微生物学实验室常用试剂与培养基
第一节 常用试剂及其使用方法
一、诊断用纸片
⑴ 杆菌肽纸片（0.04U/片）：抑菌圈>10mm为敏感。质控菌株: D群链球菌阴性, A群链球菌阳性。
⑵ SMZ纸片（1.25μg/片、23.75μg/片）：出现抑菌圈即为敏感。质控菌株：D群链球菌阳性， A群链球菌阴性。
⑶ 新生霉素纸片（5.0μg/片）：抑菌圈≥16mm为敏感。质控菌株：表皮葡萄球菌阳性， 腐生葡萄球菌阴性。
⑷ O129纸片、奥普托欣（Optochin）纸片：参见第五节《生化试验培养基》。
二、诊断用血清 1.沙门菌属诊断血清
⑴ A-F群O多价诊断血清。
⑵ 特异O群因子诊断血清：常用的有O2，O4，O7，O9，O10诊断血清。
⑶ 特异H因子诊断血清 常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子诊断血清。
2.志贺菌属诊断血清
志贺菌属4种多价血清：痢疾志贺菌Ⅰ、Ⅱ血清，福氏志贺菌多价血清及分型血清（1～6型），宋内志贺菌诊断血清，鲍氏志贺菌多价血清及分型血清。
3.致病性大肠埃希菌诊断血清
肠致病性大肠埃希菌（EPEC）诊断血清，产肠毒素大肠埃希菌（ETEC）诊断血清，肠侵袭性大肠埃希菌（EIEC）诊断血清，肠出血性大肠埃希菌（EHEC）诊断血清O157： H 7。
4.霍乱弧菌O1、O139混合多
价诊断血清及稻叶、小川、彦岛O139分型血清
5.脑膜炎奈瑟菌多价血清及分群血清
6.链球菌分类诊断血清 7.肺炎链球菌诊断血清
8.耶尔森菌诊断血清 三、常用染色液
1.革兰染色液
⑴ 结晶紫溶液 A液：结晶紫 20g，95%乙醇20 ml； B液：草酸铵 0.8g， 蒸馏水80 ml。
染色前24h将A液、 B液混合,过滤后装入试剂瓶内备用。
⑵ 碘液:碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。
将碘与碘化钾混合并研磨,加入几毫升蒸馏水, 使其逐渐溶解,然后研磨,继续加入少量蒸馏水至碘、碘化钾完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水将碘化钾完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。
⑶ 脱色液：95%乙醇
⑷ 复染液：沙黄2.5g，95%乙醇100ml为贮存液，取贮存液10ml，加蒸馏水90ml为应用液。
2.抗酸染色液
⑴ 碱性复红染色液： ①萋纳石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和溶液10ml，5%石炭酸溶液90ml。 ②脱色液：浓盐酸3ml，95%乙醇97ml。③复染液(吕弗勒美蓝液)：美蓝乙醇饱和溶液30ml，100g/L氢氧化钾溶液0.1ml，蒸馏水100ml。
⑵ 金胺O-罗丹明B染色液： ①罗丹明B液：罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml。②1g/L金胺O液：金胺O液0.1g加蒸馏水95ml,再加入纯石炭酸
5ml,混匀。③3%盐酸乙醇。④稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液100ml,加蒸馏水90ml,混匀。
100ml。乙液：碘 2g，碘化钾3g，蒸馏水300ml。
先将碘化钾加入少许蒸馏水(约
3.鞭毛染色液(改良Ryu法) 2ml),充分振摇,待完全溶解,再加入碘,
使完全溶解后, 加蒸馏水至300ml。 A液：5%石炭酸10ml，鞣酸2g，
5.荚膜染色液 饱和硫酸铝钾溶液 10ml； B液：结晶
⑴ 印度墨汁或50g/L黑色素水溶紫乙醇饱和液。应用液A液10份,B液
液 1份,混合,室温存放备用。
⑵ 5g/L苯胺蓝水溶液。 4.异染颗粒染色液
甲液：甲苯胺蓝 0.15g，孔雀绿 2g/L， 95% 乙醇2.0ml，蒸馏水
第二节 基础培养基
一、液体基础培养基
1.蛋白胨水
3.牛肉浸液培养基
[用途]
细菌培养最基础的培养基，除用[用途]
于一般细菌的培养外，又可以作营养用于细菌靛基质试验；一般细菌培
琼脂及其它培养基的基础。 养和传代。
[配法] [配法]
新鲜除脂牛肉 500g，氯化钠5g 蛋白胨（或胰蛋白胨）10g，氯化
蛋白胨10g，蒸馏水1L。 钠 5g，蒸馏水1L。
将上述成分溶于水中，校正pH 先将牛肉清洗，除脂肪、肌腱，
并切块绞碎。称取500g置容器加入蒸至7.2,分装试管，每管2~3ml，置
馏水1L，搅匀后置冰箱过夜，次日煮121℃灭菌15min备用。
沸加热30min，并用玻棒不时搅拌用绒[质量控制]
布或麻布进行粗过滤，再用脱脂棉过大肠埃希菌生长良好，靛基质阳
滤即成。在过滤中加入蛋白胨10g、氯性；伤寒沙门菌生长良好，靛基质阴
化钠5g溶解后，用氢氧化钠溶液校正性。
pH至7.6~7.8，并加热煮沸10min，补2.营养肉汤
充蒸馏水至1L，最后用滤纸过滤，呈[用途]
清晰透明、淡黄色液体，经一般细菌的增菌培养，加入1%的
121℃15min灭菌备用。 琼脂粉亦可作营养琼脂。
[用法] [配法]
根据用途不同可以制成营养肉 蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠
汤，以此为基础制成其它培养基。如5g，蒸馏水1L。
制作固体培养基，加入琼脂15 ~20g/L 将上述成分称量混合溶解于水
即可。 中，校正pH至7.4，按用途不同分装
[质量控制] 于烧瓶或试管内。经121℃灭菌
金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、15min，作无菌试验后冷藏备用。
伤寒沙门菌、痢疾志贺菌等均生长良 [质量控制]
好。 金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、
[保存] 化脓性链球菌生长良好。
置4℃冰箱内可以使用较长时间。 [保存]
注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量为
置冰箱3周内用完。
3～5g/L。
[用途]
主要用于嗜血杆菌的分离培养，二、固体基础培养基
亦可用于奈瑟菌的增殖培养。 1.营养琼脂
[配法] [用途]
鲜牛肉浸出液1L， 蛋白胨10g, 一般细菌和菌株的纯化及传种。
氯化钠5g，琼脂粉12g，无菌脱纤维 [配法]
羊血或兔血100ml。 蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠
将上述成分（除兔血外）加热溶5g，琼脂粉（优质）12g，蒸馏水1L。
将上述成分(除琼脂外)溶于水
中，校正pH 7.2～7.4后加入琼脂，
煮沸溶解，根据用途不同进行分装，
经121℃灭菌15min，倾注平板或制成
斜面，冷藏备用。
[质量控制]
金黄色葡萄球菌菌落呈浅黄色； 痢疾志贺菌菌落无色；铜绿假单胞菌 菌落无色或浅绿色。
[保存]
置4℃冰箱保存，2周内用完。
2.血琼脂培养基
[用途]
一般病原菌的分离培养和溶血性
鉴别及保存菌种。
[配法]
pH 7.4~7.6牛肉浸液琼脂 100ml，脱纤
维羊血(或兔血) 5~10ml。
将血琼脂基础经121℃灭菌
15min，待冷却至50℃左右以无菌手续
加入羊血，摇匀后立即倾注灭菌平皿
内，待凝固后，经无菌实验冷藏备
用。
[质量控制]
化脓性链球菌ATCC 19615生长良
好，β-溶血；肺炎链球菌ATCC 6303
生长良好，α-溶血；表皮葡萄球菌
ATCC 12228 生长良好,不溶血。
[保存]
置4℃冰箱，1周内用完。
3.巧克力琼脂培养基
解，调pH至7.2，置121℃15min高压灭菌，待冷至约85℃，以无菌方式加入兔血，摇匀后置85℃水浴中，维持该温度10min，使之成巧克力色。取出置室温冷至约50℃，倾注平板或制成斜面备用。 [质量控制]
流感嗜血杆菌ATCC 10211、肺炎
链球菌ATCC 6305生长良好，菌落典型。 [保存] 置4℃冰箱，1周内用完。 4.胱氨酸胰化酪蛋白琼脂 [用途] 常用于测定脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及营养要求较高细菌的糖发酵试验。 [配法] 胱氨酸0.5g, 胰化酪蛋白20g,氯化钠5g，亚硫酸钠0.3g，琼脂3.5g，酚红0.0175g，蒸馏水1L。 将上述成分（酚红除外）混合溶解，调pH至7.2，加入酚红指示剂。分装试管，115℃灭菌15min。 [用法] 用于测定糖发酵时，按需要加入各种糖溶液，将待检标本直接种于培养基管内，置35℃孵箱，18~24h观察结果。培养基由红色变为黄色为阳性，不变色为阴性。
第三节 保存和增菌培养基
一、菌种保存培养基
[配法]
蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠3g，磷酸氢二钠2g，琼脂粉4.5g，蒸馏水1L 。
将上述成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.4~7.6，分装试管2/3左右高度，121℃高压灭菌15min，成为半固体培养基，备用。 [质量控制]
培养基呈淡黄色半固体状。大肠埃希菌(ATCC 25922)生长良好,动力阳性；福氏志贺菌(ATCC 12022)生长良好,动力阴性；金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)生长良好,动力阴性。
二、增菌培养基 1.葡萄糖肉汤 [用途] 用于血液增菌。 [配法] 蛋白胨(或月示 胨)10g，氯化钠5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖3g，枸橼酸钠3g，5g/L对氨基苯甲酸水溶液10ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml，青霉素酶1000 U。 将蛋白胨、氯化钠混合于肉浸液中加热溶解，再加入葡萄糖、枸橼酸钠、对氨苯甲酸及硫酸镁，继续煮沸5min，并补足失水，调整pH至7.8。 过滤分装，每瓶50ml，高压灭菌115℃20min后，每瓶加入青霉素酶50 U，经无菌试验合格后，冷却备用。 [用法] 将采取的血液标本，以无菌手续注入培养瓶中（血液1ml，培养液10ml），置35℃培养箱内，每天1次取出观察结果。如有细菌生长，可出现数种不同的表现，应随时作分离培养，可选用血琼脂、伊红美蓝琼脂及巧克力琼脂平板等。无细菌生长表现的培养瓶，需连续观察7d，仍无细菌生长方可弃去。在观察的过程中，至少应作两次分离培养。
