利用重组酵母菌生产人胰岛素

利用重组酵母菌生产人胰岛素

摘要：利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建，根据人胰岛素的氨基酸序列和酵母偏爱的密码子， 采用基因半合成技术合成人胰岛素基因。将合成的胰岛素基因克隆到pPIC9质粒，构建了毕赤(Pichia)酵母重组表达载体pPINS319，用BglII线性化后用电转化法导入毕赤酵母GSll5菌株，经过营养筛选和PCR 复筛，得到含人胰岛素基因的毕赤酵母工程菌株。后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产，通过补料-分批发酵获得发酵液，分离纯化后获得人胰岛素。纯化后的重组人胰岛素产品经SDS-PAGE检测，氨基酸组成分析及小鼠惊厥实验证明制得产品为有生物活性的人胰岛素。

关键词：重组酵母；人胰岛素；发酵；纯化；鉴定

Using recombinant yeast to produce human insulin

HuSheng 1142043040

Abstract：The proceedings of produce human insulin by recombinant yeast show as follow:get purpose gene→construct the recombinant plasmid→construct the genetic engineering bacteria→fermentation of engineering bacterium→separation and purification of the product→identification of the product. The front three processes is building engineering bacteria of human insulin yeasts . Insulin gene was synthesized according to the amino acid sequence of human insulin and yeast preferential codons. The insulin gene was cloned in to pPIC9 vector and expression vector pPINS319 was constructed. The expression vector was digested with BgllI and then used to transform Pichia Pastoris GSll5 by electroporation. The expression analysis showed that the insulin gene w s able to expressed efficiently in Pichia Pastoris. The posterior three processes is large-scale production by fermentation.Through fed - batch fermentation getting fermentation liquor, separation and purification the fermentation liquor getting human insulin.The final products purified by supedrex 75showed one band by SDS-PAGE analysis and were identical with the native human insulin by all critetia employed.(SDS-PAGE analysis,amin acid composition analysis and bioidentity assay) Keywords：recombinant yeast;human insulin; fermentation;purification;identification

胰岛素是FDA批准的第一个用于人类的基因重组药物。最初的重组表达是通过大肠杆菌分别表达出胰岛素的A链和B链。现在，胰岛素作为重组蛋白产品，主要有两条途径获得。一条途径是在大肠杆菌中表达胰岛素前体的包涵体，通过溶解和复性等过程获得胰岛素。另外一条途径是通过酵母表达系统，分泌表达可溶性的胰岛素前体进入培养液。由于对酿酒酵母大规模培养有丰富的经验，使其成为了第一个分泌表达胰岛素前体的酵母系统。虽然酿酒酵母仍然是主要的胰岛素产品表达系统，近些年几个备选的表达系统也提供了可能性。其中，毕赤酵母是一种非常有用并且优势明显的表达宿主。尤其是它强有力的醇氧化酶启动子，受甲醇严格诱导调控，通过简单培养可以达到较高的细胞密度，能够稳定且高水平表达外源蛋白。

利用重组酵母菌生成人胰岛素为以下流程：获得目的基因→构建重组质粒→构建基因工程菌→工程菌发酵→产物分离纯化→产品检验。其中前三个流程为产人胰岛素酵母工程菌的构建；后三个流程为胰岛素的大规模发酵生产。本报告将从两个方面来介绍，如何利用重组酵母菌生成人胰岛素。

产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建

胰岛素大规模发酵生产

产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒

E. coli DH5α、Pichia pastoris GSll5、pPIC9购自Invitrogen公司；pMD18-T购自TaKaRa公司。

1.1.2 试剂和酶

限制性内切酶、T4DNA连接酶、5′磷酸化酶、Klenow大片段及去磷酸化酶均购自TaKaRa公司；pfuDNA 聚合酶、Taq-plus、胰蛋白酶和羧肽酶B购自上海生工生物工程有限公司；PCR回收试剂盒购自TaKaRa公司；四个片段基因均委托上海博亚生物技术公司合成；其它常规生化试剂均购自国内有关公司。

