藻蓝蛋白的分离与纯化
姓名：郭均 学院：食品与生物工程 班级：食安 09-2 学号：[1**********]9
藻蓝蛋白的分离与纯化
一、 实验目的和要求
1、了解藻蓝蛋白的生理意义及功能，藻蓝蛋白的一般提取和纯化的方法； 2、掌握蛋白含量测定方法；
3、掌握盐析和离子交换层析纯化蛋白的分析技术。
二、实验原理
藻蓝蛋白（PC ）是一类普遍存在于藻蓝蛋白中的光合辅助色素，也是一种天天然色素蛋白，具有水溶性，可用作视频着色剂。此外，它具有强烈的荧光，在分子生物学上被制成荧光探针，是一种无毒、无副作用的理想光敏剂。藻蓝蛋白还具有重要的医疗价值，不但能提高机体的非特异性免疫功能，而且对特异性免疫功能有促进作用。另外它还有清除自由基的能力，可以抗疲劳，延缓衰老，对人体的生理功能有重要的生物学意义。
利用盐析沉淀蛋白质的基本原理：盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸收水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可以中和部分电荷，致使蛋白质聚集，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于各种蛋白颗粒大小、所带电荷的多少及亲水程度不同，当使用某种中性盐对其进行盐析时，所需的最低盐浓度各不相同。研究表明可用25%硫酸铵饱和度沉淀除去杂质，55%硫酸铵沉淀藻蓝蛋白。盐析出来的蛋白质，需通过脱盐以除去硫酸铵等盐类物质。最常用脱盐的方法是透析。蛋白质是大分子物质，它不能透过半透膜，故不断更换蒸馏水或缓冲液可将盐类等小分子杂志透析掉。
蛋白质含量测定有紫外分光光度计法和显色法（Folin-酚法、考马斯亮蓝法等），本实验采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用后变为蓝色，最大光吸收由465nm 变为595nm ，在一定范围内，蛋白质含量与595nm 处吸光值成正比。
离子交换层析法纯化蛋白质，常用的阳离子交换剂有弱酸性的羧甲基纤维素（CM 纤维素），阴离子交换剂有弱碱性的二乙胺基乙基纤维素（DEAE-纤维素）。蛋白质的混合物与纤维素离子的交换剂的酸性基团或碱性基团结合，结合力的大
小取决于彼此间相反基团的静电引力，这又与溶液的pH 有关, 因为pH 决定离子交换剂和蛋白质的解离程度。盐类的存在可以降低离子交换剂的解离基团与蛋白质相反电荷之间的静电引力。因此，被吸附的蛋白质的洗脱通过改变pH 或离子强度来实现，与离子交换剂结合力小的蛋白质先从层析柱中洗脱下来。
本实验以蓝藻为材料，采用反复冻融、分步盐析法对藻蓝蛋白进行提取和初步纯化，采用考马斯亮蓝法测定提取藻蓝蛋白的含量，然后使用DEAE-纤维素柱层析对提取的藻蓝蛋白进一步纯化（由于来源不同和种类的差别，目前研究报道的藻蓝蛋白等电点尚无一致结论，但都在3.4-4.8之间，其中钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的等电点为4.3，在pH6.5磷酸盐缓冲液中带负电，所以选择DEAE-纤维素阴离子交换柱）。预期得到纯度较高的藻蓝蛋白。
三、试剂与仪器
1、试剂
螺旋藻藻粉
0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.5）: 配置0.2 mol/L pH6.5硫酸缓冲液；称取磷酸二氢钠32.21g 溶于蒸馏水稀释至1000 mL为A 液。称取磷酸二氢钠71.64g 溶于蒸馏水稀释至1000 mL 为B 液。取A 液68.5mL,B 液31.5mL, 混匀后即可。稀释0.2 mol/L pH6.5硫酸缓冲液20倍得0.01 mol/L pH6.5硫酸缓冲液。
标准蛋白（0.1mg/mL）:结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成0.1mg/mL的蛋白质标准溶液。
考马斯亮蓝G-250：称取100mg 考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，加蒸馏水稀释至1000mL 。
0.5 mol/L NaOH 0.5 mol/L HCI NaCl 硫酸铵 透析袋 DEAE-纤维素
奈氏试剂：将10g 碘化汞和7g 碘化钾溶于水中，另将24.4氢氧化钾溶于