注:
⑴ 枸橼酸钠为抗凝剂，可使血液加入培养基中不凝固。
⑵ 对氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺类药物的抑菌作用。
⑶ 硫酸镁主要抑制血液中存在的四环素、金霉素、新霉素、多粘菌素及链霉素的抑菌作用。
⑷ 本培养基近年来有许多改良配方，如加入0.3%～0.5%酵母浸膏以增加营养；加0.2%核酸刺激细菌生长；加0.1%粘液素能被覆于细菌的表面，保护细菌免受抗体破坏；加入聚茴香脑磺酸钠（SPS）能中和补体的抗药作用从而提高检出率。
2.血液增菌培养基 [用途]
血液和骨髓液病原菌的增菌培养。
[配法] 蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏粉3g，枸橼酸钠3g，磷酸氢二钾2g，5g/L对氨基苯甲酸溶液5ml，1mol/L硫酸镁溶液20ml， 4g/L酚红溶液6ml，青霉素酶50 U，聚茴香脑磺酸钠(SPS) 0.3g，蒸馏水1L。 将上述成分（除酚红指示剂、青霉素酶外）混合加热溶解，校正pH至7.4，再加酚红，过滤分装每瓶30～50ml，经121℃灭菌15min和35℃24h无菌试验备用。临用时每瓶加入1.5～2.5 U青霉素酶。 [质量控制] 伤寒沙门菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化脓性链球菌ATCC 19615、肺炎链球菌ATCC 6305、金黄色葡萄菌ATCC 25923、铜绿假单胞菌ATCC 27853均生长良好。 3.亚硒酸盐增菌培养基 [用途] 沙门菌增菌培养。 [配法] 蛋白胨5g，乳糖4g，磷酸氢二钠
4.5g，磷酸二氢钠5.5g，亚硒酸氢钠4g，蒸馏水1L。
先将亚硒酸盐加到200ml蒸馏水中，充分摇匀溶解。其它成分称量混合，加入蒸馏水800ml，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正pH 7.0~7.1(通过调整磷酸盐缓冲对的比例来校正pH值)。最后分装于15×150mm的试管内，每管10ml。置水浴隔水煮沸10~15min，立即冷却，置4℃冰箱保存备用。
[用法]
取新鲜标本1g或棉拭子采样直接种于该培养管内。摇动后置35℃培养过夜。如发现均匀混浊，管底有红色沉淀物，表示细菌生长。然后取培养物分离在选择性培养基上，如SS琼脂、麦康凯琼脂平板等，进行培养。
[质量控制]
培养基应呈淡黄色或无色，透明无沉淀物。增菌灵敏度：伤寒沙门菌1×10-5，鼠伤寒及副伤寒沙门菌1×10-7
。
[保存]
4℃保存，1周内用完。 注：
⑴ 亚硒酸盐，包括亚硒酸钠、亚硒酸氢钠均可使用，但以亚硒酸氢钠效果为好。 ⑵ 磷酸盐缓冲对中，两者的用量比例与亚硒酸盐及蛋白胨的品种有关。制备前应进行调试，其总量为10g/L。
⑶ 在制备过程中，亚硒酸盐不能直接加热。隔水煮沸时间亦不能超过规定时间，否则亚硒酸盐会变质，生成红色沉淀物。
⑷ 培养基应呈淡黄色，有红色沉淀物出现时不可再用。
4.SS增菌液 [用途]
用于沙门、志贺菌的增菌。 [配法]
月示 胨 2g，蛋白胨8g，牛肉膏3.5g，酵母膏2g，葡萄糖2g，枸橼酸铁10g，硫代硫酸钠10g，亚硫酸钠0.7g，胆盐5.5g，磷酸氢二钠4g，磷酸二氢钾0.1g，去氧胆酸钠(进口)
1.5g，煌绿0.005g，蒸馏水1L。
将上述成分加热溶于水中，调pH至7.1，分装试管（15×150mm），每管5~7ml，隔水煮沸5min备用。
[用法]
取粪便标本1g直接种于增菌液内，35℃16~18h培养，取出转种于分离培养基即可。 [质量控制]
培养基应呈淡黄色或略呈淡绿色。伤寒沙门菌ATCC 50096、福氏志贺菌ATCC 12022 生长良好；大肠埃希菌ATCC 25922 生长抑制。
注：
⑴ 切勿高压，隔水煮沸时间不超过5min。
⑵ 煌绿用量应根据不同产品批号酌情增减。
5.碱性蛋白胨水
[用途]
霍乱弧菌增菌培养。 [配法]
蛋白胨 20g，氯化钠5g，蒸馏水100ml。
将上述成分溶解于水中,校正pH 至8.6，分装于试管8~10ml，经121℃灭菌15min备用。
[用法]
将待检标本接种到碱性胨水中，置35℃培养6~8h，霍乱弧菌呈均匀混浊生长，表面有菌膜出现。取表面菌液一白金环移种到碱性琼脂、庆大琼脂或TCBS琼脂平板上。必要时做第二次增菌。
[质量控制]
有条件的实验室可用标准菌株，一般临床实验室可用非01群弧菌，培养后生长良好者方可使用。霍乱弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌生长良好（6h）；大肠埃希菌ATCC 25922不生长（6h）。
[保存]
置4℃冰箱，2周内用完。
注：若在每升碱性胨水中加入1%亚碲酸钾溶液0.5~1.0 ml，则成为亚碲酸钾碱
性胨水，其增菌效果更为理想。
第四节 分离培养基
一、革兰阳性杆菌分离培养
基
1.罗-琴改良培养基
[用途]
用于结核分枝杆菌培养。 [配法]
磷酸二氢钾2.4g，硫酸镁0.24g，枸橼酸镁(或枸橼酸钠) 0.6g，天门冬素3.6g，甘油12ml，蒸馏水600ml，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1L，2%孔雀绿水溶液20ml。
先将磷酸盐、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素及甘油，加热溶解于600ml蒸馏水中。再添放马铃薯粉，边放边搅，并继续置沸水中加热30min，待冷却至60℃左右时，加入鸡卵液1L及孔雀绿溶液20ml，充分混匀后，用无菌操作分装于灭菌试管，每支5~6ml，塞紧橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器内制成斜面，经85℃1h间歇灭菌2次(或高压灭菌115℃20min)，待凝固后经无菌试验，4℃冷藏备用。
[用法]
取晨咳痰或其它体液标本，经消化处理和离心沉淀的浓缩液0.1ml（约2滴）滴种于培养基的斜面上，尽量摇晃，置35℃5%~10%二氧化碳温箱内培养1~4周，观察结果。凡在1周内发现生长的菌落，一般不可能是结核分枝杆菌；在2周后生长的菌落，奶油状，略呈黄色，粗糙突起，不透明，即取菌进行涂片染色镜检及鉴定。 [质量控制]
用结核分枝杆菌菌株作阳性培养试验。
[保存]
置4℃冰箱内2~4周有效。 注：
⑴ 本培养基由Lowenstein-Jenden设计的基础上改良。
（2）本培养基pH约为6.0左右，一般无须校正。
（3）间歇灭菌的温度不宜超过90℃。
2.血清斜面培养基(吕氏血清
斜面)
[用途]
用于白喉棒状杆菌培养。 [配法]
1%葡萄糖肉汤(pH 7.6)100ml，无菌动物血清(牛、羊、猪、兔) 300ml。
将上述成分混合后，分装于试管内，每管约4~5ml。斜插在血清凝固器内（或蒸笼）加热80~85℃30min，使血清凝固成斜面，冷却后放4℃冰箱内。取出后采用间歇灭菌法，85℃灭菌30min，连续3天，经无菌试验证明无杂菌生长即可应用。
[用法]
将喉拭子直接接种于上述斜面上，置35℃培养16~24h。白喉杆菌在上述培养基上，菌落呈圆形，表面光滑、完整，9g/L氯化钠溶液中易乳化，用阿尔培脱染色，两极异染颗粒明显。
注：
⑴ 所用血清不能含有防腐剂。
⑵ 该培养基不能高热灭菌，以防破坏其中营养成分。
⑶ 配制时所有器皿、棉塞等均应高压灭菌。
3.亚碲酸钾血琼脂
[用途]
用于分离白喉杆菌。 [配法]
蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉浸膏3g，葡萄糖2g，胱氨酸0.05g，1%亚碲酸钾45ml，脱纤维羊血100ml，琼脂2g，蒸馏水900ml。
先将蛋白胨、氯化钠、牛肉浸膏、葡萄糖和胱氨酸加水加热溶解，调pH至7.6，加入琼脂，高压灭菌
115℃15min备用。待冷至50℃左右，用无菌操作加入已灭菌的亚碲酸钾溶液及羊血，混匀倾注平板。
[用法]
将标本直接接种于亚碲酸钾平板上。置35℃孵箱，经24~48h培养，观察结果。白喉杆菌能使亚碲酸钾还原成金属碲而形成黑色和灰黑色的菌落。
二、革兰阴性杆菌分离培养
基
(一)弧菌分离培养基 1.碱性琼脂
[用途]
用于霍乱弧菌分离培养。 [配法]
蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉膏3g，脂20g，蒸馏水1L。
将前4种成分混合于水中，加热溶解，校正pH至 8.4，分装后121℃灭菌15min，倾注平板。
[用法]
凡急性患有水样便标本做增菌培养的同时，应直接取标本接种到碱性琼脂平板或亚碲酸钾琼脂平板上。置35℃培养12~16h，观察结果。霍乱弧菌生长较快，菌落大而扁平，呈青灰色，半透明，光滑湿润。在亚碲酸钾琼脂上菌落呈灰黑色。
[质量控制]
各实验室凡自配培养基或商品培养基,在使用前可用标准菌株生长对照，临床实验室可送防疫部门所设立的专门检验机构进行目的菌监测,质量可靠者方可使用。
EL-Tor弧菌生长良好；大肠埃希菌ATCC 25922 生长抑制。
[保存]
置4℃冰箱，1周内用完。 2.碱性胆盐琼脂 [用途]
用于霍乱弧菌分离培养。 [配法]
蛋白胨10g，牛肉膏 5g， 氯化纳5g~10g，琼脂 20g，胆盐（牛、猪）2.5g，蒸馏水1L。
将上述成分称量混合于水中加热溶解，校正pH至8.4，分装121℃灭菌15min，倾注平板。
[用法]
取粪便标本或增菌培养物1接种环接种平板，置35℃温箱培养16~18h。霍乱弧菌迅速生长，其它细菌生长较缓慢。在16~18h后，霍乱弧菌的菌落，直径可达2mm左右，呈扁平，青灰色，半透明，光滑湿润，易挑起。其它细菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。
[质量控制] 同碱性琼脂。 [保存]
置冰箱，1周内用完。 3.庆大霉素琼脂
[用途]
用于霍乱弧菌分离培养。 [配法]
蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠5g，枸橼酸钠10g，无水亚硫酸钠3g，蔗糖(或白糖)10g，琼脂15~20g，庆大霉素、多粘菌素B“双抗液”2ml，蒸馏水1L。
将上述成分(除“双抗液”外)称量混合于水中，加热溶解，校正pH至8.4，分装灭菌121℃15min，待冷却至50℃后，每100ml内加“双抗液”0.2ml，另加5g/L亚碲酸钾溶液0.1ml，再倾注平板。最后每毫升培养基内含有庆大霉素0.5 U，多粘菌素B6 U。
[用法]
将粪便标本或增菌培养物划线接种到该平板上，置35℃培养16~18h。 由于该培养基抑制性强，其它非弧菌科细菌被抑制，而霍乱弧菌生长迅速，16h菌落可达2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑湿润。若培养时间长，菌落略黄色、隆起，中心
厚而不透明。
[质量控制]
霍乱弧菌(小川、稻叶)生长良好，培养18~24h菌落直径2.5~3.0mm；大肠埃希菌和变形杆菌生长抑制。
[保存]
置4℃冰箱内，1周内用完。 注：
⑴ 该培养基国内有商品出售，多数产品已加入庆大霉素，使用时，应详阅说明书。
⑵“双抗液”配制：98ml灭菌蒸馏水中加庆大霉素(25 000 U/ml)1ml,多粘菌B或抗敌E(300 000 U/ml)1ml。4℃冰箱保存，1月用完。
4.四号琼脂
[用途]
用于霍乱弧菌分离培养。 [配法]
蛋白胨10g，氯化钠5g，牛肉浸膏3g，亚硫酸钠(无水)3g，枸橼酸钠10g，猪胆汁粉5g，十二烷硫酸钠20g，利凡诺（雷佛奴尔）3g，琼脂粉12g，庆大霉素亚碲酸钾混合液 1ml，蒸馏水1L。
将前8种成分放入玻璃或搪瓷容器内(严禁用铝制容器等金属容器)，加入蒸馏水，加热溶解混合后，调整至pH8.0,然后按1.2%加入琼脂，煮沸至琼脂溶化后，冷至60℃左右，按每100ml琼脂加入庆大霉素亚碲酸钾混合液(1ml 40 000 U庆大霉素加79ml蒸馏水混合后，加入0.8g亚碲酸钾溶解混合即成，每毫升含500 U庆大霉素和10g/L亚碲酸钾)0.1ml，摇匀，倾注平板。
[用法]
取待检标本划线接种平板，置35℃培养过夜。
8h后即可初步观察结果。24h培养后，霍乱弧菌呈中心黑色、较大而扁平的菌落。
[质量控制]
配成的培养基呈亮黄色透明；EL-Tor弧菌稻叶型生长良好；EL-Tor弧
菌小川型生长良好；大肠埃希菌ATCC25922抑制生长。
注：
⑴ 庆大和亚碲酸钾混合液应新鲜配制并置冰箱保存。
⑵ 雷佛奴尔应避光保存，而且每批均应预试后方可使用。成品培养基应避光保存。
(二)肠杆菌分离培养基 1.中国蓝琼脂
[用途]
分离肠道菌的弱选择性培养基。 [配法]
肉膏汤琼脂(pH7.4)1L，10g/L中国蓝溶液(灭菌)10ml，乳糖10g，10g/L蔷薇红酸乙醇溶液10ml。取乳糖10g置于已灭菌的肉膏汤琼脂瓶内，加热溶解琼脂并混匀。待冷却至50℃左右，加入中国蓝、蔷薇红酸乙醇溶液混匀，立即倾注平板，凝固后备用。
[用法]
将标本接种平板，置35℃18～24h。分解乳糖产酸的细菌，其菌落呈蓝色；不分解乳糖的细菌，菌落为淡红色的透明菌落。 [质量控制]
大肠埃希菌ATCC 25922菌落呈蓝色；痢疾志贺菌Ⅰ型ATCC 13313和鼠伤寒沙门菌ATCC 13311菌落呈淡红色。
[保存]
4℃冰箱保存，1周内用完。 注：
(1)中国蓝溶液需煮沸或115℃灭菌15min后应用。蔷薇红酸乙醇溶液无需灭菌，但加热时应避开火焰。
(2)蔷薇红酸能抑制革兰阳性细菌生长，但对大肠埃希菌没有抑制作用，标本接种量不宜太多。
(3)此培养基pH 7.4，应呈淡红色。若过碱呈鲜红色，过酸则呈蓝色，均不适用。
2.木糖、赖氨酸、去氧胆酸
盐(XLD)培养基
[用途]
为肠道菌选择性培养基。 [配法]
酵母浸膏3g,L-赖氨酸5g,氯化钠5g,D-木糖3.75g,乳糖7.5g,蔗糖7.5g,去氧胆酸钠2.5g,硫代硫酸钠6.8g,枸橼酸铁铵0.8g,琼脂13.5g,1%酚红溶液8ml,蒸馏水1L。
将上述成分(酚红除外)混合，加热溶解，校正pH至7.2,再加入酚红溶液混匀。121℃高压灭菌15min，倾注平板备用。
[用法]
将标本划线接种平板，置35℃培养18～24h。大肠埃希菌、肠杆菌属、克雷伯菌属、枸橼酸杆菌属细菌可形成黄色、不透明菌落；大多数沙门菌属细菌因不利用糖类，为半透明红色或无色菌落。
[质量控制]
大肠埃希菌呈黄色菌落；宋内志贺菌呈无色菌落；伤寒沙门菌 呈红色菌落有黑心；金黄色葡萄球菌 抑制生长。
[保存]
贮存于4℃有效期5天。 3.SS琼脂
[用途]
沙门菌属和志贺菌属(Salmonella-Shigella)的分离培养。 [配法] 月示胨 5g，牛肉膏5g，乳糖10g，琼脂15~20g，胆盐(No.3)3.5g，枸橼酸钠8.5g，硫代硫酸钠8.5g，枸橼酸铁1g，1% 中性红溶液2.5ml，0.1% 煌绿溶液0.33ml，蒸馏水1L。
将上述成分(除中性红、煌绿外)混合于水中，加热煮沸溶解，校正pH至7.0~7.1，然后加入中性红和煌绿溶液，充分混匀冷却至50℃时倾注平板。
[用法]
将标本接种平板，置35℃培养18~24h。沙门菌属菌落呈无色半透明，产生硫化氢者菌落中心呈黑色；
志贺菌属的菌落呈无色半透明；大肠菌属呈红色浑浊；宋内志贺菌能延缓发酵乳糖，培养24h后可以出现红色菌落。肠道致病菌的菌落直径均可达1.5mm以上。 [质量控制]
大肠埃希菌菌落呈红色；痢疾志贺Ⅰ型、福氏志贺菌和伤寒沙门菌 生长良好，菌落无色；肠炎或猪霍乱沙门菌菌落呈黑色；粪肠球菌、金黄色葡萄球菌不生长。
[保存]
避光，3天内用完。 注：
煌绿要新配，中性红要优质。
4.麦康凯琼脂
[用途]
麦康凯琼脂(Maconkey agar)用于肠道致病菌的分离培养和非发酵细菌鉴别。
[配法]
蛋白胨20g，氯化钠5g，胆盐(猪、牛、羊)5g，乳糖10g，琼脂15~20g，1%中性红溶液5ml，蒸馏水1L。
将上述成分(除中性红外)称量加入水中，加热溶解，校正pH至7.2，加入中性红溶液，分装灭菌115℃20min，冷却至50℃左右时倾注平板。
[用法]
取标本或增菌培养物接种平板，置35℃培养18~24h。不发酵乳糖的肠道细菌呈无色菌落，直径约2.0mm左右，光滑半透明。
[质量控制]
大肠埃希菌菌落呈桃红色；痢疾志贺菌菌落呈无色；伤寒沙门菌菌落 无色；金黄色葡萄球菌不生长。
[保存]
置4℃冰箱(避光)，1周内用完。 注：非发酵细菌在该平板上是否生
长，是临床鉴定某些非发酵细菌的指标之一。
5.伊红美蓝琼脂
[用途]
用于肠道致病菌及大肠菌群分离培养。
[配法]
蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氢二钾2g，20g/L伊红Y溶液20ml，6.5g/L美蓝溶液10ml，琼脂17g，蒸馏水1L。
将蛋白胨、磷酸盐、琼脂称量混合于水中，并加热煮沸溶解，校正pH至 7.1，分装121℃灭菌15min备用。临用时加热溶化琼脂加入乳糖，冷至50~55℃时加入伊红和美蓝溶液，摇匀倾注平板。
[用法]
取粪便标本或增菌培养物接种平板，置35℃培养18~24h。根据检验目的不同，挑取无色菌落或挑选紫红色及有金属光泽的菌落转种克氏双糖或三糖铁琼脂进行鉴定。
[质量控制]
大肠埃希菌菌落呈紫红色，有时有金属光泽，直径＞2.3mm；伤寒沙门菌菌落呈灰白色，直径＞1.8mm；金黄色葡萄球菌不生长。
[保存]
置4℃冰箱，1周内用完。 6.克氏双糖铁琼脂
[用途]
克氏双糖铁琼脂(Kliger iron agar)用于肠杆菌科细菌的初步鉴定。 [配法]
蛋白胨20g,牛肉膏3g,酵母膏3g,乳糖10g,葡萄糖1g,氯化钠50g,枸橼酸铁铵0.5g,硫代硫酸钠0.5g,0.2%酚红溶液5ml,琼脂12ml,蒸馏水1L。
将前8种成分称量混合于水中，加热溶解，校正pH至7.5，再加入琼脂和酚红溶液，煮沸溶解分装试管，每管4ml，经115℃灭菌20min，立即制成高层斜面，待凝固后经无菌试验备用。
[用法]
取待检菌纯培养物，用接种针作
底层穿刺和斜面划线接种，置35℃培养18～24h，观察结果。斜面变黄，底层变黄，产气者或不产气者多属大肠埃希菌群及发酵乳糖的菌株。斜面变红，底层变黄，为不发酵乳糖菌株。产硫化氢菌株可使底层或全管产生黑色反应。
[质量控制]
奇异变形杆菌 K/A 硫化氢阳性；大肠埃希菌 A/A；志贺痢疾杆菌 K/A；伤寒沙门菌 K/A 硫化氢阳性；铜绿假单胞菌 K/K。
[保存]
置4℃冰箱，2周内用完。
注:该培养基pH值尤为重要，pH7.5时使用效果最佳。
7.三糖铁琼脂
[用途]
用于肠杆菌科细菌初步生化鉴定。
[配法]
蛋白胨15g，月示胨5g，牛肉膏3g，酵母膏3g，乳糖10g，蔗糖10g，葡萄糖1g，氯化钠5g硫酸亚铁2g/L，硫代硫酸钠0.3g，0.2%酚红溶液5ml，琼脂12g，蒸馏水1L。
将前10种成分称量混合于水中，加热溶解后校正pH至7.4，再加琼脂及酚红溶液，加热煮沸溶解。分装试管，每管4ml，经115℃灭菌20min，立即置高层斜面，待凝固后，经无菌试验备用。
[用法]
取待检菌纯培养物，用接种针作底层穿刺和斜面划线接种，置35℃培养18~24h观察结果。发酵乳糖或蔗糖的菌可使斜面及底层均变黄色。不发酵乳糖和蔗糖的细菌仅发酵葡萄糖时使底层变黄，斜面变红。产生硫化氢的菌株可使底层或整个培养基呈黑色。分解乳糖或蔗糖后产气时有些菌株还能使培养基断裂。
[质量控制]
伤寒沙门菌K/A， 硫化氢阳性；
副伤寒沙门菌K/A， 硫化氢阳性；痢疾志贺菌K/A；大肠埃希菌A/A；普通变形杆菌A/A， 硫化氢阳性；铜绿假单胞菌 至7.2，分装试管，118~121℃灭菌15min，制成斜面和高层备用。
[用法]
K/K。
[保存] 置4℃冰箱，2周内用完。
注：该培养基pH 7.5时使用效果最佳。
8.山梨醇麦康凯琼脂
[用途] 用于致病性、侵袭性和产毒性大肠埃希菌分离培养。 [配法]
蛋白胨5g，月示胨3g，氯化钠5g，胆盐（猪、牛、羊）5g，山梨醇10g，琼脂粉12g，0.1g/L结晶紫溶液1ml，5g/L中性红溶液5ml，蒸馏水1L
将前4种成分混合于水中，加热溶解，校正pH至7.2，再加入琼脂粉加热煮沸溶解。分装三角烧瓶100ml。经121℃15min灭菌备用。临用时，加热溶解，再加山梨醇、结晶紫及中性红溶液，摇匀倾注平板。
[用法]