1.2 方法

1. 2. 1 胰岛素基因的克隆

参考159种在酵母中表达的蛋白，每种氨基酸均选择酵母中高频使用的密码子，将人胰岛素基因设计为两两末端互补的四个片段分别进行化学合成，经变性、退火以及KlenowI补平，获得完整的胰岛素基因片段。用于酶促合成胰岛素基因的四个片段长度都为59 bp：

Frg1:5′-AGCGGATCCATGTTCGTTAATCAACACTTGTGTGGTTCTCACTTGGTTGAGGCTTTGTA-3′

Frg2:5′-CTAGTCTTTGGAGTGTAGAAGAAACCTCTTTCACCACAAACCA

A GTACAAA GCCTCAAC-3′

Frg3:5′-ACTCCAAAGACTAGAAGAGGTTCTAGAAAGGGTATCGTTGAAC

AATGTTGTACTTCTAT-3′

Frg4:5′-GCCGTCGACTTAATTACAGTAATTTTCCAATTGGTACAAAGAAC

A TA TA GAA GTACAAC-3′

上述四个片段中：Frgl的5′和Frg2的3′含有15个互补碱基；Frg2的5′和Frg3的3′含有14个互补碱基；Frg3的5′和Frg4的3′含有14个互补碱基。将四个片段等量混合, 经过高温变性和迅速退火后，四个片段通过互补碱基进行配对，由于Frg2和Frg3 的5′，经过了磷酸化处理，在Klenow聚合酶的作用下，缺口处从3′向5′进行延伸合成完整的人胰岛素基因。

用聚丙烯酰胺凝胶回收195～196bp的片段，克隆到pMDl8-T载体，转化E. coli DH5α，进行方向鉴定后，委托上海生工生物工程有限公司测序。根据测序结果，判断酶促合成的胰岛素基因是否已经正确克隆到pMDl8-T的EcoRV多克隆位点，基因碱基序列是否与原设计序列完全吻合。所克隆的胰岛素基因命名为ins319，此载体命名为pMINS319。

1. 2. 2 毕赤酵母表达载体的构建和转化

1. 2. 2.1 表达载体pPINS319的构建：根据pPIC质粒多克隆位点的序列特点，为确保表达产物经信号肽酶切割后产生精确的胰岛素蛋白N末端，并能直接进行定向克隆，重新设计上游和下游引物，在上游引物5′端添加pPIC9质粒XhoI位点处的12个碱基(包括XhoI位点和编码信号肽酶识别位点两个氨基酸的序列，5′-CTCGA GAAAAGATTCGTTAATCAACACTT-3′，下游引物添加EcoRI位点(5′-GAA TTCCCGTCGACTTAA TTACA-3′。以此引物和pMINS319质粒为模板进行PCR 扩增，SDS2PAGE电泳回收扩增的胰岛素基因片段，将该片段和质粒pPIC9分别用X hoI和EcoRI酶切，电泳回收大片段；将酶切的基因片段与pPIC9大片段混合，用T4连接酶连接，构建成毕赤酵母表达载体pPIN319。

1. 2. 2.2 表达载体pPINS319的酶切鉴定：为确证胰岛素基因克隆到了pPIC9上，采用X hoI和EcoRI双酶切鉴定pPINS319，并利用琼脂糖凝胶电泳(2 %琼脂糖凝胶) 检测，若泳道出现一条9.2 kb和200 bp左右的电泳条带，表明重组质粒pPINS319 含有所预期的基因片段。

1. 2. 2.3 毕赤酵母电击转化及转化子检测：重组质粒pPIN319用BglII酶切使之线性化，然后用电击法转化毕赤酵母菌株GSll5感受态细胞。在MD培养基上培养两天后，长出大约200个转化子。挑取20个转化子接种在MM培养基上，有11个转化子在以甲醇做为唯一碳源的MM培养基上能够缓慢生长(Huts型)。为确证胰岛素基因已整合到毕赤酵母菌株GSll5染色体上，分别提取11个经过初步筛选的阳性转化子的基因组DNA，并以之为模板进行PCR鉴定。阳性转化子的PCR鉴定结果(2%琼脂糖凝胶)。