内有70mL 水的100mL 容量瓶中，并冷却至室温。将上述碘化汞和碘化钾溶液注入容量瓶中，边加边摇动。加水至刻度，摇匀，放置2天后使用。试剂保存在棕色试剂瓶中，暗处。
四、实验步骤
（一）藻蓝蛋白的提取及初步纯化
1、藻蓝蛋白抽提：采用反复冻融法破碎细胞，磷酸盐缓冲液浸提蛋白。
具体操作：取螺旋藻粉1g ，加入0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液10ml ，充分搅拌均匀。室温浸泡30min-1h 后，在-20℃和38℃之间反复冻融数次（3-5次）。细胞破碎后，将悬浮液移入离心管，加入10mL 0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液，混匀，静止30min ，4000r/min离心20min ，上清液即为抽提得到的藻蓝蛋白混合液。
2、分步盐析：采用不同浓度的硫酸铵分步盐析初步纯化出藻蓝蛋白。
具体操作：取上清液，用25%饱和度的硫酸铵4℃ 盐析30min ，然后4000r/min离心20min ，所得上清液用55%饱和度的硫酸铵4℃盐析24h ，4000r/min离心20min ，弃去上清液，离心收集得到的沉淀即为藻蓝蛋白。 3、透析去盐
得到的沉淀用10ml 0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液溶解，然后将藻蓝蛋白粗提液置于透析袋（截留分子质量为10kD ）中在500mL 0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液（或H 20）中透析袋中倒出纯化后的藻蓝蛋白，于4℃下保存备用。 （二）藻蓝蛋白含量测定 1、制作标准曲线； 2、样品含量测定； 3、计算结果。
具体操作步骤如下：
取洁净干燥的试管若干，按表1-1比例配置标准蛋白溶液。原始标准蛋白的浓度为0.1mg/mL。
表1-1 标准溶液配置
混匀此6组试管中的标准蛋白溶液，分别加入4mL 考马斯亮蓝G-250，摇匀（充分混合），室温放置5min 后在595nm 波长处比色，以1号管调零点，得到5组标准蛋白溶液在595nm 处的吸光值A 595。以标准蛋白浓度（mg/mL）为横坐标，以A 595值为纵坐标作图，得到的趋势线即标准曲线。将提取的藻蓝蛋白溶液1mL 适当稀释（6-10倍左右），再取0.2mL ，补充水到1mL ，同上进行比色操作，得到其595nm 处的吸光值，通过标准曲线推算其含量。 （三）藻蓝蛋白纯度的测定
测定A 620和A 280值，纯度可以用A 620/A280来表示。
将上述稀释后的样品，用可见分光光度计，测定其在620nm 波长处的吸光值A 620；再将样品转出，装入石英比色皿，放入紫色分光光度计，测定其在280nm 波的吸光值A 280。由于藻蓝蛋白在620nm 波长处有特征吸收峰，其纯度可以用A 620/A280来表示。因此，根据在可见和紫外分光光度计中得到的数据就可以用推算出提取的藻蓝蛋白样品的纯度。 （四）藻蓝蛋白的进一步纯化 1、DEAE-纤维素处理、装柱和平衡 2、上样、洗脱
3、测定纯化的蛋白浓度和纯度，并分别计算回收率和纯化倍数。
具体操作：称取所需DEAE 纤维素用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。抽干，改用0.5mol/L NaOH 溶液浸泡30min ，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH 至8左右（用pH 试纸检查）。再改用0.5mol/L HCL 溶液浸泡30min ，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。脱气后装柱，用三倍柱床体积的0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液平衡。
将初步纯化得到的藻蓝蛋白液上DEAE-纤维素柱，采用0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液洗脱（含0.4mol/L NaCL ）进行洗脱，柱上层的深蓝色部分大多被迅速洗脱下来，只残留少量蓝色。流速控制在10d/min，用小试管收集洗脱液，
