志贺氏菌属及其检验
摘要：志贺氏菌属（Shigella） 的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主，营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。志贺氏菌引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途径传播，在拥挤和不卫生条件下能迅速传播，经常发现于人员大量集中的地方如餐厅、食堂。
关键词：志贺氏菌属、生物学性状、微生物学诊断、致病性、免疫性
前 言
志贺氏菌病常为食物爆发型或经水传播。食源性志贺氏菌流行的最主要原因是从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品，食品接触人员个人卫生差，存放已污染的食品温度不适当等。和志贺氏菌病相关的食品包括色拉（土豆、金枪鱼、虾、通心粉、鸡），生的蔬菜，奶和奶制品，禽，水果，面包制品，汉堡包，和有鳍鱼类。人类对痢疾杆菌有很高的易感性，在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。
1. 生物学性状
1.1 形态与染色特性
志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3μ m ,宽0.5-0.7μ m 。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。DNA的G+C为49-53克分子%（Tm法）。
1.2 培养特性
需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。
1.3 生化特性
本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类。
志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。
A、不分解甘露醇组：主要为志贺氏菌。又根据能否产生靛基质，进一步分靛基质阳性（1、3、4、5、6、9、10型）和靛基质阴性（2、7、8型）的志贺氏痢疾菌。
B、分解甘露醇组：包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。再按乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。后者进一步再根据靛基质产生与否，分靛基质阳性（福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型）和靛基质阴性（福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14）二类（见表一）
1.4血清学特性
抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。主要抗原有三种。
型特异性抗原：型多糖抗原为菌体抗原的一种，是光滑型菌株所含有的重要抗原。当菌株变为粗糙型时，此抗原也常随之消失，各菌型所含的型抗原不同，可用于区别菌种的型别。
群特异性抗原：为光滑型菌株的次要抗原，也是菌体抗原的一种。特异性较低，常在数种近似的菌内出现。在福氏菌株中，由于所含群抗原不同，可将某些菌型分为多种亚型，如福氏菌2型，根据群抗原不同，可分成2a、2b两个亚型。 表面抗原（K抗原）：在新分离的某些菌株菌体表面含有此种抗原。不耐热，加热100℃1小时即被破坏。具有此种抗原的菌株，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集。
根据抗原构造的不同，按最新国际分类法，将本属细菌分为四个群、39个血清型（包括亚型）（见表二）
表二 志贺氏菌属抗原的分类
A群：也称志贺氏菌群，有10个血清型。不发酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶，与其他各群细菌无血清学联系。
B群：也称福氏菌群，已有13个血清型（包括亚型和变种）。最近又发现3个亚型（1c、4c、5b）。发酵甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。抗原结构较复杂，各型间有交叉凝集。每一福氏菌型具有二种抗原，即型特异性抗原和群抗原，前者只存在于同型菌株中，后者有许多种，存在于福氏各菌型中。例如福氏1b型除含有1型特异性抗原外，尚含有4、6群抗原。
C群：也称鲍氏菌群，有15个血清型，分解甘露醇，无鸟氨酸脱羧酶。各型内无交叉凝集。
D群：也称宋内氏菌群，仅有一个血清型。分解甘露醇，有鸟氨酸脱羧酶，迟缓发酵乳糖。有Ⅰ、Ⅱ相之分。
1.5 抵抗力
志贺氏菌属在外界环境中的生存力，以宋内氏最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。一般在潮湿土壤中能存活34天，37℃水中存活20天，在冰块中可存活96天，在粪便内（室温）存活11天。日光直接照射30分钟，56-60℃10分即被杀死，对高温和化学消毒剂很敏感，1%石炭酸中15-30分钟即被杀死，对氯霉素、磺胺类、链霉素敏感，但易产生耐药性。
1.6 变异性