胰岛素大规模发酵生产

1 菌体培养

1.1 摇瓶培养方法

温度30℃，摇床转速230r/min，摇瓶装液量30mL/300mL三角瓶。

1.2 分批补料发酵方法

1.2.1 种子液制备

从新鲜YPD平板上挑取单菌落，接入含BMGY培养基50mL/300mL的摇瓶，30℃、230r/min下培养20h，作为一级种子。再以10％的接种量接入BMGY培养基50mL（10瓶），同样条件下培养18h，至OD600为20左右，作为发酵罐种子液。

1.2.2 分批补料发酵

培养在12.8L全自动发酵罐中进行，发酵罐中装入改良BSM培养基6L，按8％接种，培养过程中通气量不小于10L/min，通过改变搅拌转速保持溶氧水平不低于30％，用氨水调节pH至6.6。菌种生长初期DO较高，随着茵体的生长，耗氧量增加，DO不断下降。待DO降到30以下时，提高转速，当搅拌速率达到800r/min，解除溶氧搅拌关联。当DO陡然上升（表明甘油已经耗尽，耗时约16h），开始补加50％甘油(含12mL/LPTMl)，并控制流加速度维持DO在30％-40％，当发酵液的OD600至300左右时，开始加入甲醇（含12mL/LPTMl）诱导，甲醇补加速率由低到高，甘油补加速率逐渐降低最后停止，该过度阶段约维持4-6h。根据溶氧的变化及尾气分析仪在线检测到的C02变化情况及时调整甲醇和氮源补加速率，适时放罐。

2 人胰岛素前体的纯化与后加工

超滤系统简介：由氮气钢瓶、超滤杯、超滤膜组成。本系统工作压力 0.2MP 左右（不要超过 0.3MP）；膜使用前要进行预处理，使用后要清洗。

膜的预处理：对于新的膜直接用去离子水浸泡半小时后即可使用。使用过的膜应用0.1%的氢氧化钠溶液浸泡，再用去离子水浸泡半小时，冲洗至 pH 值呈中性，即可使用。

膜的清洗与保存：膜使用后立即用去离子水反复冲洗几遍，再用 0.1%的氢 氧化钠溶液冲洗两遍，保存于 0.1%的氢氧化钠溶液中，并需每周更换一次此 0.1%氢氧化钠浸泡溶液。

2.1 人胰岛素前体的纯化

1）发酵液400mL预处理：6000r/min×5min，取上清液；

2）超滤（100K的膜）处理发酵液上清，收集滤出液；

3）超滤（30K的膜）处理滤出液，收集滤出液；

4）超滤（6K的膜）处理滤出液，待滤出液在350mL左右，停止超滤，往杯内加入 150mL蒸馏水，继续超滤，至滤出液达150mL左右，停止超滤，收集超滤杯中溶液；

5）丙酮沉淀人胰岛素前体：在上一步收集的溶液中慢慢加入4倍体积-20℃预冷 的丙酮，边加边搅拌，4℃沉淀2小时；

6）轻轻倾去丙酮溶液，收集沉淀，低温下真空干燥，收集人胰岛素前体粗品； 停止超滤，收集超滤杯中溶液；

5）丙酮沉淀：在上一步收集的溶液中慢慢加入 4 倍体积-20℃预冷的丙酮，边加边搅拌，4℃沉淀 2 小时；

6）轻轻倾去丙酮溶液，收集沉淀，低温下真空干燥，收集蛋白粗品。

2.2 胰岛素纯化

多步层析精细纯化得到的胰岛素在冷冻干燥之前，常采用多次结晶和洗涤工艺进一步去除杂质、提高产品纯度。相比传统晶体沉降或离心收集工艺，中空纤维0.45微米滤膜可以有效截留胰岛素晶体，快速减小样品体积，从而实现高效的胰岛素晶体收集。此外，封闭的操作系统最大程度避免敞口操作，保证终产品质量安全。

