实验3 生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析
3.1 相关基础知识
凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、分子筛层析和凝胶渗透层析，是一种按分子大小分离物质的层析方法，广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且
呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合
物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛
孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的
程度可用分配系数Kav （被分离化合物在内水和外水体积中的比例
关系）表示。Kav 值的大小与凝胶床的总体积（Vt ）、外水体积（Vo ）及分离物本身的洗脱体积（Ve ）有关，即：
Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)
在限定的层析条件下，Vt 和Vo 都是恒定值，而Ve 值却是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav 值小；反之，则Kav 值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav 值的差异性，Kav 值差异性大，分离效果好；Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
分配系数Kav 既是判断分离效果的一个参数，又是测定蛋白质分子量的一个依据。从公式Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)可知，只要测出床体积Vt 和外水体积Vo 以及洗脱体积Ve ，即可计算出Kav 值。而凝胶床总体积Vt 可用二种方法得到：
计算法：根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式表示
Vt= πr 2h
式中r 为层析柱半径；h 为凝胶床高度；π为圆周率。在用此公式计算凝胶床总体积时，须精确地分段测量，以防内径不匀造成误差。另外还须注意到，在层析过程中，尤其是软胶的操作压力要小，以防凝胶床的高度降低。
测量法：由凝胶床的组成可知，床体积Vt 等于外水体积Vo 、内水体积Vi 与凝胶颗粒实际占有体积Vg 之和。即
Vt= V0+Vi+Vg
因Vg 与Vt 相比很小，可忽略不计，故
Vt= V0+Vi
而Vo 和Vi 可通过实验测得：当把分子量不同
的混合溶液铺在凝胶床上时，其在内水体积和外水
体积中的分布是不一样的。溶液中的分子大于凝胶孔径上限者不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中。凝胶床的洗脱体积Ve 刚好等于外水体积。即Ve=Vo (Kav=0)。然而，溶液中的分子小于凝胶孔径下限者能自由进入凝胶网孔内，凝胶床的洗脱体积Ve 应等于凝胶床总体积，即Ve= Vt= Vo+Vi (Kav=1)。而溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则能进入部分凝胶网孔中，故其洗脱体积Ve 是在Vo 和Vt 之间（Kav 在0-1之间）。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm 或260nm 或620nm ）洗脱体积（即Vo ）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。测定内水体积（Vi ）的物质，可选用硫酸铵、N-
乙酰酪氨酸乙酯，或者
其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
以床体积Vt （等于 r 2h ）和测得值Vo 来计算分配系数的值为Kav ，若以床体积Vt （等于Vo+Vi）和测得值Vo 来计算分配系数的值为Kd 。在同一层析条件下，对同一物质计算出来的Kav 和Kd 值尽管有一定的差异性，但都是有效的。只因Kav 计算方便，所以目前多使用Kav 。分离物在凝胶过滤层析时的行为，除用Kav 和Kd 表示外，还可用Ve/Vo或Vo/Ve（R 值）表示。
凝胶过滤不仅常用做物质的分离，还可以根据需要用某种试剂非常方便地处理某种物质，当该物质流经试剂区时，因为可连续接触新鲜试剂，因而可以充分发生反应，最后经过洗脱，再与过量的试剂分开。本实验就是通过凝胶过滤，用还原剂FeSO 4处理血红蛋白。即首先在层析柱中加入含有还原剂的溶液，使形成一个还原区带，当血红蛋白样品（血红蛋白与铁氰化钾的混合液）流经还原区带时，褐色的高铁血红蛋白立即生成紫色的还原型血红蛋白，随着还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧分子结合又形成了鲜红的血红蛋白。铁氰化钾则因分子量小，在层析柱中呈现其本来的黄色带而远远地落在血红蛋白的后边。
