致泻大肠埃希氏菌

（一）

1 范围

致泻大肠埃希氏菌检验标准操作程序

本操作程序规定了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。 本操作程序适用于食品中致泻大肠埃希菌的检验。 2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：0～4℃。 2.2 恒温培养箱：36±1℃。 2.3 恒温水浴锅：44.5±0.2℃。 2.4 显微镜：10-100×。 2.5 均质器。

2.6 天平，感量为 0.1g。

2.7 灭菌广口瓶：500mL或无菌均质袋。 2.8 灭菌锥形瓶：500mL，250mL。

2.9 灭菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、5mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。 2.10 灭菌培养皿：直径90mm。

2.11 灭菌试管：10mm×75mm。16mm×160mm。 2.12 1.5 mL Eppendorf管。 2.13 全自动微生物生化鉴定系统。 2.14 PCR仪。 2.15 电泳仪。 2.16 凝胶成像系统。 3 培养基和试剂

3.1 EC肉汤：见附录A中A.1。

3.4 麦康凯琼脂（MAC）：见附录A中A.2。 3.5 伊红美蓝琼脂(EMB)：见附录A中A.3。 3.6 三糖铁琼脂(TSI)：见附录A中A.4。 3.7 营养琼脂斜面：见附录A中A.5。

3.8 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.6。 3.9 尿素琼脂(pH7.2)：见附录A中A.7。 3.10 蛋白胨水（靛基质试验）：见附录A中A.8。 3.11 半固体琼脂：见附录A中A.9。 3.12 革兰氏染色液：见附录A中A.10。

3.13 缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR-VP试验用）：见附录A中A. 11。

3.14 致病性大肠埃希氏菌诊断血清、侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血清、出血性大肠埃希氏菌诊断血清。 3.15 生化鉴定试剂盒。 3.16 PCR反应试剂盒。

第一法 常规培养方法

4 检验程序

检验程序如下：

～24h

5 操作步骤 5.1 增菌

图1 致泻大肠埃希氏菌检验程序

样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前预冷藏外，一般不冷藏。以无菌操作取检样25g(mL)，加入装有灭菌225mL EC增菌液的均质杯中，用旋转刀片式均质器以

8000～10000r/min均质；液体样本震荡均匀即可。于44.5℃±0.2℃培养18h～24h。 5.2 分离

取增菌后的EC增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36℃±1℃培养18 h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。致泻大肠埃希氏菌在不同选择性琼脂平板上的菌落形态特征见表1。

5.3 初步生化试验

5.3.1 自选择性琼脂平板上直接挑取5～10个菌落分别接种TSI、pH7.2尿素琼脂和营养琼脂小斜面各一管，置36℃±1℃培养18h～24h，分别观察结果。

5.3.2 凡是TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性和尿素阴性的菌株，挑取用5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验、血清学分型。 5.4 生化试验

5.4.1 用5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，进行生化试验，即靛基质、甲基红和VP实验，大肠埃希氏菌的培养物VP实验为阴性结果，靛基质实验和甲基红实验应为阳性结果；肠侵袭性大肠埃希氏菌还需加做赖氨酸脱羧酶试验和动力试验，赖氨酸脱羧酶试验应为阴性，动力试验应为阴性（O124动力阳性或阴性）。必要时做氧化酶和革兰氏染色检查，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。

5.4.2 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.3.2的初步判断结果，用5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.5 血清学鉴定

5.5.1 假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌O157血清做玻片凝集试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群见表2。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。

为1：160～1：320的O血清，用0.5%盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm×75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50℃水浴锅内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。 6 结果与报告

综合以上生化试验、血清学试验报告结果。

第二法 PCR方法1

7 操作步骤

增菌、分离、初步生化试验同5.1-5.3。

用5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔，采用PCR检测特异毒力基因方法鉴别5种致泻大肠埃希氏菌，然后再进行血清学分型实验。 8 PCR试验 8.1 标准菌株

标准菌株一览表见表3。 菌株名称 EPEC STEC ETEC EIEC EAEC 大肠埃希氏菌

8.2 引物合成

多重PCR引物序列见表4。 1 可采用商品化的PCR检测试剂盒。

标准号

表3 标准菌株一览表

来源

中国食品药品检定研究院 中国疾病预防控制中心传染病所 中国食品药品检定研究院 中国食品药品检定研究院 中国疾病预防控制中心传染病所 WHO

CMCC 44155

具有stx1、stx2毒力基因 CMCC 44815 CMCC 44825 042血清型 ATCC 25922

表4 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因引物序列

目标菌

目标基因

引物序列

5′-ATT CTG GCT CTC TTC TTC TTT ATG GCT G-3′ 5′-CGT CCC CTT TTA CAA ACT TCA TCG C-3′ 5′-GAC ACC TCA TTG CTG AAG TCG-3′ 5′-CCA GAA CAC CTC CGT TAT GC-3′

