中 国 生 物 工 程 杂 志
第22卷第5期
JOURNALOFCHINESEBIOTECHNOLOGY
2002年10月
重组蛋白质纯化技术
陈 浩 陈于红 朱德煦 刘建宁
(南京大学分子医学研究所医药生物技术国家重点实验室 南京 210093)
摘要 90年代以来,基因重组技术得到很大的发展,基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%~80%,因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。着重介绍了扩张柱床吸附层析技术,径向膜层析技术,灌注层析技术,液液萃取技术,置换层析技术和金属螯合亲和层析技术近年来进展情况以及它们的优缺点和应用范围。关键词 重组蛋白质 分离 纯化 层析 色谱 近年来随着对蛋白质的研究和生产的需要,基因重组技术突飞猛进,出现了很多基因工程产品,深刻地影响人类自身及其环境。而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%~80%。因此越来越多的生物工作者从事重组蛋白的分离纯化工作。
重组蛋白可在E.coli、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等体系中得到高效表达,其表达形式一般可分为:(1)细胞外的分泌表达;(2)细胞内可溶性表达;(3)细胞内不溶性表达,即产物以包涵体的形式存在
[2,3]
[1]
依据目标蛋白的物理化学性质摸索和选择一套综合上述方法的适当分离程序,以获得较高纯度的制品。
表1 蛋白质物化性质和分离纯化方法
蛋白质的物理和化学性质分子的大小和形状等电点和电荷溶解度 与其它分子的亲和性亲疏水性
分离纯化方法
密度梯度离心 超滤 透析 分子筛层析等
制备电泳 等电聚焦层析(或电泳)、离子交换层析、吸附层析等盐溶、盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀、液液萃取技术等
亲和层析、金属螯合亲和层析、共价层析等疏水层析、反相层析等
。因此对于重组蛋白的纯化要依
据其表达形式的不同,采取不同的纯化工艺。例如,当重组蛋白以包涵体形式存在时,就需要对包涵体进行变复性处理。然而不论以那种表达
形式产生的重组蛋白,其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。
与传统方式相似,重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异,即以分子的大小,形状,溶解度,等电点,亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。与此相对应的分离纯化方法参见表1。
从表1可看出,当前蛋白质的纯化主要是依靠层析和电泳技术。由于重组蛋白在组织和细胞中仍以复杂混合物的形式存在,因此到目前为止还没有一个单独或一整套现成的方法把任何,[2]
90年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。本文将着重介绍近10年来重组蛋白分离纯化中常用方法的新进展和一些新出现的技术。
1 常规液相层析技术的新进展
液相层析技术是目前蛋白质分离中最常用的技术之一,在基因工程产品下游处理中占有主要的地位。近年来对这项技术的改进主要放在纯化操作系统的性能改进和载体介质的性能提高上。下面就以AmershamPharmaciaBiotech公司为代表,介绍该公司在90年代新推出的操作系
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近年来该公司在对80年代发展起来的快速蛋白液相层析系统(FPLC)进行了进一步改进,在90年代推出其新型机型 KTA系统。其主要特点有:(1)该系统配有计算机及与系统硬件相配合的一套人工智能软件,预装有80种柱的预编程序,其操作菜单简便易于设定,可以使整个系统全自动化工作,极大地提高工作效率。(2)所配有的高压动力双泵体系不仅可以提供以往FPLC系统的中压、低压,而且可以提供HPLC的高压。因此流速范围较大,可以运用的柱型多,既可以用于实验室的分析摸索阶段,又可以应用于生物工程制品下游的中试和生产。(3)具有自动缓冲液制备功能 BufferPrep。通过这一功能只需准备4瓶存储液体,包括水、酸 碱、盐溶液和缓冲储备液,系统会考虑缓冲液的pKa值自动对盐及pH进行补偿,可以在线快速制备出各种pH 盐浓度缓冲液。这样用户在开发工艺时,再也不用配置大量不同的缓冲液,大大简化了pH优化问题节省了很多时间。(4) KTA系统还具有独特的多波长连续检测器,可以同时提供3个从190~700nm的不同波长作连续检测。利用这一技术,在检测蛋白的同时,可以对具有其它波长吸收的分子进行在线鉴定。