3 产品检测

3.1 SDS-PAGE分析

通过15%SDS-PAGE,用0.3%的考马斯亮蓝R250染色,对产品进行鉴定。

3.2 氨基酸组成分析

通过氨基酸组成分析证明本工艺制备的重组人胰岛素样品的氨基酸组成与

标准人胰岛素基本一致。

3.3 hl生物活性的鉴定

取5只昆明种清洁级小白鼠(雄性20一249)，按每209体重皮下注射hI样品

1.25，U注射后2h内均出现降血糖阳性反应,其中有4只惊厥。随即腹腔注射1ml 5%葡萄糖注射液，惊厥现象消失。表明制得的hI样品具有很好的降血搪活性。 预期结果

1 基因半合成技术合成人胰岛素基因

用聚丙烯酰胺凝胶回收195～196bp的片段，克隆到pMDl8-T载体，转化E. coli DH5α，进行方向鉴定后，委托上海生工生物工程有限公司测序。测序结果表明，酶促合成的胰岛素基因已经正确克隆到pMDl8-T的EcoRV多克隆位点，基因碱基序列与原设计序列完全吻合。

2 毕赤酵母表达载体的构建

采用X hoI和EcoRI双酶切鉴定pPINS319，并利用琼脂糖凝胶电泳(2 %琼脂糖凝胶) 检测，若泳道出现一条9.2 kb和200 bp左右的电泳条带，表明重组质粒pPINS319含有所预期的基因片段。

3 毕赤酵母电击转化及转化子检测

为确证胰岛素基因已整合到毕赤酵母菌株GSll5染色体上，分别提取11个经过初步筛选的阳性转化子的基因组DNA，并以之为模板进行PCR鉴定。阳性转化子的PCR 鉴定结果(2%琼脂糖凝胶)11个M u t s型转化子中有两个(转化子4 和转化子9)扩增出了约200 b 的目的基因片段，表明在这两个转化子中，ins319胰岛素基因已经成功地整合到了GSll5的基因组DNA上。

4 胰岛素鉴定

通过SDS-PAGE，然后进行免疫印迹，呈现两条特异条带，由此确定表达的蛋白确实是human Insulin。通过氨基酸组成分析证明本工艺制备的重组人胰岛素样品的氨基酸组成与标准人胰岛素基本一致。取5只昆明种清洁级小白鼠(雄性20一249)，按每209体重皮下注射hI样品1.25，U注射后2h内均出现降血糖阳性反应,其中有4只惊厥。随即腹腔注射1ml 5%葡萄糖注射液，惊厥现象消失。表明制得的hI样品具有很好的降血搪活性。

讨论

在酵母高表达基因中，某些密码子几乎不使用或使用频率很低，例如编码A rg的密码子CGG在高表达基因中使用频率为零，因此，利用密码子的减并性将原基因中酵母不使用或使用频率很低的密码子替换掉，可提高翻译效率从而提高表达量。本研究根据酵母密码子偏好对人胰岛素基因密码子进行了优化，利用半合成技术合成了人胰岛素基因ins319，将其克隆到T载体。将人胰岛素基因ins319插入毕赤酵母表达载体pPIC9的信号肽序列下游，构建了毕赤酵母表达载体pPIN S319。将表达载体线性化后转化毕赤酵母GSll5，实现了人胰岛素在毕赤酵母中的高效率分泌性表达。

采用毕赤酵母表达系统高效表达人胰岛素。毕赤酵母具有其它蛋白表达系统不可比拟的优点，不仅表达量极高并可分泌到胞外，而且毕赤酵母表达产物糖基化程度低，其糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基。此外，与酿酒酵母相比，毕赤酵母核心多糖末端不存在α- 1, 3糖苷链，表达产物蛋白不产生高度抗原性，因而特别适合于治疗用途。利用重组酵母菌生成人胰岛素技术有待进一步研究，以提高产量，降低成本。

参考文献：

1.重组人胰岛素在毕赤氏酵母中的分泌表达，何尧声等，药物生物技术，2009；

2.表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建，李军等，北京化工大学学报，2004；

3.毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展，夏珊等，生物技术通讯，2013；

4.产人胰岛素毕赤酵母工程菌的构建，王隆飞，南开大学学报，2006；

5.基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究，李红霞，四川大学硕士学位论文，2005；

6.利用转基因毕赤酵母高表达重组人胰岛素，李军，北京化工大学硕士学位论文，2003；

7.重组人胰岛素制备工艺，李晓红，四川大学学报，2007。