5′-CGA TGT TAC GGT TTG TTA CTG TGA CAG C-3′ 5′-AAT GCC ACG CTT CCC AGA ATT G-3′

5′-GTT TTG ACC ATC TTC GTC TGA TTA TTG AG-3′ 5′-AGC GTA AGG CTT CTG CTG TGA C-3′

5′-GAA CAG GAG GTT TCT GCG TTA GGT G-3′ 5′-CTT TCA ATG GCT TTT TTT TGG GAG TC-3′

5′-CCT CTT TTA GYC AGA CAR CTG AAT CAS TTG-3′

5′-CAG GCA GGA TTA CAA CAA AGT TCA CAG-3′ 5′-TGT CTT TTT CAC CTT TCG CTC-3′

5′-CGG TAC AAG CAG GAT TAC AAC AC-3′

5′-CGA TCA AGA ATC CCT AAC AGA AGA ATC AC-3′

5′-CGA TAG ATG GCG AGA AAT TAT ATC CCG-3′ 5′-TGC CAT CAA CAC AGT ATA TCC G-3′ 5′-ACG GCT TTG TAG TCC TTC CAT-3′ 5′-ACG CAG AGT TGC CTG ATA AAG-3′ 5′-AAT ACA GAA TCG TCA GCA TCA GC-3′ 5′-AAA TGT CAG TGA ACC GAC GAT TGG-3′ 5′-AGC CGT TTC CGC AGA AGC C-3′

5′-AAA GTG TGG GTC AAT AAT CAG GAA GTG-3′ 5′-ATG CCA GTC CAG CGT TTT TGC-3′

片段大小（bp） 544 910 244 324 655 157 171 766 102 400 1111 1487

EPEC、STEC escV–F

EPEC

STEC

ETEC

EIEC

EAEC 通用

8.3 标本处理

escV–R bfpB–F bfpB–R stx1A–F stx1A–R stx2A–F stx2A–R Elt–F Elt–R estIa–F estIa–R estIb–F estIb–R invE–F invE–R astA–F astA–R aggR–F aggR–R Pic–F Pic–R uidA–F uidA–R

刮取5.3.1中已培养的营养琼脂斜面上生长的菌苔1环～2环，至装有1 mL0.85%灭菌生理盐水的Eppendorf管内，混匀。4 ℃～8 ℃，12 000 r/min离心15 min，弃去上清。沉淀加入100 µL灭菌去离子水中，混匀。100 ℃煮沸12 min，12 000 r/min离心5 min，上清即为PCR扩增模板，可直接用于PCR反应。 8.4 多重PCR

五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重PCR扩增加样体系见表5。PCR反应条件：预变性94 ℃ 5 min。变性94 ℃ 30 s，复性63 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1.5 min，30个循环。最后72 ℃延伸5 min。

表5 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重PCR扩增加样体系 试剂

dH2O 10×PCR Buffer 25 mM MgCl2 2.5 mM dNTPs 25 µM escV–F 25 µM escV–R 25 µM bfpB–F 25 µM bfpB–R 25 µM stx1A–F 25 µM stx1A–R 25 µM stx2A–F 25 µM stx2A–R 25 µM elt–F 25 µM elt–R 25 µM estIa–F 25 µM estIa–R 25 µM estIb–F 25 µM estIb–R 25 µM invE–F 25 µM invE–R 25 µM astA–F 25 µM astA–R 25 µM aggR–F 25 µM aggR–R 25 µM pic–F 25 µM pic–R 25 µM uidA–F 25 µM uidA–R 3 U/µL Taq酶 DNA模板

8.5检测结果的判定

取5 µL PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。根据特异性核酸条带大小和数目判断致泻大肠埃希氏菌的种类。见图1。

加样体积（µL）

8.3 2.5 2.5 3.0 0.4 0.4 0.1 0.1 0.2 0.2 0.4 0.4 0.1 0.1 0.4 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.4 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.7 2.0