将标本或增菌液接种平板，置35℃培养18～24h。与麦康凯琼脂不同之处是挑取致病性大肠埃希菌菌落时，以无色菌落为主，同时兼取红色菌落，如EPEC迟缓分解山梨醇，菌落呈红色。EHEC O157﹕H7菌落无色。
[质量控制] 参照麦康凯琼脂。 [保存]
置4℃冰箱，1周内用完。
(三)非发酵细菌用培养基
1.金氏培养基(甲)
[用途]
金氏培养基(Kings Medium)用于检测假单胞菌产生的青脓素。 [配法]
蛋白胨20g，无水氯化镁1.4g，无水硫酸钾10g，琼脂15g，甘油10ml，蒸馏水1L。
将上述成分加热、溶解，调pH
取待检菌划种于上述斜面上，35℃培养过夜。观察斜面上产色素情况。
2.氧化-发酵试验培养基
[用途]
用于检测细菌代谢类型。 [配法]
（1）Hugh-Leifson培养基(革兰阴性杆菌用)：蛋白胨2g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾 0.3g，氯化钠5g，溴麝香草酚蓝（BTB）0.03g，琼脂 2.5g，蒸馏水1L。
（2）葡萄球菌O/F(葡萄球菌和微球菌鉴别用)：胰蛋白胨10g，酵母浸膏10g，琼脂20g，溴甲酚紫0.001g，蒸馏水1L，葡萄糖10g。
将上述成分混合加热溶解，调pH至7.1，分装于试管中，每支试管5ml，高压灭菌121℃15min，使成琼脂高层，备用。
[用法]
从斜面上挑取少许培养物，同时穿刺接种两支培养基，其中一支接种后，滴加液体石蜡于培养基表面，高度约1cm。置35℃孵箱培养24~48h。培养基变黄表示细菌分解葡萄糖而产酸，颜色不变为不分解葡萄糖。 [质量控制]
金黄色葡萄球菌ATCC2 5923、大肠埃希菌ATCC 25922发酵型；铜绿假单胞菌ATCC 27853氧化型；易变微球菌、粪产碱杆菌不利用。
注：
(1)有些细菌不能在上述培养基上生长，需在该培养基中加入2%血清或10g/L酵母浸膏，重做试验。
(2)指示剂不能用乙醇配制，因有些细菌可使乙醇产酸，导致发酵或氧化反应影响结果判断。
（四）其它革兰阴性杆菌用培养基
1.军团菌培养基
缓冲活性炭酵母琼脂培养基
（BCYE）
[用途]
用于嗜肺军团菌的分离培养。
[配法]
酵母浸液10g，活性（NoritSG）
2g，L-半胱氨酸盐酸盐0.4g，可溶性
焦磷酸铁盐0.25g，琼脂17g，N-2-乙
酰氨基-乙氨基乙醇磺酸（ACES）10g,
蒸馏水80ml。 上述成分除半胱氨酸及焦磷酸铁
外，其余成分混合加热溶解，经121℃
15min 灭菌，放水浴中冷却到50℃。
另外分别配新鲜L-半胱氨酸溶液
（10ml蒸馏水中含0.4g）及焦磷酸铁
溶液（10ml含0.25g），分别过滤除
菌，再加入已灭菌琼脂中， 加入
1mol/L 氢氧化钾溶液4～5ml使培养基的最终pH为6.9～7.0，可用1mol/L 盐酸溶液校正，倾注平板，冷却后置4℃冰箱备用，亦可制成斜面，
用于保存菌种。该培养基为黑色。
[用法]
液体标本可直接接种培养基，肺、肝、脾等固体标本须制成100g/L悬液后再接种培养基，接种后的培养
基置35℃需氧环境培养，培养箱需保
持一定的湿度。每天用解剖镜检查平
板培养物，用略大于100角的斜射光源
照明。在BCYE平板上，培养4～5
天，菌落直径约1～2mm，并出现亮蓝
和切削玻璃样的构造；继续培养后菌
落增大呈黄绿色，较光滑。
[保存]
在室温、暗室中可保存1周
2.弯曲菌选择性培养基 （1）Skirrow’s培养基 [用途] 用于空弯及幽门螺杆菌分离培养。 [配法] 蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂粉12g，万古霉素10ml，多粘菌素B 2500U，TMP 5mg，脱纤维羊血70ml，蒸馏水930ml。 除血和抗生素外，其余成分混合于水中，加热溶解，调pH至7.2，121℃灭菌15min。待冷至50℃时加入羊血7ml和多抗液0.5ml，摇匀，倾注无菌平板。 [用法] 将标本接种平板，置25℃或43℃微需氧环境中培养
48h，菌落直径达1~2mm，为不溶血的菌落。 [质量控制] 大肠埃希菌ATCC 25922和粪肠球菌ATCC 33186不生长；空肠弯曲菌胎儿亚种ATCC 29424生长良好。 注： 1）多抗液的配制：①乳酸62mg(约2
滴)加入100ml灭菌水中，然后加入TMP100
mg，混合加热100℃灭菌。②取①液5ml，再加万古霉素100mg和多粘菌素B 0.38mg，摇匀后即可。 2）弯曲菌属系微需氧菌，培养时可提供5%氧气及10% 二氧化碳。高浓度氧不利于细菌生长，尤其是幽门螺杆菌。因此标本采集后，应尽快接种培养，或置运送培养基
中运送。
3）弯曲菌运送可用布氏菌汤培养基。 ⑵ Campy-BAP培养基
[用途]
用于分离培养弯曲菌。
[配法]
蛋白胨10g，胰胨10g，葡萄糖
10g，酵母浸膏3g，氯化钠5g，重亚
硫酸钠0.1g，蒸馏水900ml，脱纤维羊
血100ml，万古霉素10mg，多粘菌素
B 2 500 U，TMP 5mg，两性霉素B
2mg。
将上述成分（除羊血和抗菌补充剂外），加入900ml蒸馏水，加热溶解，调pH至7.2后分装，121℃灭菌15min，加入羊血和抗菌药物添加剂，充分混匀后倾注于无菌平皿内。
[用法] 取标本接种于平板，置25℃或43℃微需氧环境中培养48h，菌落直径
达1~2 mm，不溶血。
[质量控制]
大肠埃希菌ATCC 25922不生长；粪肠球菌ATCC 33186不生长；空肠弯曲菌胎儿亚种ATCC 29424生长良好。
第五节 生化试验培养基
一、糖发酵试验培养基 1.糖醇发酵试验培养基
[用途]
检查细菌对不同糖(醇)类的发酵能力，达到鉴定细菌的目的。 [配法]
蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠 5g，安德烈(Andrade)指示剂10ml，蒸馏水1L，各种糖(醇)类 5~10g。
将上述成分混合后，加热溶解。矫正pH至7.2。根据需要，分别再加相应的糖和醇。分装于13mm×100mm的试管，每管约3ml，115℃灭菌15min。如需观察产气，可在试管内加小倒管1只。
将分离的纯菌接种到糖（醇）发酵管中，置35℃培养18～24h。接种菌若能分解培养基中的糖（醇）类而生成酸，使指示剂呈酸性反应，若产生气体，则可使液体培养基中的倒管(Durham管)内出现气泡；若接种菌不分解糖（醇）则无反应。
2.血清菊糖试验培养基
[用途]
用于肺炎链球菌与其它链球菌鉴别。
[配法]
血清(兔血清或牛血清)25ml，1g/L酚红溶液2ml，菊糖1g，蒸馏水75ml。
先取血清25ml、蒸馏水75ml混合，置阿诺灭菌器内加热15min，以破坏血清内的淀粉酶。调pH至7.4，然后加入菊糖1.0g、1g/L酚红溶液2ml摇匀。分装于13mm×100mm的试管，每管2ml。用间歇灭菌法灭菌，每天1次，连续3天，每次20min。
[用法]
将被检菌接种培养基，置35℃培
养18~24h。分解菊糖的菌株使培养基变黄；不分解菊糖的菌株，培养基不变色。
[质量控制]
肺炎链球菌ATCC 10015阳性；化脓性链球菌ATCC 19615阴性。 3.胆汁七叶苷试验培养基
[配法]
蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，牛胆汁40g，七叶苷1g，枸橼酸铁0.5g，琼脂15g，蒸馏水1L。
将上述成分混合加热溶解，调pH至7.2，分装试管，115℃灭菌15min。
将待测菌种接种到七叶苷培养基的斜面上，置35℃孵育18～24h，观察结果。培养基变为黑色或棕色者为阳性；不变色者为阴性。 [质量控制]
粪肠球菌 ATCC 29212 阳性；化脓性链球菌ATCC 19615 阴性。
[保存]
置4℃冰箱，2周内用完。
二、酶类测定培养基和试剂 1.氨基酸脱羧酶试验培养基
[用途] 检查细菌使氨基酸脱羧基形成胺使培养基变碱的能力。常用的氨基酸有赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸。
[配法]
蛋白胨5g,牛肉浸膏5g,溴甲酚紫0.1g,甲酚红0.005g,吡多醛(VB6)0.005g,葡萄糖0.5g,蒸馏水1L。
加热慢慢溶解，按10g/L浓度加入所需要的氨基酸，调pH至6.0，呈深亮紫色。分装每支2ml，同时配对照管(不加氨基酸)，高压灭菌121℃15min,冷却后4℃冷藏备用。
[用法]
将试验菌接种培养基，同时接种对照管1支。并用灭菌的液体石蜡覆盖，置35℃培养18~24h。阳性菌初期由于细菌发酵葡萄糖产酸呈黄色，若继续孵育，氨基酸经脱羧产生胺类使培养基变碱，指示剂改变颜色，呈紫色或紫红色。阴性呈黄色或不变色。 [质量控制] 赖氨酸脱羧酶:迟缓爱德华菌阳性，弗劳地枸橼酸菌阴性；鸟氨酸脱羧酶:产气肠杆菌阳性，弗劳地枸橼酸菌阴性;精氨酸脱羧酶:鼠伤寒沙门菌阳性，普通变形杆菌阴性。 2.耐热DNA酶培养基
[用途]
用于检测细菌所产生的耐热脱氧
核糖核酸酶。
[配法]
胰蛋白胨1.5g,植物蛋白胨0.5g,氯化钠0.5g,DNA 2g/L,琼脂1.5g,蒸馏水100ml,2g/L甲苯胺蓝溶液 0.25ml。 将前6种成分徐徐加热溶解后，调pH至7.4，加入甲苯胺蓝溶液，分装试管， 121℃灭菌15min后备用。 [用法] 上述琼脂倾注于载玻片上，凝固后，打孔，孔径2cm，孔内加入经100℃15min隔水加热处理后的肉汤培养物。将载玻片孵育于35℃湿盒内4h,取出观察结果。阳性反应在孔周围出现不小于4mm直径粉红色圈，阴性反应培养基的颜色无改变。 [质量控制] 金黄色葡萄球ATCC 25923 阳性；表皮葡萄球菌ATCC 12990 阴性。 3.DNA酶试验培养基 [用途] 供细菌DNA酶测定用。 [配法] DNA 2g，胰酪胨15g，大豆胨5g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L。 将5种成分混合于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.2~7.4，分装三角烧瓶，经115℃灭菌15min，倾注灭菌平皿，4℃冷藏备用。 [用法] 将待检菌作点状穿种在平板上，置35℃培养24h。待细菌生长成集落菌苔后，在其菌苔上及周围滴加0.1mol/L盐酸溶液数毫升，待片刻