每管收集2mL （或30滴），收集10-12管（呈现蓝色的液体内含有目的蛋白）。测定每管样品的A 620，横坐标洗脱体积、纵坐标A 620值，绘制洗脱曲线。合并所有的管中的样品，A 620和A 280值，计算纯度。（注意：开始洗脱时就需要收集洗脱液，测量洗脱液体积，用于绘制洗脱曲线）
然后用0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液（含0.6mol/L NaCL）洗脱，洗脱下的是别藻蓝蛋白。
柱料的再生：用0.5ml/L HCL 溶液处理柱料，洗2-3倍柱床体积，用H 20洗至pH6.0，0.01mol/L Ph6.5的磷酸盐缓冲液平衡。
五、数据处理和实验结果 1. 标准曲线的绘制
表1-2 标准蛋白溶液吸光度
所测样品吸光度A 595= 0.706，可推算出样品中藻蓝蛋白含量m = 0.917 g
2. 洗脱曲线的绘制
表 1-3 柱层析洗脱液吸光度
3. 藻蓝蛋白纯度计算
盐析后蛋白纯度 = A620/A280 = 0.385 / 0.517 = 0.745 柱层析后蛋白纯度 = A620/A280 = 0.226 / 0.103 = 2.194
4. 回收率和纯化倍数计算
蛋白得率 = 盐析后蛋白含量/ 1g 藻粉 = 0.917 / 1.00 = 91.7% 纯化倍数 = 柱层析后蛋白纯度/ 盐析后纯度 = 2.194 / 0.745 = 2.94
六、思考题
1. 蛋白含量测定的方法有哪些？各有什么特点？
（1）. 凯氏定氮法：是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被作为法定的标准检验法。适用范围广泛，测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时，实际消耗量大。
(2). 双缩脲法：试剂单一，方法简便，但灵敏度差，测定范围为1~20mg蛋白质。适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白测定，常用于谷物蛋白的含量测定。
(3).紫外吸收法：简单灵敏快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。但准确度较差，干扰物质较多，适用于与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
(4).考马斯亮蓝法：方法简便，易于操作，所用试剂少，显色剂易于配置，且干扰物质少。但用于不同蛋白测定时有较大偏差。适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质。
(5). Folin-酚试剂法: 优点是灵敏度高，缺点是费时较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，且专一性差，干扰物质较多。
2. 盐析分离蛋白的原理是什么？
其原理：当一定高浓度的中性盐加入到蛋白质溶液中时，因中性盐与水的亲和力大，又是强电解质，一方面结合大量自由水，降低水分活度；一方又夺取蛋白质表面的水化膜，增大蛋白质之间相互作用的机会，还可以中和部分电荷，使其聚集絮结成沉淀析出，从而使蛋白质分离。
3. 离子交换层析纯化蛋白质的原理
其原理：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。 由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH 条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结
合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH 值洗脱下来。
4. 藻蓝蛋白的功能有哪些？ 有以下几个功能：
(1) 作为食用色素：藻蓝蛋白是水溶性色素，无毒，纯蓝，清亮可爱，可作为食品着色剂、化妆品的添加剂。
(2) 作为医药保健食品：藻蓝蛋白离体实验具有刺激红细胞集落生成，类似红细胞生成素的作用。藻蓝蛋白能改善贫血、提高血色素，有促进免疫和抗疾病功能，并对一些癌细胞有抑制作用。
(3) 作为生物学、化学和细胞学实验的特殊试剂：藻蓝蛋白蓝色并有荧光，可作为生物学、细胞学一些光动力学的研究试剂。
七、注意事项
1. 标准曲线制作规范、准确，样品含量测定准确； 2. 藻体蛋白要反复冻融3次以上，确保细胞全部破碎； 3. 注意离心机使用；
4. DEAE-纤维素柱层析，洗脱液的离子浓度控制。