与 KTA操作系统相配合,90年代AmershamPharmaciaBiotech公司还设计和改进了许多载体,为广大的纯化工作者提供了多种选择。例如Source系列,Mono系列,Mini系列,Superdex系列,STREAMLINE系列等。其中Mini系列的载体介质其平均颗粒直径为3 m,大小均一,为当前分辨率最高的离子交换介质之一。新型设计的Superdex凝胶载体是目前分辨率、选择性最高的分子筛凝胶排阻过滤介质。与过去的Sephadex凝胶载体相比,它加强了介质的机械强度,一改以往Sephadex软凝胶的性质,可以容许载体在较高的流速压力下工作并且反压低,克服了分子筛凝胶排阻层析时间过长的缺陷。Source系列是为生物分子的制备性分离而设计的一种低反压高分辨率凝胶介质,颗粒大小分15 m和30 m两种,完全均一。即使流速在1000cm h以上仍保持高分辨率,因而可在数分钟内完成1次洗脱过
[4]
程,适合作为中度和精细纯化基架。
[5][4]
用,它代表了当前液相层析技术发展的方向和趋势。
2 扩张柱床吸附技术
当重组蛋白的表达为包涵体形式时,表达量高,是近年来热门的研究项目。但是包涵体需经过一个复杂的复性过程才可进行下一步的纯化工作。在复性过程中,溶液的体积放大了几十倍,同时还伴随有大量的不溶性悬浮物生成。当重组蛋白以分泌形式表达时,其发酵液中也存在着大量菌体碎片。这些含有不溶性悬浮物或菌体碎片的溶液的处理在传统工艺上都需要经过高速离心或者过滤。这不仅需要昂贵的离心设备,而且所费时间较长,往往成为基因工程产品下游工艺开发的限制瓶颈。最近问世的扩张柱床吸附层析技术(ExpandedBedAdsorptionChromatographyTechniques)及时地为解决这一问题提供了新的途径
[4~6]
。
扩张柱床吸附层析技术操作原理与一般的吸附层析相似,层析柱经过自下而上的扩张及平衡后,含菌体的发酵液或复性液从柱底部进至柱中。此时目标蛋白会吸附于凝胶上面,一些杂蛋白、菌体和不溶性的颗粒会随液流从柱顶流出,而不会阻塞其中。再通过改变洗脱条件,目标蛋白便可从柱中洗下来。
经过长时间的研究开发,AmershamPharmaciaBiotech公司为扩张柱床吸附层析技术设计了名为STREAMLINE
TM
的一系列产品。它包括
STREAMLINE的介质和扩张柱两部分,其介质的吸附特性主要是阴阳离子交换吸附和亲和吸附。选择性地利用这些介质的性质,再加上合适的缓冲液和洗脱条件,产品可以进行一步澄清浓缩纯化。这不仅减少了样品预处理的损失,样品体积也不再是处理量的限制因素,在缩短纯化步骤的同时,省去了大笔去购买大处理量的高速离心机及大规模膜过滤和超滤系统的经费。
由此可见,扩张柱床吸附层析技术针对基因工程产品,结合了澄清、浓缩及产品捕捉三个步骤为一体,突破性地直接从未经任何预处理的样品中捕获靶蛋白,极大地减少了损失,降低了生,[4]
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3 径向膜层析技术
传统的层析技术往往采用长轴流向设计,虽然为广大的科技工作者运用,但依然存在许多缺点:(1)流速较慢,层析耗时长效率低。(2)层析过程中压降较大,增加了对设备的要求。(3)层析条件不易放大,若想放大规模,需重新摸索分离条件,为重组蛋白的大规模分离纯化提出了难题。80年代中期国际上提出了一种称为径向层析(RadialFlowChromatography)的新技术。80年代后期,径向层析又结合膜分离处理量大的优点,发展成径向膜层析技术,在原理上解决了上
[1]
述问题。
径向膜层析柱常采用螺旋卷式膜组件结构,流动的方向是从层析柱的圆周流向柱的圆心,即径向流动。由于这一原理,与传统的轴向层析柱相比,径向层析有以下几个优点:(1)流向的截面积加大,即使在流速高时压降仍很低,因而纯化速度快处理量大。(2)保持柱径不变,无需改变其它分离条件,仅增加柱长就可以增加上样量,因而有利于放大生产。据1999年杨利等报道,当柱床体积相差不大时,径向层析柱的流速(升 小时)和班产率(升 班)要比轴向柱提高3~3 8
[1]
倍和3倍。这一优点对工业生产极为有利。