S-R型变异：菌落可由光滑型变为粗糙型，同时常伴有生化反应、抗原构造和致病性的变异。在机体内，尤其在慢性患者和恢复期患者，志贺氏菌可发生变异而失去原来的生化和抗原特性，成为不典型菌株。但其中部分不典型菌株，可通过10%胆汁肉汤等返祖为典型菌株。故在慢性患者或带菌者粪便检查时，对这类菌株要特别注意，必须多次反复检查。因这对传染源的发现及控制有重要意义。 耐药性变异：自从广泛使用抗菌素以来，志贺氏菌的耐药菌株 不断增加，给防治工作带来许多困难。国内部分地区报道（1972-1974），志贺氏菌对四环素的耐药率达74%、氯霉素73.6-97%、链霉素84-98%、合霉素75-100%、磺胺类97-100%，可见国内对常用几种抗菌素的耐药率相当高。
毒力变异与其他变异：1963年南斯拉夫Mel氏首先创用依赖链霉素的志贺氏菌株（依链Sd株，口服预防痢疾。Sd株是一株必须有链霉素存在下才能生长的菌株，其毒力减弱但仍保持免疫原性。美国以天然变异无毒株与大肠杆菌杂交而获得的MH株制成疫苗，其免疫效果和稳定性均较Sd株差。我国正大力利用变异方法通过动物和药物处理等寻找安全有效可供口服的痢疾杆菌活菌苗，并已取得初步成效。
2 致病性
志贺氏菌引起的细菌性痢疾，主要通过消化道途径传播。根据宿主的健康状况和年龄，只需少量病菌（至少为10个细胞）进入，就有可能致病。
2.1致病因素
志贺氏菌的致病作用，主要是侵袭力、菌体内毒素个别菌株能产生外毒素。 侵袭力：志贺氏菌进入大肠后，由于菌毛的作用粘附于大肠粘膜的上皮细胞上，继而进入上皮细胞并在内繁殖，扩散至邻近细胞及上皮下层。由于毒素的作用，上皮细胞死亡，粘膜下发炎，并有毛细吸管血栓形成以至坏死、脱落，形成溃疡。志贺氏菌一般不侵犯其他组织，偶尔可引起败血症。目前认为不论是产生外毒素的还是只有内毒素的志贺氏菌，必须侵入肠壁才能致病。因此，对粘膜组织的侵袭力是决定致病力的主要因素。
内毒素：志贺氏菌属中各菌株都有强烈的内毒素，作用于肠壁，使通透性增高，从而促进毒素的吸收。继而作用于中枢神经系统及心血管系统，引起临床上一系列毒血症症状，如发热、神志障碍，甚至中毒性休克。毒素破坏粘膜，形成炎症、溃疡，呈现典型的痢疾脓血便。毒素作用于肠壁植物神经，使肠道功能紊乱，肠蠕动共济失调和痉挛，尤其直肠括约肌最明显，因而发生腹痛、里急后重等症状。
外毒素：志贺氏菌1型及部分2型（斯密兹痢疾杆菌）菌株能产生强烈的外毒素。为蛋白质，不耐热，75-80℃1小时即可破坏。其作用是使肠粘膜通透性增加，并导致血管内皮细胞损害。外毒素经甲醛或紫外线处理可脱毒成类毒素，能刺激机体产生相应的抗毒素。一般认为具有外毒素的志贺氏菌引起的痢疾比较严重。
2.2 所致疾病：志贺氏菌引起的细菌性痢疾可分为两类6型。
A、急性细菌性痢疾：又分急性典型、急性非典型、急性中毒性菌痢三型。急性典型菌痢症状典型，有腹痛腹泻、脓血粘便、里急后重、发热等症状。各型菌都可引起，以志贺氏菌引起的较重，宋内氏菌引起的较轻。经治疗，预后良好。如治疗不彻底，可转为慢性。急性非典型菌痢症状不典型，易诊断错误延误治疗，常导致带菌或慢性发展。急性中毒性菌痢小儿多见，各型菌都可发生。中毒性菌痢一系列的病理生理变化，主要是内毒素造成机体微循环障碍的结果。导致内脏淤血、周围循环衰竭（休克），主要功能器官灌注不足，发生心力衰竭、脑水肿，急性肾功能衰竭。严重微循环障碍，再加上内毒素损伤血管内皮细胞、激活凝血因子等，而发生弥漫性血管内凝血（DIC）。
B、慢性细菌性痢疾：又分慢性迁延型、慢性隐伏型、急性发作型三型。慢性迁延型，通常由急性菌痢治疗不彻底等引起。病程超过2个月，时愈时发，大便培养阳性率低。在有临床症状时为急性发作型，该型往往在半年内有急性菌痢病史。慢性隐伏型菌痢，是在一年内有过菌痢病史，临床症状早已消失，但直肠镜可发现病变或大便培养阳性。
志贺氏菌带菌者有三种类型。A.健康带菌者，是指临床上无肠道症状而又能排出痢疾杆菌者。这种带菌者是主要传染源，特别是饮食业、炊事员、和保育员中的带菌者，潜在的危险性更大。B.恢复期带菌者，是指临床症状已治愈的病人，仍继续排菌达2周之久者。C.慢性带菌者，是指临床症状已治愈，但长期排菌者。
2.3 免疫性
病后有一定的免疫力，但免疫期短，也不稳定。可能因本菌属菌型众多，相互间无交叉免疫性之故。免疫性与血中抗体似乎无关，而与肠道粘膜细胞吞噬能力加强和机体对痢疾杆菌内毒素耐受性提高有关。肠道分泌型抗体即粪抗体亦有一定作用。粪抗体出现早、消失快，在脓血粘便中，粪抗体检出率高达90%。这
为志贺氏疫苗经口免疫的可能性，提供了理论依据。
3 主要症状
潜伏期一般为10-20h，短者6h，病人会出现剧烈的腹痛、呕吐及频繁的腹泻，并伴有水样便，便中混有血液，发热，体温高者可达40度以上，病人出现痉挛。 4 流行病学
人和灵长类是志贺氏菌的适宜宿主，营养不良的幼儿、老人及免疫缺陷者更为易感。据报道，每年约有14000例志贺氏菌病，但估计发病人数为30万。据FDA统计，1997年美国加州等5个州食源性疾病共为8051例，其中志贺氏菌引起的为1263例。
志贺氏菌病常为食物爆发型或经水传播。和志贺氏菌病相关的食品包括色拉（土豆、金枪鱼、虾、通心粉、鸡），生的蔬菜，奶和奶制品，禽，水果，面包制品，汉堡包，和有鳍鱼类。志贺氏菌在拥挤和不卫生条件下能迅速传播，经常发现于人员大量集中的地方如餐厅、食堂。食源性志贺氏菌流行的最主要原因是从事食品加工行业人员患菌痢或带菌者污染食品，食品接触人员个人卫生差，存放已污染的食品温度不适当等。
5 检验
5.1检验所需的器材
检验志贺氏菌需要的培养基和试剂有CN曾菌液、HE琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、伊红美兰琼脂（EBM）、三糖铁琼脂（TSI）、葡萄糖半固体管、半固体管、葡萄糖胺琼脂、尿素琼脂（pH7.2）、西蒙氏柠檬酸盐琼脂、氰化钾（KCN）培养基、氨基酸脱羧酶试验培养基（赖氨酸、鸟氨酸及对照培养基）、发酵管（棉籽糖、甘露醇、甘油、七叶苷）、5%乳糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、志贺氏菌属诊断血清等。
