．Ａｄｉｐｏｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，
ｂｏｄｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｆｉｔｎｅｓｓｉｎｃｈｉｌｄｒｅｎ［Ｊ］．ＰｅｄｉａｔｒＲｅｓ，２００３，５３（１）：１４８－１５２．
［８］ＹＯＫＯＴＡＴ，ＯＲＩＴＡＮＩＫ，ＴＡＫＡＨＡＳＨＩＩ，ｅｔａｌ．Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎａ
ｎｅｗｍｅｍｂｅｒｏｆｔｈｅｆａｍｉｌｙｏｆｓｏｌｕｂｌｅｄｅｆｅｎｓｅｃｏｌｌａｇｅｎｓ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｍｙｅｌｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｆｕｎｃ－ｔｉｏｎｓｏｆｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｂｌｏｏｄ，２０００，９６（５）：１７２３－１７３２．［９］ＸＵＬＪ，ＺＨＡＮＧＭＸ，ＹＡＮＧＺＧ，ｅｔａｌ．Ｒｅｓａｒｃｈｏｆｒｅｓｉｓｔｉｎｐｒｏ－
ｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎａｂｄｏｍｉｎａｌｏｍｅｎｔａｌａｎｄｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｖｅｉｎｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｉｃｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００４，１４（１７）：１１－１５．
（张立芳编辑）
ＫＵＥＨＬＷＭ，ＢＡＴＴＥＹＪＦ．ＢａｓｉｃＭｅｔｈｏｄｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ［Ｍ］．２ｎｄｅｄ：ＮｏｒｗａｌｋＡｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，
哺乳类表达质粒，带有ＣＭＶ启动子／增强子，能在多种细胞内高效表达，并带有ＰＵＣ骨架和ＢＧＨＴｅｒ。人ＡＤＰＮ基因含脂联素全长编码序列，包含氨基端信号肽序列。测序结果与Ｇｅｎｂａｎｋ基本一致（基因登录号：Ｄ４５３７１）。无序列碱基错位，同时带有起始密码子ＡＴＧ和终止密码子ＴＧＡ。人脂联素重组真核表达质粒构建过程中，ＤＮＡ片段与载体采用定向连接，保证了脂联素基因正向插入载体。利用
３Ｔ３－Ｌ１哺乳细胞作为表达体系，能够进行正确的翻
译后加工和装配；再者，哺乳动物细胞易被重组
ＤＮＡ质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。通过ＲＴ－ＰＣＲ证明了人脂联素重组真核表达质粒转染３Ｔ３－Ｌ１细胞获得成功，且对细胞生长影响不明显。这为进一步研究ＡＤＰＮ的功能提供实验基础，并试
图为代谢综合征治疗寻找一种新途径。
参
考
文
献：
［１］ＳＨＩＺＭ，ＷＡＮＧＣＪ，ＷＡＮＧＹＭ，ｅｔａｌ．ｃＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇｏｆｃｏｍ－
ｐｌｅｔｅａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｆｒｏｍｃｈｉｎｅｓｅ［Ｊ］．
Ａｃｔａ
ＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｄｅｒｎ
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄｏｎｐａｇｅ１９26）
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ：
［１］ＭＡＮＫＴＥＬＯＷＢＮ，ＤＲＡＰＥＲＥＳ，ＡＮＮＡＭＡＬＡＩＳ，ｅｔａｌ．Ｆａｃｔｏｒｓａｆ－
ｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｃｈｒｏｎｉｃｌｕｎｇｄｉｓｅａｓｅｏｆｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙｉｎ１９８７，１９９２，ａｎｄ１９９７［Ｊ］．ＡｒｃｈＤｉｓＣｈｉｌｄＦｅｔａｌＮｅｏｎａｔａｌＥｄ，２００１，８５（１）：Ｆ３３－Ｆ３５．
［２］ＪＯＢＥＡＨ，ＢＡＮＣＡＬＡＲＩＥ．Ｂｒｏｎｃｈｏｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｙｓｐｌａｓｉａ［Ｊ］．ＡｍＪ
ＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ，２００１，１６３（４）：１７２３－１７２９．
［３］ＬＩＨＰ，ＨＥＧＪ．Ｔｈｅｎｅｗｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｃｏｌｌａｇｅｎｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅ
ａｎｄｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｉｎＩｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｌｕｎｇｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｆｏｒｅｉｇｎｍｅｄｉｃａｌｓｃｉ－ｅｎｃｅｓｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅ，２００２，２２（２）：８２－８４．
［４］ＭＡＲＳＨＡＬＬＲＰ，ＭＣＡＮＵＬＴＹＲＪ，ＬＡＵＲＥＭＴＧＪ．ＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎⅡｉｓ
ｍｉｔｏｇｅｎｉｃｆｏｒｈｕｍａｎｌｕｎｇｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｖｉａａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｙｐｅⅠｒｅｃｅｐ－ｔｏｒ［Ｊ］．ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅＭｅｄ，２０００，１６１（６）：１９９９－２００４．［５］ＭＯＲＲＩＳＯＮＣＤ，ＰＡＰＰＡＣ，ＨＥＪＭＡＮＯＳＫＩＡＱ，ｅｔａｌ．ＩｎｃｒｅａｓｅｄＤ
ａｌｌｅｌｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｔｈｅａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅｉｎｐｕｌ－ｍｏｎａｒｙｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．ＨｕｍａｎＰａｔｈｏｌ，２００１，３２（５）：５２１－５２８．
［６］ＬＩＵＸＹ，ＷＵＪ，ＸＵＥＸＤ．Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅａｎｄｏｘｙｇｅｎｆｒｅｅ
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（ＥｄｉｔｅｄｂｙＬＵＯＹｕ－ｌｉｎ）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＷｕｈａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，