本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼观察即可检验分离效果。
3.2 实验目的和要求
(1)
(2)
(3)
(4) 了解生物化学领域中大分子分离纯化的各种方法。 了解凝胶层析的原理以及应用。 通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝胶层析技术。 进一步掌握包括离子交换柱层析、亲和层析及吸附层析等其它分离纯化的方法。
3.3 实验材料和器材
3.3.1 实验器材
(1) 层析柱：Ø10mm×20cm；
(2) 恒流泵；
(3) 500ml ，250ml 试剂瓶；
(4) 50ml 烧杯；
(5) 其它：医用镊子；5ml 带刻度滴管；圆片滤纸。
3.3.2 实验材料与试剂
(1) 20mM 磷酸二氢钠；
(2) 20mM 磷酸氢二钠；
(3) pH7.0，20mM 磷酸缓冲液：将(1)、(2)以61:29的比例混和；
(4) 40mM FeSO4(用时现配) ；
(5) 0.2M Na2HPO 4，80mM Na2H 2EDTA ；
(6) 抗凝血（哺乳动物血样，以1：6的比例加入2.5%柠檬酸钠，置于4℃冰箱中保存。
贮存期以不超过3个月为宜）；
(7) 葡聚糖凝胶：Sephadex G-25；
(8) 固体铁氰化钾。
3.4 实验方法与步骤
3.4.1 葡聚糖凝胶的预处理
取3克葡聚糖凝胶（Sephadex-25）干粉，浸泡于50ml 蒸馏水中充分溶胀（室温，12h ），然后反复倾斜除去表面的悬浮微粒，再加入pH7.0磷酸缓冲液沸水浴中2-3h 去除颗粒内部空气，最后加入pH7.0磷酸缓冲液浸泡过夜备用。
3.4.2 装柱
(1) 将层析柱垂直固定在铁架台上，注意上下不要颠倒；
(2) 将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约1-2cm 高的缓冲液，把溶胀好的糊状
凝胶边搅拌边倒入柱中，最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱
床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少8cm 。自然沉降20min ，最后放入略小于层析柱内径的圆形滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。
3.4.3 平衡
以恒流泵控制流速为1滴/5秒，用磷酸缓冲液洗脱平衡10min 。注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。
3.4.3 血红蛋白样品的制备
取1ml 抗凝血于烧杯中，加入10ml pH7.0 20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，使浓度达到5mg/ml。
3.4.5 层析柱还原层的形成
取1ml 40mMFeSO4于小烧杯中，加入1ml 0.2M Na2HPO 4,80mM Na2H 2EDTA 混合液搅拌均匀。待层析柱上缓冲液几乎全部进入凝胶时，速取该混合液0.4ml 加入层析柱中，待混合液完全进入柱床后加入0.7ml 缓冲液。（注意还原剂的混合液要新鲜配制，尽可能缩短在空气中暴露的时间）。
3.4.6 上样
将柱中多余的液体从底部流出后关闭止水螺丝, 取前面制备好的血红蛋白样品0.5ml ，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品溶液流入柱内。
3.4.7 洗脱
用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约1滴/5秒的流速，观察并记录实验现象。
3.4.8 清洗
待所有色带流出层析柱后，加快流速，继续清洗层析柱2min 。回收凝胶，以备再用。
3.5 问题讨论
(1) 在向凝胶柱加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？
(2) 请解释为什么在洗脱样品时，流速不能太快或者太慢？
(3) 某样品中含有1 mg A蛋白（Mr 10,000Da），1 mg B蛋白（Mr 30,000Da），4 mg C蛋
白（Mr 60,000Da），1 mg D蛋白（Mr 90,000Da），1 mg E蛋白（Mr 120,000Da），采用Sephadex G75（排阻上下限为3,000 －70,000Da ）凝胶柱层析，请指出各蛋白的洗脱顺序。
3.6.1 实验名称
3.6.2 实验日期
3.6.3 学生姓名
3.6.4 指导老师
3.6.5 实验现象记录
3.6 实验记录和报告