检验志贺氏菌还需要以下基本仪器和用具：天平、均质器或乳钵、培养箱、显微镜、载玻片、酒精灯、500ml灭菌广口瓶、500ml和250ml灭菌三角烧瓶、灭菌平皿、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、镍铬丝、试管架、试管篓等。
硝酸纤维素滤膜：150mm*50mm，直径0.45微米.临用时切成两张,每张70mm*50mm,用铅笔划格,每格6mm*6mm。每行10格,分6行。灭菌备用。
5.2志贺氏菌检验程序
采样-增菌-分离和初步生化试验-血清学分型-进一步的生化试验-已判定为志贺氏菌属的培养物进一步做试验
5.2.1采样
按照采样原则对食品进行采集。如果有食物中毒，可从剩余食物、病人吐泻物分离志贺氏菌。
5.2.2增菌
称取检样25g，加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培养6～8h。
培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
5.2.3分离和初步生化试验
取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36℃培养18～24h。 志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培养18～24h，分别观察结果。
下述培养物可以弃去：
a. 在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；
b. 在18～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；
c. 不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；
d. 产气的培养物；
e. 有动力的培养物；
f. 产生硫化氢的培养物。
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气(福氏志贺氏菌6型可产生少量气体)，无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
5.2.4血清学分型
挑取三糖铁琼脂上的培养物，做玻片凝集试验。
先用4种志贺氏菌多价血清检查，如果由于K抗原的存在而不出现凝集，应将菌液煮沸后再检查；
如果呈现凝集，则用A1、A2、B群多价和D群血清分别试验。
如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见“表一”。可先用群因子血清检查，再根据群因子血清出现凝集的结果，依次选用型因子血清检查。4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1～15各型因子血清检查。如果鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3～12型多价血清及各型因子血清检查。
5.2.5 进一步的生化试验
在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：
葡萄糖铵
西蒙氏柠檬酸盐
赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶
pH7.2尿素
KCN生长
水杨苷和七叶苷的分解
除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。必要时还应做革兰氏染色检查和氧化酶试验，应为氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌。生化反应不符合的菌株，即使能与某种志贺氏菌分型血清发生凝集，仍不得判定为志贺氏菌属的培养物。
5.2.6已判定为志贺氏菌属的培养物，应进一步做
a、5%乳糖发酵
b、甘露醇
c、棉子糖
d、甘油的发酵
e、靛基质试验
志贺氏菌属4个生化群的培养物，应符合该群的生化特性。但福氏6型的生化特性与A群或C群相似。
5.3 结果报告：综合生化和血清学的试验结果判定菌型并作出报告。
5.4 快速诊断法
5.4.1 荧光菌球法
适于检查急性菌痢的粪便标本。将标本接种于含有荧光素标记的志贺氏菌免疫血清液体培养基中，37℃培养4～8小时。如标本中有相应型别的痢疾杆菌，繁殖后与荧光素抗体凝集成小菌球，在低倍或高倍荧光显微镜下易于检出。方法简便、快速，有一定的特异性。
5.4.2 协同凝集试验
用志贺氏菌的lgG抗体与富含A蛋白的葡萄球菌结合，以此为试剂，测定患者粪便滤液中志贺氏菌的可溶性抗原。
结论及意义
研究志贺氏菌属的生物学性状、微生物学诊断、致病性、免疫性等方面，可以让我们更加了解志贺氏菌属，并能有效的降低由志贺氏菌的污染带来的损失。预防控制志贺氏菌流行最好的措施是良好个人卫生和健康教育，水源和污水的卫生处理能防止水源性志贺氏菌的爆发。对可疑的食品，在食用前要经过严格的处理。一般来说，当食品中含有大肠菌群、大肠杆菌和沙门氏菌时，含有志贺氏菌的可能性极大。
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