后，如待检菌DNA酶阳性，可在菌苔的周围出现明显的透明圈；而阴性者则无透明圈出现。 [质量控制] 金黄色葡萄球菌ATCC 25923和粘
质沙雷菌 ATCC 274阳性;表皮葡萄球菌ATCC 14990和大肠埃希菌ATCC 25922阴性。 [保存] 置4℃冰箱1周内用完。 4.氧化酶试验 [用途] 区别假单胞菌与氧化酶阴性的肠杆菌科细菌。 [配法]
盐酸二甲基对苯二胺（或四甲基对苯二胺）0.1g加蒸馏水10ml。 [用法]
取白色洁净滤纸一角，沾取试验菌落少许，加试剂一滴。阳性者立即显粉红色，并于5～10s内呈现深紫色反应。若用四甲基对苯二胺则阳性为蓝色。 [质量控制] 铜绿假单胞菌ATCC 27853阳性；大肠埃希菌ATCC25922阴性。 [保存] 置棕色瓶内可用一周，4℃冰箱保存，或分装于棕色瓶内密封。 5.尿素酶试验培养基
[用途] 用于细菌尿素酶测定。 [配法] 蛋白胨1g,葡萄糖1g,氯化钠5g,磷酸二氢钾2g,4g/L酚红溶液3ml,琼脂18~20g,200/L尿素溶液100ml,蒸馏
水1L。
将前5种成分混合于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.0，然后加入酚红溶液，分装每瓶100ml，经121℃灭菌15min备用。临用时，加热溶解，冷却至55℃左右，加入无菌的尿素溶液10ml，摇匀立即无菌分装于灭菌试管，每支2ml，并置成斜面。经无菌试验后备用。
[用法]
取培养物接种斜面，35℃孵育24h。尿素酶阳性者斜面变红色,阴性者颜色无变化。 [质量控制]
普通变形杆菌ATCC 13315(8h)整个培养基变红、肺炎克雷伯菌ATCC 27236仅斜面变红(24h)；大肠埃希菌ATCC 25922为阴性(24h)。
[保存]
置4℃冰箱，2周内用完。 6.磷酸酶试验培养基 [用途]
测定细菌产生磷酸酶的能力。用于区别葡萄球菌有无致病性，致病性葡萄球菌呈阳性。还有助于克雷伯菌属与肠杆菌属的鉴定。 [配法]
含磷酸酚酞的营养琼脂培养基。 将上述琼脂加热溶化，待冷却至45℃时，加入滤过除菌的10g/L磷酸酚酞溶液1ml，摇匀后倾注平板。
[用法]
接种待测菌株，35℃培养18~24h。在平皿盖上滴加浓氨水1滴，熏蒸片刻。如有酚酞释出，菌落即变为粉红色为阳性；不变色为阴性。
注：
⑴ 亦可用液体法进行试验：经培养后在培养基内滴加氢氧化钠溶液，观察结果，显红色为阳性。
⑵ 以上为酸性磷酸酶的试验方法。如果作碱性磷酸酶试验，可将磷酸对硝基酚加入pH 10.5、0.04mol/L的甘氨酸氢氧化钠缓冲液内。观察结果时不必另行加碱。
⑶ 酚酞指示剂产生的颜色随其pH而
变化，试剂的量要准确，太少或太多的碱均可引起假阳性或假阴性结果。
7.马尿酸盐试验培养基
[用途]
测定细菌水解马尿酸钠能力。该培养基常用方法有2种。
⑴ 三氯化铁法 [配法]
马尿酸钠1g，肉汤100ml。 三氯化铁试剂：三氯化铁12g溶于2 %盐酸100ml中。
将马尿酸钠和肉汤（pH 7.8）加热溶解后分装于试管中，每管4ml，121℃灭菌15min。冷却后用玻璃蜡笔记录培养基液面，置冰箱中备用。
[用法]
取纯菌接种培养基，35℃培养48h，观察培养基液面。如液面下降时以蒸馏水补充之。离心沉淀，取上清液0.8ml加入三氯化铁试剂0.2ml，立即混匀。经10～30min观察结果，出现稳定沉淀物为阳性。反之为阴性。
2.茚三酮法：
甘氨酸在茚三酮的作用下，经氧化脱氨基反应，生成氨、二氧化碳和相应的醛。而茚三酮则生成还原型茚三酮。反应过程中形成的氨和还原型茚三酮，与残留的茚三酮起反应，形成紫色化合物。
8.触酶试验培养基
[用途]
用于链球菌及革兰阳性球菌初步分群。
[用法]
⑴ 玻片法：取18~24h培养物，置于清洁玻片上，加1滴3%过氧化氢溶液，如产生大量气泡为阳性。
⑵ 试管法：取琼脂斜面（不含血液的）18~24h培养物，接种于试管内，加入3%过氧化氢溶液1ml，如产生大量气泡为阳性。 [质量控制]
金黄色葡萄球菌ATCC 25923阳性；无乳链球菌ATCC 13813阴性。
9.ß-半乳糖苷(ONPG)试验培
养基
[用途]
用于乳糖迟缓发酵菌和不发酵菌的鉴别。 [配法]
试剂甲为0.01mol/L pH7.0 磷酸 氢二钠缓冲液100m1；
试剂乙为 蛋白胨3g，氯化钠1.5g，蒸馏水300m1，pH7.0。
将试剂甲、乙分别置121℃灭菌15min，冷至40~50℃左右，试剂乙加入0NPG 0.6g，置56℃水浴中加热溶解，无菌过滤，将过滤液与试剂甲液合并分装试管，每管2m1，做无菌试验后备用。
[用法]
将标本接种培养基，35℃培养4~18h。培养基呈黄色者为阳性，不变黄色为阴性。 [质量控制]
大肠埃希菌ATCC 25922阳性；普通变形杆菌ATCC l3315阴性。
注：ONPG溶液不稳定，若培养基呈黄色即不可使用。
10.苯丙氨酸试验培养基
[用途]
苯丙氨酸脱氨酶是变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属所特有，可与肠杆菌科及其它细菌区别。也有助于种的鉴别，如苯丙酮酸莫拉菌呈阳性，其它莫拉菌属的菌种呈阴性。 [配法]
DL-苯丙氨酸2g，氯化钠5g，酵母浸膏3g，磷酸氢二钠1g，琼脂12g, 蒸馏水1L。
除琼脂外其它的成分加热溶解，调pH至7.3，再加入琼脂溶解后，分装，每管约4m1，高压灭菌121℃15min，置成斜面，凝固后4℃冰箱保存，备用。
[用法]
取18~24h培养物，大量接种于培养基，35℃孵育18~24h后在培养试管
中加入100g/L三氯化铁试剂4~5滴，转动使试剂布满斜面，阳性者呈绿色，阴性者呈黄色。 [质量控制]
普通变形杆菌ATCC l3315阳性；大肠埃希菌ATCC 25922阴性。
[保存]
置4℃冰箱保存，2周内用完。试剂可保存3月。
注：
(1) 苯丙氨酸试验须在加入三氯化铁试剂后立即观察，因绿色易很快褪去，无论阳性或阴性结果都必须在5min内作出判
断。
(2) 将斜面试管转动，让三氯化铁试剂流动，可使反应较快颜色亦较明显。
11.淀粉培养基
[用途]
用于链球菌和白喉棒状杆菌的分型鉴定。 [配法]
蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，琼脂(肉场培养基中不加)20g，氯化钠5g，蒸馏水1L，可溶性淀粉20g，小牛血清 50ml。
准确称量前4种成分加入500ml蒸馏水，缓慢加热溶解制成基础培养基。再将20g淀粉溶于250m1蒸馏水中。天然淀粉微溶于水，并不耐热，切勿煮沸过度，防止淀粉水解。将上述两种溶液合并混匀，补足水至lL，调pH至7.2，121℃灭菌15min，倾注平板备用。
附：Lugol碘液配制
⑴ 贮存液：将碘化钾 10g溶于100m1蒸馏水中，缓慢加入5g结晶碘不断研磨振荡直至溶解，装入棕色瓶中。
⑵ 应用液: 用蒸馏水将贮存液1∶5稀释，分装于棕色瓶中，每隔1月需新配制1次，溶液呈深黄色。 [用法]
取18~24h纯培养物接种琼脂平板，一般可接种几个培养物。置35℃孵育。18~24h或者直至出现足够的生长物。将Lugol碘液直接加到孵育过的平板上，培养基呈深蓝色，菌落周
围有透明圈为阳性，菌落周围无透明圈为阴性。
[质量控制]
无乳链球菌阳性；产气肠杆菌阴性。
[保存]
置4℃冰箱保存，2周内用完。碘液易于褪色，使用前应进行质量控制。
注：
⑴ 倾注好的淀粉琼脂平板不宜放冰箱中保存，培养基会变为不透明，可影响结果判断。建议将培养基置螺旋帽的试管中保存，临用时加热溶解倾注平板，冷却后使用。
⑵ 淀粉酶在pH低于4.5时不稳定。 ⑶ 配制时，避免过热，否则淀粉颗粒自动分解导致假阳性结果。
⑷ 培养时间应不少于36h。
三、碳源和氮源利用试验培养基
1.粘液酸利用试验培养基
[用途]
用于无动力不产气不发酵乳糖的大肠埃希菌与志贺菌属的鉴别。前者多数为阳性，后者均为阴性。 [配法]
蛋白胨10g，粘液酸10g，蒸馏水1L，2g/L溴麝香草酚蓝溶液12ml。
将上述成分混合溶解，校正pH为7.4。分装试管，每管约3~4m1，经121℃灭菌15min，4℃冷存备用。
[用法]
取试验菌株18~24h肉汤培养物1环接种培养基。35℃孵育l~2周，每天观察结果。培养基呈黄色为阳性，表明细菌能利用粘液酸盐；若培养基不变色则为阴性。 [质量控制]
大肠埃希菌 ATCC 25922阳性；痢疾志贺I型 ATCC l3313 阴性。
2.丙二酸盐试验培养基
[用途]
主要用于下述菌属的鉴定：阳性菌有粪产碱杆菌、亚利桑那菌、克雷
伯菌；阴性菌有不动杆菌属、沙门菌属、放线菌属；特别是枸橼酸杆菌，用于属内种的鉴定如弗劳地、异型枸橼酸杆菌呈阳性，而丙二酸盐阴性枸椽酸杆菌呈阴性。 [配法]
酵母浸膏1g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾0.6g，磷酸二氢钾 0.4g，氯化钠2g，丙二酸钠3g，葡萄糖0.25g，溴麝香草酚蓝0.025g，蒸馏水1L。 将上述成分溶解后调pH至6.7,分 装小试管，每管3m1， 121℃灭菌15min，冷却后置冰箱保存。
取纯培养物接种培养基中，35℃孵育24~48h。培养基由绿色变蓝色为阳性，培养基为绿色或黄色(仅葡萄糖发酵产酸)为阴性。应观察48h方可报告。
[质量控制]
肺炎克雷伯菌ATCC 27236阳性； 丙二酸盐阴性杆菌阴性。
[保存]
置4℃冰箱，1周内用完。
3.醋酸盐试验培养基
[用途]
用于肠杆菌科的鉴定。 [配法]
醋酸盐2g，氯化钠5g，硫酸镁2g/L，磷酸氢铵1g，磷酸氢二钾1g，琼脂20g，蒸馏水1L。
将上述成分加热溶解，校正pH
至6.8，然后加2g/L溴麝香草酚蓝溶液12ml，121℃灭菌15min，制成斜面备用。
[用法]
将试验菌接种到斜面上，35℃培养7d，每天观察1次。培养基由绿色变为蓝色为阳性。 [质量控制]
大肠埃希菌(ATCC 25922)阳性；宋内氏志贺菌(ATCC ll060)阴性。
[保存]
置4℃冰箱，2周内用完。
注：
⑴ 试验菌株要新鲜。
⑵ 阴性菌要观察至第7天，方可报告。
4.葡萄糖酸盐试验培养基
[用途]
帮助属间鉴别、种间鉴别和沙雷菌属菌种的鉴定。 [配法]
蛋白胨1.5g,磷酸氢二钾1g,酵母浸膏1g,葡萄糖酸钾40g,或葡萄糖酸钠37.25g,蒸馏水1L。
将上述成分加热溶解，调pH至7.0，然后分装试管，每管2m1， 115℃灭菌15min，冷却备用。取待检菌大量接种培养基，35℃培养24~48h,加斑氏试剂1ml，充分混匀，隔水加热煮沸10min，观察结果。产生黄—橙色沉淀为阳性，蓝色沉淀为阴性。 [质量控制]