径向膜层析柱技术及其产品在80年代后期首先由美国CUNO公司推出,到90年代其产品从实验室规模、中试规模到生产规模已形成系列化,膜的类型主要是离子交换型。此外,美国的Millipore公司和Nygene公司于90年代相继推出了以ProteinA为亲和配基的商业化膜层析组件。我国中国科学院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心也紧跟这一技术潮流,经10年攻关,在1999年前研制开发出一系列以纤维素为基质的离子交换,亲和和疏水3种类型的复合膜层析介质和多种规格的径向膜层析柱,为我国生物工程产品的分离纯化提供了有效工具。预计径向膜层析的发展方向将着重于对柱结构的优化和筛选、合成新型具有更高选择性及广泛适用性的膜。
[2]
[1]
工具,而其中分离介质尤为重要。在过去几十年里,人们一直在提高液相层析的分离能力,以达到最好的分离效果。谱带扩展是影响层析效率
的主要因素之一,它主要源于流动相的粒子内部扩散、纵向扩散和溶质扩散这3个因子,影响了固定相和流动相之间的传质和交换平衡速度。通常人们解决这一问题的方法是减小介质颗粒的大小。AmershamPharmaciaBiotech公司近年来提供的Mini系列和Mono系列就是采用这一策略,显著地提高了层析柱床的分辨效率。然而当颗粒达到3~5 m时,再提高分辨率就不太实际了。1989年初美国的Dr.FrederickRegnier、Dr.NoubarAfeyan等人率先发明了具有贯穿孔的分离载体(flow throughparticale) POROS,并申请了专利。同时他们将液流通过这一载体而减小粒子内部扩散的层析行为命名为灌注层析技术(PerfusionChromatography)。这一技术的提出为流动相于固定相的传质问题的解决提供了新的方法。
POROS介质是在苯乙烯 二乙烯苯的交联共聚物(PS DVB)基础上构成的,其化学稳定性和机械强度均高于传统的葡聚糖、聚丙烯酸酯和硅胶等介质。POROS为双模式网孔结构,在介质上有600~800nm的贯穿孔和与之相连接的80~150nm扩散孔。这一结构可以容许液体对流到分离介质的内表面,加快了流动相与固定相的传
[7]
质速度,缩短了交换平衡所需的时间。因此这一方法打破了传统的流速、分辨率和容量之间的三角关系,即在流速增加的情况下柱容量和分辨率均不会降低,且反压也不会升高,为快速纯化生物大分子提供了基础。Regnier等创建的PerseptiveBiosystems公司在1991年推出以BioCAD为名的灌注层析系统,这一系统已于1993年开始进入中国市场。到目前为止他们已在POROS介质的基础上发展了具有10、20和50 m3种规格,表面由25种不同的化学制成的不同载体。其所运用的范围包括离子交换层析、疏水层析、反相层析和亲和层析。据1994年夏小燕等人报道,该系统分离速度比传统技术快10~100倍,最短仅需30秒至3分钟就可以完成一个样品的纯化和分析工作。
[8][8][7~10]
[7]
4 灌注层析技术
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的动力学过程而不改变层析的分离原理,因此它可以运用于除凝胶排阻层析之外的所有层析技术中。从某种角度来说,AmershamPharmaciaBiotech公司的SOURCE系列也具有类似低反压精细纯化的作用。鉴于灌注层析技术的快速高效性能,它的推广是蛋白质纯化技术发展的必然趋势。
由于表活剂极性头的保护,可使包溶的的蛋白质不易变性。此外反胶团萃取体系还具有操作条件温和,对目标蛋白选择性好,容量大和易于扩大再生产的优点。当然反胶团体系萃取技术也有其不足之处,以往采用单一表活剂AOT或季氨盐的反胶团萃取体系易受溶液pH、温度、离子强度和离子种类等因素的影响。目前为了克服这些缺点,往往在反胶团体系中加其它表活剂作助剂或者采用阴、阳和非离子复合型表活剂的反
[12~15]
胶团体系的方法来解决。随着对上述技术的不断探索,液液萃取技术将会具有更强的生命力。
5 液液萃取技术
萃取是利用物质在不同溶剂相的分配系数不同而达到分离效果的一种古老技术。已有大量文献论证液液萃取技术在重组蛋白质分离纯化上也具有广泛的应用前景
[3,11~15]
。目前文献
报道液液萃取技术较多的有:双水相萃取技术和反胶团体系萃取技术。
双水相萃取技术是近年来发展很快的一种生物分离方法,它具有活性损失小,分离步骤少
[11]