图1 五种致泻大肠埃希氏菌目的基因多重PCR扩增片段

注：图中标示EPEC、EHEC（STEC）、ETEC、EIEC、EAEC的泳道为反应体系中仅存在相应的一种模板和12对引物同时扩增后出现的片段，而MIX泳道为将五种致泻大肠埃希氏菌混合后与12对引物同时扩增后出现的片段。 9 结果与报告

综合PCR试验、血清学试验报告结果。

附录A 培养基和试剂

A.1 EC肉汤 A.1.1 成分

胰蛋白胨或胰酪胨 3号胆盐或混合胆盐 乳糖

磷酸氢二钾（K2HPO4） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 氯化钠 蒸馏水 pH6.9±0.1

A.1.2 制法

将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管8mL。121℃高压灭菌15 min。 A.2 麦康凯琼脂（MAC） A.2.1 成分

蛋白胨 乳糖 3号胆盐 氯化钠 中性红 结晶紫 琼脂 蒸馏水 pH7.2±0.2 A.2.2 制法

将以上成分混合加热溶解，冷却至25 ℃左右校正调至7.2±0.2，分装，121℃高压灭菌15min。冷却至45 ～50 ℃，倾注平板。

注：如不立即使用，在2 ~8 ℃条件下可储存二周。 A.3 伊红美蓝琼脂(EMB) A.3.1 成分

蛋白胨 乳糖 磷酸氢二钾（K2HPO4） 琼脂 伊红γ（水溶液） 美蓝

10.0 g 10.0 g 2.0 g 15.0 g

0.4g或2％水溶液20.0 mL 0.065g或0.5％水溶液13.0 mL

20.0 g 10.0 g 1.5 g 5.0 g 0.03 g 0.001 g 15.0 g 1 000.0 mL

20.0 g 1.5 g 5.0 g 4.0 g 1.5 g 5.0 g 1 000.0 mL

蒸馏水 pH7.1±0.2

A.3.2 制法

在1 000 mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足。分装于三角烧瓶中。每瓶100 mL或200 mL，调节pH，高压灭菌。使用前将琼脂融化，于每 100mL琼脂中加 5 mL灭菌的20％乳糖溶液，2mL的2％的伊红 γ 水溶液和1.3mL 0.5％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45℃～50℃倾注平皿。 A.4 三糖铁琼脂(TSI) A.4.1 成分

蛋白胨 牛肉浸膏 乳糖 蔗糖 葡萄糖

硫酸亚铁铵[Fe(NH4)2·6H2O] 氯化钠

硫代硫酸钠 酚红 琼脂 蒸馏水

pH 7.40.2

A4.2 制法

20.0 g 5.0 g 10.0 g 10.0 g 1.0 g 0.2 g 5.0 g 0.2 g 0.025 g 12.0 g 1 000.0 mL 1 000.0 mL

除酚红和琼脂外，将其它成分加于400 mL水中，搅拌均匀，静置约10 min，加热使完全溶化，冷却至25 ℃左右校正调至pH 7.40.2。另将琼脂加于600 mL水中，静置约10 min，加热使完全溶化。将两溶液混合均匀，加入5%酚红水溶液5 mL，混匀，分装小号试管，每管约3 mL。于121 °C 灭菌15 min，制成高层斜面。冷却后呈桔红色。

注：如不立即使用，在2 ~8 ℃条件下可储存一个月。 A.5 营养琼脂斜面 A.5.1 成分

蛋白胨

牛肉膏 琼脂 蒸馏水

5.0 g 3.0 g 15.0 g 1 000.0 mL

pH 7.00.2 A.5.2 制法

将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2 mL，冷却至25 ℃左右校正调至pH7.00.2。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装小号试管，每管约3 mL。于121 °C 灭菌15 min，制成斜面。

注：如不立即使用，在2 ~8 ℃条件下可储存二周。

A.6 赖氨酸脱羧酶试验培养基 A.6.1 成分

蛋白胨 酵母浸膏 葡萄糖

1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液 L-氨基酸或DL-氨基酸 蒸馏水

pH 6.8±0.1 A.6.2 制法

除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入.再校正pH至6.8±0.1。对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面滴加一层石蜡油，115°C 高压灭菌10min。

A.6.3 试验方法

从琼脂斜面上挑取培养物接种，于36 °C1 °C培养18 h～24 h，观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为黄色。 A.7 尿素琼脂(pH7.2) A.7.1 成分