肺炎克雷伯菌ATCC 27236阳性；大肠埃希菌ATCC 25922阴性。 5.枸橼酸盐试验培养基
[用途]
鉴定细菌对枸橼酸盐及无机铵的利用能力。
[配法1(Simmons)]
硫酸镁0.2g，磷酸二氢铵1g，磷酸氢二钾1g，枸橼酸钠5g，琼脂20g,氯化钠5g,2g/L 溴麝香草酚蓝溶液40m1,蒸馏水1L(pH 6.8)。 [配法2(Christensen)]
枸橼酸钠3g，葡萄糖0.2g，酵母浸膏0.5g，盐酸半胱氨酸0.1g，枸橼酸铁铵0.4g，磷酸氢二钾1g，硫代硫酸钠0.08g，氯化钠5g，酚红0.012g,琼脂5g，蒸馏水 lL（pH6.9）
先将盐类溶解于水内，调整pH，再加入琼脂，加热溶化后，加入指示剂，混合均匀后分装试管，高压灭菌121℃15min，放成斜面。将待检菌浓密地划线接种在上述斜面上，于35℃培养1~4天，逐日观察结果。
Simmons(西蒙)枸橼酸盐培养基斜面上有细菌生长，培养基由绿变成蓝
色为阳性，无细菌生长，颜色不变蓝色为阴性；Christinsen(柯氏)枸橼酸盐培养基斜面呈红色为阳性，颜色不变为阴性。
[保存]
置4℃冰箱，2周内用完。 [质量控制]
肺炎克雷伯菌阳性；大肠埃希菌ATCC 25922 阴性。
注：
⑴ 当挑取同一培养物接种一组生化试验管时，在接种枸椽酸盐培养基前，接种针或环要用火焰灭菌，或先接种枸橼酸盐培养基。因培养基上若存在葡萄糖或其它营养物质可导致假阳性。
⑵ 接种时菌量应适宜，过少可导致假阴性结果，接种物过量可导致假阳性结果。
⑶ 通常培养24h观察结果，但有些枸橼酸盐阳性的细菌则需孵育48h以上，才能使培养基的pH变化。
6.碳源利用试验培养基 [用途]
测定细菌利用碳源的能力。 [配法]
磷酸氢二铵0.5g，磷酸二氢钾
1.3g，磷酸氢二钠3.2g，硫酸钠0.8g,硝酸钠1g，待测物质2~10g，蒸馏水1L。
将各成分溶于水中，校正pH 7.2，分装，116℃灭菌15min。
[用法]
将待试菌制成低浓度的9g/L氯化钠溶液菌悬液，接种培养基，于适当的温度下培养24~48h。若有细菌生长即为阳性，反之为阴性。 [质量控制]
菌液不可太浓，否则结果不易观察。应设已知菌阴性、阳性对照。可用多种细菌试验同一含碳化合物，亦可用多种含碳化合物试验同一种细菌。
注：
⑴ 使用的含碳化合物主要为各种糖类和有机酸类。
⑵ 不能用一支培养管做多项试验。
四、其它生化试验培养基
1.硝酸盐还原试验培养基
[用途]
肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐，如铜绿假单胞菌能还原硝酸盐并可产生氮气等，而有些细菌则无此特性，故可以此鉴别。 [配法]
蛋白胨10g，硝酸钾(分析纯)2g，蒸馏水1L。
上述成分混合后，加热溶解，校正pH至7.4。分装试管每管约4m1，121℃灭菌15min后备用。
附：试剂配制
甲液：对氨基苯磺酸0.8g，5mol/L冰醋酸100ml。
乙液：ɑ-萘胺0.5g，5mol/L冰醋酸溶液 100m1。
[用法]
将试验菌接种培养基，经35℃培养l~4 天，每天吸取培养液1ml，加入液甲、乙试剂各2滴，阳性者立刻或数秒钟内显红棕色，阴性则不变色。
[质量控制]
大肠埃希茵ATCC25922 阳性；硝酸盐阴性不动杆菌ATCC15038 阴性。
注：
⑴ 因亚硝酸盐在自然界中分布很广，制备此培养基时所用器皿均要清洗干净。 ⑵ 硝酸盐试验很敏感，未接种的硝酸盐培养基应以试剂进行检查，确定培养基中是否存在亚硝酸盐，从而排除假阳性结果。 ⑶ 本试验在判定结果时，必须在加试剂后立即观察，否则可因培养液迅速褪色而影响判定。
⑷ 沙门菌属、假单胞菌属的某些菌株，不但能还原硝酸盐为亚硝酸盐，而且还能使亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮导致假阴性结果。
⑸ 若加入硝酸盐试剂不出现红色，需检查硝酸盐是否被还原。可于原试管内再加入少许锌粉，如出现红色证明产生芳基肼，表示硝酸盐仍然存在；如仍不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮。亦可在培养基内加1只小倒管，若有气泡产生，表示有氮气生成。可以排除假阴性。
2.亚硝酸盐还原试验培养基
[用途]
测定细菌还原亚硝酸盐的能力。 [配方]
蛋白胨10g,亚硝酸钾2g,酵母浸膏3g,蒸馏水1L.
将上述成分混合后，加热溶解，调pH至7.0。分装试管每管约4ml，加入小倒管1只，121℃灭菌15min后备用。
[用法]
将试验菌接种于亚硝酸盐培养基中，35℃培养24~48h。24h观察倒管中有无气泡出现，若有气泡则为阳性，无气泡为阴性。48h培养物检测亚硝酸盐存在与否。方法是在培养物内 加入硝酸盐还原试剂甲、乙液各0.5m1, 如无红色出现为阳性，说明亚硝酸盐已被还原;反之为阴性，说明培养基中尚有亚硝酸盐存在。 [质量控制]
铜绿假单胞菌 ATCC 27853阳性; 硝酸盐阴性不动杆菌ATCC l5038阴性。
[注意事项]
⑴ 因亚硝酸盐在自然界中分布很广，故在制备此培养基时所用器皿均要清洗干净。
⑵ 未接种的亚硝酸盐培养基应以硝酸盐试剂进行检查，出现红色反应方可使用。
3.40％胆汁肉汤培养基 [用途]
用于链球菌属的鉴别。 [配法]
蛋白胨10g,氯化钠5g,牛肉浸膏5g,新鲜胆汁(猪、牛)400m1,蒸馏水600m1。
先将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠加热溶于蒸馏水中，调pH至7.6，加入胆汁混匀后，分装试管，每管3m1，置115℃灭菌20min，冷藏备用。取新鲜猪(牛)胆若干只，取胆汁用沙布过滤，装于瓶中115℃灭菌20min，冷却后置4℃冰箱内，次日取出吸取上清液备用。
[用法]
取待检标本接种肉汤，置35℃培养24~48h，观察有无细菌生长。阳性菌呈颗粒状生长，上液澄清，管底有沉淀；阴性菌则不生长。 [质量控制]
粪肠球菌ATCC 29212阳性；化脓链球菌ATCC l9615阴性。
注：若为初次观察或培养基本身不易
观察，可转种血琼脂平板。
4.CAMP试验培养基
[用途]
检查细菌产生和合成CAMP因子的能力。
[配法]
同血琼脂平板。 [用法]
在血琼脂平板上，先以金黄色葡萄球菌划一横线接种，再将被检的ß 群链球菌与上述划线作垂直划线接种,两者不能相交，相距0.5~1.0 cm，于35℃培养18~24h。在两种细菌划线之交接处出现箭头形透明溶血区为阳性;无箭头状溶血区为阴性。 [质量控制]
无乳链球菌ATCC l3813阳性；粪肠球菌 ATCC 29212阴性。
注：
⑴ CAMP为
Christic,Atkins,Munch-Petersen四人名。
⑵ 每批要用A、D群链球菌作阴性对照，用B群链球菌作阳性对照。
⑶ 用无菌9g/L氯化钠溶液洗涤3次的羊红细胞，制成5%含量的羊血琼脂平板效果较好。
（4）用葡萄球菌ß-溶血素滤液做成纸条进行试验效果亦较佳。
4.硫化氢试验培养基
[用途]
观察细菌产生硫化氢的作用。 检测硫化氢产物有很多方法，以醋酸铅法最为敏感。其适用于肠杆菌科以外的细菌所产生的少量硫化氢的检测；而硫酸亚铁法，为检查硫化氢
的常规培养基。现将两培养基分述如下：
⑴ 醋酸铅培养基 [配法]
蛋白胨10g,胱氨酸0.1g,硫酸钠0.1g,蒸馏水1L
将上述成分加热溶解，调整pH为7.0~7.4，分装试管，每管液体高度为4~5cm，115℃灭菌20min。将滤纸剪成0.1~1.0 cm宽的纸条，用50 ~100g/L醋酸铅溶液浸透、烘干，置于皿内备用。
[用法]
将培养物接种上述培养基中，挂上纸条经35℃孵育24h。纸条变黑为阳性，无变化为阴性。 ⑵ 硫酸亚铁琼脂 [配法]
牛肉膏3g,酵母浸膏3g,蛋白胨10g,硫酸亚铁O.2g,氯化钠5g,硫代硫酸钠0.3g,琼脂12g,蒸馏水lL。 将上述成分加热溶解，分装试管，每管3m1，115℃灭菌20min，备用。
[用法]
将试验菌株穿刺接种到培养基中，经35℃培养24h后，观察结果。培养基呈黑色为阳性，不变黑色为阴性。
[质量控制]
鼠伤寒沙门菌ATCC l3311阳性；宋内志贺菌ATCC ll060阴性。
[保存]
置4℃冰箱，2周内用完。
5.奥普托欣敏感试验纸片（Optochin sensitivity test)
[用途]
测定细菌对化学药品奥普托欣敏感性。 [配法]
奥普托欣（Optochin，乙基氢化羟基奎宁，ethylhydrocupreine
hydrochloride)10mg溶于10m1蒸馏水中，取1m1，加入200片直径6mm的灭菌纸片中，使其充分吸收，于37℃烘
干备用。每片含Optochin 5μg或将宽8mm的滤纸条浸于1﹕4 000的
Optochin水溶液中，取出烘干备用。 [用法]
将被检菌的肉汤培养物用无菌棉棒均匀涂布于血琼脂平板上，取
optochin纸片贴于平板上，35~37℃培养18~24h。抑菌圈在18mm以上为敏感，无抑菌圈或抑菌圈＜10mm为耐药。
[质量控制]
肺炎链球菌(ATCC l0015)阳性;化脓性链球菌(ATCC l9615)阴性。 注：如果分离物生长稀少，则很难正
确判定结果。其判定敏感的最低标准为抑菌环直径15~16mm或更大；若＜15mm，应加做胆汁溶解试验来确定。
6. O/129试验纸片
[用途]
用于弧菌属的鉴定。 [配法]
O/129 50mg溶于50ml无水乙醇中，取1ml加入100片直径6mm的无菌滤纸片中，吸收后于37℃烘干备用。每片滤纸含O/129 10μg。 [用法]
将待检菌的肉汤涂布于碱性琼脂平板，取O/129纸片贴于平板上，35℃培养18~24h。平板出现抑菌圈为阳性，无抑菌圈为阴性。 [质量控制]
创伤弧菌阳性；亲水气单胞菌阴性。
7.pH9.6肉汤培养基
[用途]
用于鉴定链球菌。 [配法]
pH9.6的肉汤100m1，葡萄糖 2g/L。
将普通肉汤调整pH9.6，加入葡萄糖溶解后，分装试管，每管2~3m1， 121℃灭菌15min，备用。
[用法]
将待检菌接种培养基，置35℃培
养18~24h。培养基有混浊物为阳性。 [质量控制]
粪肠球菌 ATCC 29212阳性；化脓性链球菌 ATCC l0389阴性
[保存]
4℃冰箱保存，2周内用完。 8.氰化钾试验培养基 [用途]