的优点。据1993年周长林等人报道,他们利用PEG磷酸酯 磷酸盐两水相系统,经两次萃取从E.coli匀浆液中抽提重组表达的干扰素 1,收率达99 6%,纯度提高25倍。双水相萃取技术常用的体系主要有两类:高聚物 高聚物和高聚物 盐。但是前者价格昂贵,后者因盐浓度过高蛋白活性损失较大,且界面吸附蛋白多。近年来许多学者为了解决这一问题,探索了许多新型的萃取剂,其中变性淀粉PPT PEG体系因价廉性优,具有很好的应用前景。一些学者将双水相萃取技术与膜分离技术结合起来,较好地解决了生物大分子在两相界面的吸附和乳化作用并且加快了萃取速率。还有一些学者利用亲和反应的高度专一性,在萃取剂上接上一定的亲和配基,使得双水相萃取体系不仅具有处理量大的特点,而且具有专一性,提高了萃取效率。今后,寻找廉价高效的双水相萃取体系和利用其它分离技术与双水相萃取技术结合是这项技术的发展
[11]
主流。
液液反胶团(ReversedMicelles,RM)体系萃取技术是90年代以来发展较快的另一种萃取技术,是依赖表活剂液液萃取技术的一个分支。反胶团是离子型表面活性剂分散在非极性溶液中形成的,由表活剂的极性头向内形成 [14]
[3,13]
[3]
[12]
6 置换层析技术
能够找到一种高上样量、高生产率、高分辨率和易于操作的层析技术一直是人们梦寐以求的。一些沉睡中的老方法由于新技术的推动,给人们带来了新的面孔和希望。置换层析(DisplacementChromatography)是非线形层析技术中(即被分离的物质在流动相与固定相之间不是线性关系而是呈其它函数关系)唯一可实际应用的技术,其基本原理是利用置换剂置换出吸附在层析柱的被分离组分。此技术早在40年代就由Tiselius提出,只是在最近十几年里,随着高效置换剂和高效吸附剂的出现以及HPLC技术的发展,才显示出其在蛋白质制备性分离中的优[16~19]势。置换层析与传统洗脱层析都是利用样品组分对固定相的亲和能力不同将各组分分离,但两者的工作原理却大相径庭。传统的洗脱层析是由于各分离组分在流动相与固定相之间的分配平衡常数不同而引起的各组分在流动相的迁移速度不同达到分离目的。而置换层析的分离原理是被吸附的各组分对固定相吸附部位的直接竞争作用的结果,依据与固定相的亲和性不同在置换剂的推动下,形成一系列已分离的置换序列。置换层析与传统洗脱层析的比较见表2。
重组蛋白质的纯化经常会遇到如下问题,即虽经过多次不同层析技术的分离,目标蛋白中仍有无法去除的杂蛋白,这些杂蛋白在分子量大小和所带电荷数均极为相似,有的甚至就是目标蛋,[15]
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者头疼。利用置换层析这一具有高分辨率的方法常常可以起到特殊的效果
[17~19]
而将金属离子牢固地结合在介质上。在层析过程中,这些二价金属离子又可以螯合溶液中蛋白质分子外露的组氨酸等氨基酸残基簇,将蛋白吸附在介质上。洗脱时,通过改变pH,加竞争的螯合试剂等方法,依据各蛋白组分与介质的亲和程度不同将目标蛋白与杂蛋白分离。因此具有分辨率高选择性好的特点,给分离蛋白质带来了很大方便。金属螯合亲和层析的另一个优点是层析过程既可以在常规的非变性条件下进行纯化又可以应用于含6mol L盐酸胍或8mol L尿素的变性条件。这一优点尤其对以包涵体形式表达的重组蛋白纯化尤为有利。
但是在实际应用过程中金属螯合亲和层析也遇到一些问题。在过去,金属螯合亲和层析填料大都采用琼脂糖为介质,而琼脂糖颗粒表面较为粗糙,容易产生一些非特异性吸附现象。这一现象尤其出现在小量蛋白的分离或含疏水性蛋白多的情况中,而且也不适应快速分离蛋白,大大影响了金属螯合层析的分离效果。针对这一情况,90年代以来国外的一些科学家采用磁化
[20~21]
或超顺磁化介质克服了这一缺点。含有氧化铁的交联琼脂糖是常用的磁化填料,它们的颗粒非常细,表面极其光滑,将蛋白的非特异吸附降到最低的水平。据1996年美国ZongshiJi等报道,它们合成的经超顺磁化的Ni M280载体与以往的金属螯合载体相比具有结合蛋白快速、吸附
[20]
量大、非特异吸附性低和易于操作的特点。美国的Qiagen公司已将此技术利用到商品化[21]
Kit。
近年来,人们还将基因重组技术与金属螯合层析结合起来,在基因水平上为蛋白质的分离纯化提供方便。其基本原理是在目的基因的N端或C端加上6个His,这样表达出的蛋白就可以直接用于金属螯合层析当中。目前一些公司已推出商品化的试剂盒,美国Qiagen公司提供的QIAexpress系统就是很好的一例。该系统利用的pQE系列载体不仅有6个His编码序列还含有强启动子和多克隆位点等成分,可以将目的基因在宿主细胞中高效表达。表达后的产物可直接用金属螯合层析进行分离,有时可取得一步纯化的效果
[21]
[20~22]
。1997年,
AmitavaKunda和StevenCamer报道利用小分子量的置换剂将离子交换层析和分子筛层析不能分离的牛细胞色素C和马细胞色素C完全分开
[19]