蛋白胨 氯化钠 葡萄糖 磷酸二氢钾

磷酸氢二钾 0.4%酚红溶液 琼脂

20%尿素溶液 蒸馏水 pH 7.20.1 A7.2 制法

除酚红和尿素外的其它成分加热溶解，冷却至25 ℃左右校正调至pH 7.20.1，加入酚红指示剂，混匀，于121 °C灭菌15 min。冷至约55 °C，加入过滤除菌的20%尿素水溶液100 mL，混匀，以无菌操作分装灭菌试管，每管约3~4 mL，制成斜面后放冰箱备用。 A7.3 试验方法

挑取琼脂培养物接种，在36 °C1 °C培养24 h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

A.8 蛋白胨水（靛基质试验） A.8.1 成分

1.0 g 5.0 g

1.0 g 2.0 g 1.0 g 3 mL 20.0 g 100 mL 900.0 mL

5.0g 3.0g 1.0g 1.0mL

0.5g/100 mL或1.0g/100 mL

1 000.0 mL

蛋白胨(或胰蛋白胨) 氯化钠 蒸馏水 pH7.4 A.8.2 制法

按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。 注：此试剂在2 ~8 ℃条件下可储存一个月。 A.8.3 靛基质试剂

A.8.3.1 柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸25mL。

A.8.3.2 欧－波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸20mL。 A.8.4 试验方法

挑取小量培养物接种，在36±1℃培养1～2d，必要时可培养4～5d。加入柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧－波试剂约0.5mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸。每批蛋白胨买来后，应先用已知菌种鉴定后方可使用，此试剂在2 ～8 ℃条件下可储存一个月。 A.9 半固体琼脂 A.9.1 成分

蛋白胨 1.0 g 牛肉膏 0.3 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 0.3 g 蒸馏水 100.0 mL pH7.4 A.9.2 制法

制法：将蛋白胨，牛肉膏和氯化钠加入于水中，校正pH后加入琼脂加热溶解，分装小试管，灭菌121℃ 15 min。 A.10 革兰氏染色液 A. 10.1 成分

A. 10.1 结晶紫染色液 A. 10.1.1 成分

结晶紫 95％乙醇 1％草酸铵水溶液 A. 10.1.2 制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A. 10.2 革兰氏碘液 A. 10.2.1 成分

1.0 g 20.0 mL 80.0 mL 20.0 g 5.0 ml 1 000.0 mL

碘 碘化钾 蒸馏水 A.10.2.2 制法

将碘与碘化钾先行混合，加入少许蒸馏水充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

A.10.3 沙黄复染液 A.10.3.1 成分

沙黄 95％乙醇 蒸馏水 A.10.3.2 制法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.10.4 染色法

A.10.4.1 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。 A.10.4.2 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

A.10.4.3 滴加95％乙醇脱色约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 A.10.4.4 滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。 A.11 缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR-VP试验用） A.11.1 成分

多胨 葡萄糖

磷酸氢二钾（K2HPO4） 蒸馏水 PH7.0

A.11.2 制法

将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH，分装试管，每管1 mL，121℃高压灭菌15 min，备用。

A.11.3 甲基红（MR）试验 A.11.3.1 甲基红试剂 A.11.3.1.1 成分

甲基红

95%乙醇 蒸馏水

A.11.1.2 制法

10mg甲基红溶于30 mL95%乙醇中，然后加入20 mL蒸馏水。 A.11.1.3 试验方法

取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水，36℃±1℃培养2 d～5 d。滴加甲基红试剂一滴，立即观察结果。鲜红色为阳性，黄色为阴性。 A.11.4 V-P 试验

A.11.4.1 6% α-萘酚-乙醇溶液

10.0 mg 30.0 mL 20.0 mL 7.0 g 5.0 g 5.0 g 1 000.0 mL

0.25 g 10.0 mL 90.0 mL 1.0 g 2.0 g 300.0 mL

成分及制法：取α-萘酚6.0 g，加无水乙醇溶解，定容至100 mL。 A.11.4.2 40 %氢氧化钾溶液：

成分及制法：取氢氧化钾40 g，加蒸馏水溶解，定容至100 mL。 A.11.4.3 试验方法

取适量琼脂培养物接种于缓冲葡萄糖蛋白胨水，36℃±1℃培养2 d～4 d。加入6% α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL和40 %氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果。阳性反应立刻或于数分钟内出现红色，如为阴性，应放在36℃±1 ℃继续培养4 h 再进行观察。