主要用于属间的鉴别，生长有：弗氏枸橼酸杆菌、克雷伯菌-肠杆菌菌群、铜绿假单胞菌；不生长：沙门菌-亚利桑那菌群、大肠埃希菌、粪产碱杆菌。
[配法]
蛋白胨10g,氯化钠5g,磷酸二氢钾 0.225g,磷酸氢二钠 4.5g,蒸馏水lL。
将上述成分加热溶解在三角烧瓶中， 121℃灭菌15min，临用时加入50g/L 氰化钾溶液1.5m1混匀，分装于无菌试管中，一份不加氰化钾作对照。
[用法]
取纯培养物接种两管，1支氰化钾实验管，1支对照管，置35℃培养24~72h。阳性结果为实验管混浊，对照管混浊；阴性结果(敏感)为实验管清晰(不生长)，对照管混浊(生长)。 [质量控制]
铜绿假单胞菌ATCC 27853生长；福氏志贺菌不生长。
[保存] 置冰箱内，1周用完。
注：
⑴ 氰化钾抑菌能力与接种菌量及培养基成分有很大关系，所以在试验时接种菌量不宜过多。
⑵ 氰化钾剧毒，使用时注意安全。氰化钾培养基废弃前(无论是否用过)，应作无害化处理：向每管加400 g/L 氢氧化钾溶液0.1m1和米粒大的硫酸亚铁结晶。
9.葡萄糖蛋白胨水培养基 [用途]
⑴ 帮助肠杆菌属与大肠埃希菌属，葡萄球菌属与微球菌属的属间鉴别；
（2）帮助肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、臭鼻克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌间的菌种鉴别；
（3）帮助蜂房哈夫尼亚菌与小肠结肠炎耶尔森菌的菌种鉴定。 （4）用于VP试验。 [配法]
多价蛋白胨7g，葡萄糖5g，磷酸氢二钾5g，蒸馏水1L。
将上述成分混合溶解后，调pH至 7.2，分装小试管， 121℃灭菌15min. 置4℃冰箱中保存备用。
[用法]
取18~24h培养物小量接种，35℃孵育24~48h，有时可能延长数天。有些细菌，特别是哈夫尼亚菌，在35℃孵育时VP试验结果不稳定，但在
25~30℃下则呈阳性。若怀疑为哈夫尼亚菌时，可重复VP试验并在25℃孵育。
观察方法：
（1）奥梅拉(O-Meara)法 试剂： 氢氧化钾 40g、肌酐0.3g、蒸馏水100m1。
首先将氢氧化钾溶解。然后加肌酐保存3~4周。观察时按培养基试剂 10﹕1比例滴加试剂，混合，置
37℃4h或48℃2h，充分振摇，变红色为阳性。
（2）贝立脱 (Barritt)法
试剂甲液： 60g/L甲-萘酚乙醇溶液；乙液：400g/L氢氧化钾溶液。
观察时按每2m1培养物加甲液lml，乙液0.4ml混合，置
35℃15~30min出现红色为阳性，若无红色，应置35℃4h后再判定，本法较奥氏法敏感。 [质量控制]
大肠埃希菌 ATCC 25922阴性；阴沟肠杆菌阳性。
[保存]
培养基置4℃冰箱，2周内用完。试剂易失效，应用前应进行质量控制。
注：
⑴ 加入O-Meara试剂后要充分混合，促使乙酰甲基甲醇氧化，使反应易于进行。 ⑵ 试剂必须用已知阳性和阴性的标准菌株进行对照检查。
⑶ 试剂中加入400 g/L 氢氧化钾是为了吸收二氧化碳。加入量少于0.2m1，且次序不能颠倒。
⑷ 贝立脱方法是相当敏感的，它可检出以前认为VP试验阴性的某些细菌。 ⑸ 许多实验室工作人员有一个错误的印象，即VP试验阳性菌MR试验自然是阴性，或反之亦然。实际上，肠杆菌科的大多数细菌产生相反的反应（由于乙酰甲基甲醇形成碱性增加导致MR阴性和VP阳性）。某些细菌如蜂房哈夫尼亚菌(哈夫尼肠杆菌37℃下孵育和奇异变形杆菌可产生MR和VP同时阳性反应，后者常延迟出现。
⑹ α-萘酚乙醇溶液易失效，试剂放室温暗处可保存1月。氢氧化钾溶液可长期保存。国内多采用贝立脱法。
10.甲基红试验培养基 [用途]
检查细菌发酵葡萄糖产酸的能力；用于鉴别某些细菌，如大肠埃希菌(阳性)、产气杆菌(阴性)、阴沟杆菌(阴性)，克雷伯菌属一般为阴性，耶尔森茵属阳性，其它革兰阴性非肠道杆菌阴性，单核李斯特菌阳性。 [配法]
⑴ 葡萄糖蛋白胨水培养基(见前)。
⑵ 试剂：甲基红0.1g，95％乙醇300m1，蒸馏水200m1。 [质量控制]
大肠埃希菌ATCC 25922阳性；产气肠杆菌阴性。
注：
⑴ 试剂和培养基在应用前要用已知阳性菌(如大肠埃希菌)和已知阴性菌(如克雷伯菌)做对照试验。
⑵ MR试验的正确性取决于足够的孵育时间，接种细菌后至少要孵育24h。通常每毫升培养物滴加1滴指示剂。
[保存]
置4℃冰箱，培养基2周内用完。甲基红试剂置密闭的棕色瓶内，可使
用3月。
11.蛋白胨水培养基 [用途]
用于细菌靛基质试验。 [配法]
蛋白胨(或胰蛋白胨)20g，氯化钠5g，蒸馏水1L。
将上述成分溶于水中，校正pH至7.2，分装试管，每管2~3m1，置121℃灭菌15min备用。
附：试剂配制
⑴ 靛基质柯氏试剂：对二甲氨基苯甲醛5g溶于异戊醇75ml中，待冷却后慢慢加入浓盐酸25ml。
⑵ 欧氏试剂：对二甲氨基苯甲醛1g溶于95%乙醇95ml中，溶解后慢慢加入浓盐酸20m1。
（3） 色氨酸滴板法试剂： L-色氨酸0.1g溶于100ml（pH 6.8）抗菌药物敏感试验用于测定抗菌药物或其它抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。有琼脂扩散法和稀释法两种。
WHO推荐改良Kirby-Bauer法抗菌药物敏感试验，其技术简单，可重复性好，且特别适合快速生长的致病菌。但其不适用于肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和奈瑟菌的抗菌药物敏感试验，这些的细菌须在常规的抗菌药物敏感试验培养基内补充特殊的营养成分。
0.01mol/L磷酸盐缓冲液中。
[用法]
将待检菌接种培养基，经35℃培养18~24h，在培养物液面，徐徐加入靛基质试剂数滴，阳性者立即出现玫瑰红色，阴性者呈黄色。 [质量控制]
大肠埃希菌 ATCC25922 阳性；肺炎克雷伯菌 阴性。
[保存]
置4℃冰箱，使用期2周。
注：
⑴ 靛基质试验方法还有试纸悬挂法，色氨酸滴板法及斑点法，请参阅有关资料。 ⑵ 选用的蛋白胨一定要含有丰富的色氨酸，否则不能应用。
⑶ 国内多采用柯氏试剂。
第六节 抗菌药物敏感试验培养基
将上述各成分混合，静置10min，待可溶物完全溶解后，121℃高压15min灭菌。冷至50℃左右，吸取25m1培养基注入直径90mm的平皿内，制成厚度为4mm的琼脂平板。 [质量控制]
用质控菌株测定药物的抑菌环与NCCLS的标准参比判断培养基的质量。 常用的标准菌株有：金黄色葡萄球菌ATCC 25923；大肠埃希菌ATCC 25922；铜绿假单胞菌ATCC 27853；粪肠球菌 ATCC 29212或33186；肺炎链球菌ATCC 6305；流感嗜血杆菌ATCC l0211。
[保存]
琼脂平板应新鲜使用， 4℃冰箱保存，1周内用完。
注：
⑴ 质量控制标准参见NCCLS纸片法药敏试验操作标准。
⑵ 在M-H琼脂培养基添加5 %脱纤维羊血，即可用于肺炎链球菌的抗菌药物敏感试验。
⑶ 在M-H琼脂培养基上，补充辅酶Ⅰ15mg/ml，牛血红蛋白15mg/m1，酵母浸
一、M-H琼脂培养基
[用途]
Kirby-Bauer法抗菌药敏试验指定使用本培养基。M-H琼脂(Muller-Hinton琼脂，水解酪蛋白琼脂)加5 %羊血制成血琼脂平板或制成巧克力琼脂平板用于检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌。 [配法]
牛肉浸出物1L，水解酪蛋白
17.5g，可溶性淀粉1.5g，琼脂17g。
膏5mg/m1，胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶0.2 U/m1，可用于流感嗜血杆菌的抗菌药物敏感试验。
(4) NCCLS推荐淋病奈瑟菌用GC琼脂平板，添加生长补充剂。生长补充剂由下列试剂组成：每100ml水中含有1.1mg胱氨酸，0.03g鸟嘌呤，3mg硫胺，13mg对-氨基苯甲酸， 0.01g维生素B12 , 0.1g羧化辅酶，0.25g辅酶Ⅰ,1mg嘌呤腺，10mg L-谷氨酰胺，100mg葡萄糖，0.02g硝酸铁。
二、M-H肉汤培养基 [用途]
用于稀释法细菌药物敏感试验(MIC和MBC测定)。 [配法]
牛肉浸汤600m1，水解酪蛋白17.5g，可溶性淀粉1.5g，蒸馏水400ml。
将上述成分混合加热溶解，校正pH
至7.3±0.1，121℃灭菌15min备用。如试验菌对营养要求较高，临用前按0.5%比例加入羊血。 [质量控制]
质控菌株同M-H琼脂培养基，凡自配或购置商品培养基均需用质控菌株和药物标准品进行测试，结果符合方可使用。
[保存]
置4℃冰箱2周内用完。
注：
NCCLS推荐使用含阳离子M-H培养基，即在M-H液体培养基中含有钙离子10
~25mg/L，镁离子10 ~25mg/L。配法如下:氯化钙3.68g溶于100ml蒸馏水中，即为含钙离子10mg/ml贮存液。氯化镁8.36g，溶于100ml蒸馏水中，即为含镁离子10mg/ml贮存液。
第七节 L型细菌培养基
一、 L型细菌增菌培养基 (一)高渗液体L型细菌菌增菌培养基
[用途]
可用作基础培养。也用于血液、骨髓、胸水等标本进行L型细菌增菌培养。
1.高渗盐液体增菌培氧基 [配法]
新鲜牛肉500g，蛋白胨10g,氯化钠40g，蒸馏水1L。
将新鲜牛肉去除脂肪、筋膜，切成小块后用绞肉机绞碎，称取500g加水1L混合后置冰箱浸泡过夜；将肉浸液煮沸30min，然后用麻布或绒布挤压过滤；加入蛋白胨、氯化钠后加热溶解，并补足因蒸发而失去的水分，调整pH至7.4~7.6；用滤纸过滤后分装小瓶，121℃灭菌15~20min。
2.高渗糖液体增菌培养基 [用途]
用于血液、骨髓、胸水等标本的L
型细菌增菌培养。
[配法]
新鲜牛肉500g，蛋白胨10g,氯化钠30g，蔗糖150g，蒸馏水1L。
同上述高渗盐培养基，唯高压蒸汽灭菌时采用115℃ 20min，以免蔗糖分解。
[用法]
取血液5ml及其它标本直接种于高盐、高渗糖液体培养基，置35℃培养l~7 天，每天观察细菌生长情况。在上述增菌培养基上， L型细菌呈颗粒状生长，颗粒可粘附于管壁或沉淀于管底。
[质量控制]
金黄色葡萄球菌L型生长良好。
(二)L型增菌培养基
[用途]
用于血液、脑脊液等体液标本中L型细菌的增殖培养。 [配法]
⑴ 牛肉浸液1L,氯化钠30~40g,蛋白胨(优质)20g.