。此外,置换层析的另一大优点是在如此
[15]
高的分辨率的情况下依然保持很高的上样量,这无疑为重组蛋白的生产提供了有效的手段
表2 置换层析与传统洗脱层析的比较
置换层析
分离机理洗脱峰形上样量样品在洗脱后的浓度有无拖尾分辨率
传统洗脱层析
。
吸附的平衡常数不同
被吸附组分之间对固
导致各组分在流动相
定,相亲和性大小不同
中有不同的速度矩形的平台洗脱峰形饱和吸附量的40%~60%
浓缩状态分离
无极高
钟罩形洗脱峰形饱和吸附量的5%稀释状态分离
有高
诚然,目前置换层析也有许多局限性:(1)由于置换层析技术要求被分离蛋白质附和Langmuir吸附等温线,如不同蛋白在同一吸附剂上的等温线有交叉时,置换层析的分离效率就会大打折扣。(2)由于在分离过程中各组分形成相互接近的的置换序列,就会在彼此相邻的交界处发生洗脱峰的重叠现象,影响样品的回收率。(3)由于置换层析中的浓缩作用,许多蛋白质在超过一定浓度的界限时会聚集形成沉淀,造成层析柱堵塞
[15]
。
鉴于置换层析技术的上述特点,国内外许多学者都认为它将成为基因工程下游技术中最有效的制备性生物物质分离技术之一。今后的研究工作将会集中在不断探索研制低价无毒而高效蛋白质置换剂,适合置换层析技术的新型吸附材料上。
7 金属螯合亲和层析的新运用
目前金属螯合亲和层析(Metal ChelateAffinityChromatography,MCAC)所采用的螯合剂主要有两种:一是亚氨基二乙酸(IDA),另一个是次氨基三乙酸(NTA)。它们都可以有效地与Ni、Zn。
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~526
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第22卷
蛋白的纯化为今后蛋白质分离纯化途径提供了新的思路和方向。也有些公司根据抗体与抗原的亲和作用,将抗原与目的蛋白组成的融合蛋白表达,再利用结合抗体的亲和柱分离目标蛋白也取得同样好的效果。
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8 结束语
综观上述重组蛋白质分离纯化技术的新进展,我们可以看到这样一个发展趋势:今后重组蛋白的分离纯化的技术发展将围绕着快速,高分辨率,高上样量,易于操作,低成本和电脑控制的
全自动化等技术而展开。我们期待着有更好的分离纯化手段展现在我们面前。
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TheProgressofRecombinantProteinPurificationTechniques
ChenHao ChenYuhong ZhuDexu LiuJianning
(InstituteofMolecularMedicineStateKeyLaboratoryofPharmaceuticalBiotechnologyNanjingUniversityNanjing 210093)
Abstract From1990,thegenerecombinanttechniquemakesakeysuccessesinmodernbiotechnology.Inviewofthecostofisolationproductionofgeneengineeringisabout60-80percentofthetotalexpenditure,thetechniquesofseparationandpurificationtheseproteinstakesimportantpositioningeneengineering.Inthisarticle,wereviewtheprogressofbioseparationtechniquesin1990s,suchas,expandedbedadsorptionchromatography,radialflowmembranechromatography,perfusionchromatography,liquid liquidextractiontechniques,displacementchromatography,metal chelateaffinitychromatography.Theapplicationrange,theadvantageandshortcomingofthesetechniquesisalsodiscussed.
Keywords Recombinantprotein Isolation Purification Chromatography