多重耐药大肠杆菌中的主动外排机制
2010-03-24 张小林 汪复 朱德妹
摘要 目的 研究主动外排系统在多重耐药大肠杆菌中的作用。方法 用抽滤法测定了3H-四环素和3H-青霉素在临床分离的大肠杆菌中的积聚。结果 在临床分离的多重耐药大肠杆菌中四环素和青霉素稳态浓度均显著低于敏感株；供能时稳态浓度明显下降，给予能量抑制剂后细胞内药物浓度则又显著上升，而敏感株变化不明显。LM313.1(大肠杆菌野生株AG100经诱导产生的多重耐药株)对四环素的积聚及对CCCP的反应与临床分离多重耐药株一致，而LM313.5(LM313.1经噬菌体将Tn5插入marA并使之失活的突变株)与临床分离的敏感株一致。结论 多重耐药大肠杆菌中存在四环素和青霉素的主动外排系统。主动外排系统是其形成多重耐药的机制之一。
关键词 大肠杆菌 耐药机制 主动外排系统
Active efflux of tetracycline and penicillin
in multiple-antibiotic-resistant (Mar)
Escherichia coli
ZHANG Xiaolin, WANG Fu, ZHU Demei. Institute of Antobiotics, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040
Abstract Objective To investigate the active efflux system of antibiotics in multiple-antibiotic-resistant (Mar) Escherichia coli. Methods The accumulation of 3H-tetracycline and 3H-penicillin were determined using filtration method.Results The steady concentration of drugs in Mar strains of Escherichia coli were significantly lower than those in susceptible strains. Moreover, in Mar strains, the steady concentration significantly decreased with energy supply and remarkably increased with inhibition of energy supply; however, in the susceptible strain, the change was not significant. In LM313.1 (Mar mutant of wild strain AG100), the accumulation of tetracycline and penicillin was similar to clinical Mar strains, while in LM313.5(marA in LM313.1 inactived by insertion of Tn5), the accumulation of tetracycline and penicillin was similar to susceptibile isolates.Conclusion There are active efflux pump(s) of tetracycline and penicillin in Mar Escherichia coli, which plays an important role in multiple-antibiotic-resistance.
Key words Escherichia coli Active efflux Resistance mechanism
细菌的耐药机制非常复杂。常见的耐药机制包括抗菌药物灭活酶(钝化酶)的产生、抗菌药物作用靶位的改变以及细胞膜通透性的改变。然而，这些机制尚难以完全解释多重耐药菌株对许多化学结构完全不同的抗菌药物所产生的高度耐药性［1］。近年来的研究表明，在一些细菌中存在主动外排现象，即细菌能够将扩散进细胞内的多种抗菌药物主动泵出细胞外，从而使细菌获得耐药性［1，2］。本文作者研究了临床分离的多重耐药(multiple-antibiotic-resist
ant,Mar)大肠杆菌对四环素和青霉素的主动外排机制，报道如下。
材料和方法
一、试剂
3H-四环素(DuPont 0.77Ci/mmol)；3H-青霉素(Amershan 21.0Ci/mmol);氰氯苯腙(carbonylcyanide-chlorphenylhydrazone,CCCP)(Sigma);LB肉汤(Luria-Bertani broth)pH7.0每升含NaCl 10g胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g。
二、菌株
LM313.1为大肠杆菌野生株AG100经氯霉素诱导的耐药株，LM313.5是LM313.1经噬菌体将Tn5插入marA并使之失活的突变株(美国Tufts大学的Levy SB博士赠送)。
对上海医科大学华山医院1994～1995年度临床分离的大肠杆菌进行筛选。以对氯霉素(Chl)、四环素(Tet)、哌拉西林(Pip)、庆大霉素(Gen)、诺氟沙星(Nor)、环丙沙星(Cip)均耐药的菌株作为多重耐药株，均敏感的菌株作为敏感野生株。筛选标准见表1。
表1 大肠杆菌耐药和敏感标准(MIC μg/ml)
抗 菌 药 物
Pip Gen Tet Chl Nor Cip
耐药 ≥128 ≥8 ≥16 ≥32 ≥16 ≥4
敏感 ≤4 ≤0.5 ≤1 ≤2 ≤1 ≤0.25
三、最低抑菌浓度(MIC)测定
以琼脂稀释法测定抗菌药物对大肠杆菌的MIC。
四、大肠杆菌对四环素和青霉素积聚试验
从MH琼脂平板上挑取新鲜纯分的大肠杆菌单个菌落，于200ml LB肉汤37°C培养至A530=0.7～0.8，收集细菌并悬浮于磷酸钠缓冲液(pH6.0,含1mmol/L MnSO4、0.2%葡萄糖或不含葡萄糖)中，达120倍A530值,37°C水浴，加入3H-四环素或3H-青霉素，使其终浓度为5μmol/L，分别于1、5、10、15分钟取样50μl，然后加入CCCP(终浓度为250μmol/L或葡萄糖终浓度为0.2%)，每隔5分钟取样一次，加入葡萄糖者取样二次后，加入CCCP，再每隔5分钟取样。所取样品均置于磷酸钠缓冲液(含0.1mol/l LiCl)1ml中，冰水浴，抽滤(Φ0.45μmol/L),干燥，液体闪烁计数器计数。大肠杆菌细胞内抗菌药物浓度以pmol/mg(蛋白)计。
结果
一、选择菌株对6种抗菌药物的敏感性(MIC μg/ml)
见表2。
表2 选择大肠杆菌对抗菌药物的敏感性(MIC μg/ml)
菌株 抗 菌 药 物
Pip Gen Tet Chl Nor Cip
R12 ≥256 ≥16 ≥32 ≥64 ≥32 ≥8
R28 ≥256 ≥16 ≥32 ≥64 ≥32 ≥8
S36 ≤4 ≤0.5 ≤1 ≤2 ≤1 ≤0.25
LM313.1 4 0.25 4 ≥64 0.5 0.125
LM313.5 0.06 0.25 0.25 8 0.03 0.016
ATCC25922 1 1 0.5 2 0.5 0.008
从临床分离菌株中筛选出多重耐药株R12、R28，敏感株S36。
二、临床分离大肠杆菌敏感株S36和多重耐药株R28、R12对四环素的积聚
加入3H-四环素大约1分钟后，R28、R12、S36细胞内四环素均达稳态浓度，R28的稳态浓度约为S36的40%，R12为S36的50%。加入CCCP后，R12、R28中四环素浓度上升了1倍多，而S36上升不明显。见图1。
图1 大肠杆菌多重耐药株R12、R28和敏感株S36对
四环素的积聚
三、葡萄糖和能量抑制剂对R12四环素的积聚的影响