⑵ 牛肉浸液1L，氯化钠30g，蔗糖150g，蛋白胨20g。
将各成分称量混合加热溶解后，校正pH至7.4~7.6，分装培养瓶，每瓶15m1，121℃灭菌15min备用。
[用法]
用无菌操作采集标本，立即接种于L型细菌液体培养基和常规血液增菌培养基内，标本与培养基之比为1︰10，置35℃培养3~7 天，逐日观察。如发现培养液产生混浊、溶血、絮状沉淀或瓶壁上附有粘性颗粒等细菌生长现象，立即分离至L型细菌分离平板上进行鉴定。 [质量控制]
用L型细菌做生长试验，培养24~72h，生长良好。
[保存]
置4℃冰箱内使用l~2周。
水浴灭活30min。 2．蚌埠
85-7分离平板
二、L型细菌分离琼脂培养基
[用途]
用于常见L型细菌的分离培养。 1.Kaqan分离平板 [配法]
牛肉浸液800m1，氯化钠50g，蛋白胨(OXoid)20g，琼脂粉(Oxoid)8g，血浆(人、马、羊)200m1。
将前四种成分称量混合加热溶解，校正pH 至7.5±0.1，分装每瓶80m1，121℃灭菌15min冷藏备用。
临用时加热溶解后，冷却至56℃加入血浆20ml摇匀倾注平板。放在密封塑料袋中，置4℃冰箱备用。
注：血浆要预先灭菌处理，并经56℃
[配法]
牛肉浸液1L，氯化钠40g，蛋白胨30g，明胶(生物试剂)30g，琼脂粉5~8g。
将上述成分混合，加热溶解，校正pH 至7.4~7.6，分装后，经121℃灭菌15min后倾注平板，置4℃冰箱备用。
[用法]
将血、脑脊液、尿等标本或增菌培养物滴种于平板约0.1m1，用L型玻棒均匀涂开，置35℃温箱内启盖片刻，除去平板表面水分。在平板的边端贴一片专用诱导纸片。覆盖后置35℃10 %二氧化碳环境下3~5 天，逐日观察。如有可疑L型菌落，用低倍镜检查。在诱导区与非诱导区同时见到L型菌落说明标本内确有L型细菌存在；若诱导区存在L型菌落，而非诱导区无，则提示标本内有L型细菌变异的趋向。 [质量控制]
⑴ 细菌诱导试验，在该平板上能诱导金黄色葡萄球菌CowengⅠ标准菌株出现L型菌落和G型菌落。 ⑵ 用L型菌落作10-7稀释，取0.1ml接种，经培养获得单个菌落和纯培养。
[保存]
置4℃冰箱内，2周用完。
20mg，磷酸二氢钾120mg，磷酸氢二钠440mg，蒸馏水500ml，无菌兔血清(灭活) 8~10ml。
将各成分溶于蒸馏水内煮沸
20min，以滤纸滤，调至pH为7.2，分装烧瓶内，每瓶100ml，12l℃灭菌20min；无菌采取兔心血分离血清，置 56℃水浴箱中30min以破坏补体；上述蛋白胨盐溶液每100ml中加入无菌
第八节 钩端螺旋体、支原体和衣原体培养基
一、钩端螺旋体培养基—柯少夫(Korthof)培养基
[用途]
用于钩端螺旋体增殖。 [配法]
蛋白胨400mg，氯化钠700mg，碳酸氢钠10mg，氯化钾20mg，氯化钙
兔血清8~10m1；混合后，用无菌分装中号试管中，每管5m1；置56℃水浴箱30min；37℃温箱中孵育2天，剔去污染者。
注:
⑴ 为防止污染，每100m1培养基可加50mg磺胺嘧啶钠。
⑵ 为了促进钩端螺旋体生长，可于该培养基中加入维生素B12及烟酸(各1mg/100m1)，并将兔血清量自8 %减至5 %，培养基中不加氯化钙，（因氯化钙对生长无作用，且常形成沉淀物），再以100℃加热30min。用此法制得培养基清晰，无任何沉淀。
二、支原体培养基
1. 1.4 % PPLO琼脂培养基
[用途]
分离支原体。 [配法]
牛心(去脂绞碎)250g，氯化钠5g,胰蛋白酶(不含乳糖)2.5g，蛋白胨10g,酵母浸膏1g，琼脂粉14g，蒸馏水1L。
⑴ 牛心消化液配制：取去脂绞碎牛心250g，氯化钠5g及蒸馏水900m1混合；另取胰蛋白酶2.5g，溶解于100ml 5g/L 氯化钠溶液中，然后与上述牛心消化液混合，放置50~60℃水温箱内消化2h，中间不断搅拌，消化后用两层纱布过滤，滤液煮沸5min，用滤纸过滤后，补足水分至原量，然后加酵母浸膏1g，混匀，冷却后调pH至8.0，分装后121℃灭菌15min备用。 ⑵ 支原体基础琼脂：取上述牛心消化液(已加氯化钠)lL，加蛋白胨10g和琼脂粉14g，混合后，加热溶解，调pH至7.8~8.0，再加热煮沸，用脱脂棉或绒布过滤，过滤后分装于圆瓶中，每瓶70m1，121℃灭菌15min，备用。
⑶ 250g/L鲜酵母液制备: 食用鲜酵母块250g，加蒸馏水1L，混合后，煮沸2min，用滤纸过滤，滤后置4℃冰箱中过夜，使之沉淀，次日吸取上清液，用150g/L氢氧化钠溶液调pH
至8.0，再煮沸1次，冷却后，3000r／min离心45min，吸取上清液，分装于瓶中，121℃灭菌15min，放4℃冰箱中备用，可保存3月。
⑷ 倾注平板：溶解基础琼脂，冷却至80℃左右，每瓶（70ml）内立即加预温在37℃培养箱内的无菌马血清或小牛血清20m1，250g/L鲜酵母浸出液10ml，10g/L乙酸铊溶液2.5m1，青霉素G钾盐溶液(20万U／m1)0.5m1和两性霉素B溶液(5mg/ml)0.1m1；充分混匀后倾注9cm平板，经37℃培养过夜，无菌试验阴性者，存放4℃冰箱备用。
注：
⑴ 乙酸铊是极毒药品，须特别注意安全操作。
⑵ 支原体美蓝琼脂平皿为分离肺炎支原体的选择性平皿，口腔、唾液分泌物中的其它支原体均被抑制生长，肺炎支原体生长为“桑椹状”无色的菌落。
⑶ 支原体传代、移种用0.1%半固体琼脂，配制时除用0.1%琼脂粉外，其它成分与支原体基础培养基相同，但不加两性霉素，此半固体琼脂分装在试管内灭菌备用。传代时将平皿上已选定的支原体菌落用无菌刀片切下一小块，直接移种于半固体管中，置适当的气体环境中，培养3~5天后，可在琼脂小块出现“小岛状”絮片生长物，或呈颗粒状，即次代支原体。
⑷ 支原体传代用液体培养基：其成分与上述支原体半固体琼脂相同，不加琼脂粉和两性霉素B。
2.肺炎支原体分离用双相培养基
[用途]
用于喉拭标本直接分离肺炎支原体。
[配法]
⑴ 底层琼脂斜面：其成分与上述支原体半固体琼脂相同，不加两性霉素B。无菌分装于经灭菌的链霉素空瓶中，每瓶3m1，置成斜面，此为底层。 ⑵ 液体培养基：其成分与上述支原体传代用液体培养基相同。但在未
高压灭菌前，再加入葡萄糖1g，美蓝0.001g(即10g/L美蓝溶液0.1ml)，1g/L酚红溶液2m1，115℃灭菌
15min，冷却后，再加入辅助成分和防止杂菌生长的成分。然后，在上述底层琼脂斜面上，每瓶再加入液体培养基3~5m1，瓶塞用煮沸灭菌的后口橡皮塞。经37℃培养过夜，无菌试验阴性者，存放4℃冰箱中备用，可保存1月。
注：已接种的双相培养管，培养37℃普通环境2~4周，观察结果，阳性生长见双相管由淡紫色变成绿色，再转变为黄色,因肺炎支原体发酵葡萄糖，还原美蓝。取阳性管用分离支原体固体平皿分离菌落，平血放入含95 %氮气和5 %二氧化碳环境中，或放入含5% 二氧化碳环境中培养2~4周，阳性平皿可见菌落生长。
三、衣原体培养基－鸡胚培养
基
[用途]
培养增殖和分离鹦鹉热、性病淋巴肉芽肿和沙眼等衣原体。 [配法]
第九节 一、沙保罗琼脂培养基 [用途]
供真菌及酵母样真菌的分离培养用。
[配法]
麦芽糖40g,蛋白胨10g,琼脂20g，蒸馏水1L。
将上述成分溶于水，加热溶解，调pH至6.0±0.2，分装三角瓶或试管中，118℃灭菌15min，倾注平板或置斜面，无菌试验后备用。
[用法]
将标本接种培养基，如系血液标本，则采取1～2ml，与冷却至45℃左右沙保琼脂混合，倾注接种平板。分别置35℃和25℃恒温箱内同时培养。35℃培养48h,25℃需连续培养5天,逐日观察结果。发现真菌及酵母样可疑
7日龄鸡胚3~5只。
精选产后10天内并10℃左右保存的受精鸡卵孵育，置38~39℃、相对湿度40%~60%的孵卵箱中孵育，4天后用检卵灯检视发育情况，挑出未受精及死亡者。生活鸡胚检视时可见清晰血管小团或花纹，其中有鸡胚暗影，稍大者并见胚动等。将感染材料研磨合并，加含抗菌药物的肉汤制成l0%~20% 的悬液，室温中置1h后，接种鸡胚卵黄囊0.25m1，每份标本接种3~4只鸡胚，置35℃培养，每日观察1次。3天以后死亡的鸡胚收获其卵黄囊，先做涂片染色，检选疑似或阳性材料再行传代，直到含有丰盛衣原体。 注：
⑴ 如感染后13天鸡胚仍然存活，再行 盲目传代。先将鸡胚在4℃冰箱中放几小时，然后解剖黄囊，研碎后制成悬液，低速离心，取上清液接种鸡胚。如连续3代阴性，为阴性结果。
⑵ 待检标本于室温不宜久置，如1h内不能接种，可放普通冰箱中;如放置-70℃低温中，则可保存较长时间。
真菌培养基
菌落，转种沙保菌斜面，获得纯培养后进行鉴定。 [质量控制]
白色念珠菌和新型隐球菌生长良好。 注：
⑴ 本培养基如不加入琼脂，即为沙保罗液体培养基，供真菌及念珠菌的增菌培养用。
⑵ 增加氯霉素0.05～0.125mg/ml或放线菌酮0.5mg/ml，可抑制细菌和污染的霉菌及隐球菌生长。此二种药均耐热，可直接加入培养基内高压灭菌。
⑶ 添加酵母浸膏5mg/ml，可促进皮肤癣菌生长。增加维生素B 0.1mg/ml，可促进紫色癣菌和断发癣菌生长。
⑷ 将麦芽糖减少到20g/L，为沙保罗20g/L麦芽糖琼脂培养基，可供诱导真菌产生孢子用。
⑸ 该培养基呈酸性，应提高20%的琼
脂用量。
二、玉米粉琼脂培养基 [用途]
鉴定酵母样真菌用。白色念珠菌在该培养基上25℃24h培养可长出假菌丝，顶端有典型的厚壁孢子，可与其它念珠菌鉴别。 [配法]
玉米粉4g，琼脂粉8g，蒸馏水1L （pH6.0±0.2）。
将细米粉加水浸泡数分钟，扎紧瓶口，浸入60℃水浴4h，取出后用沙布过滤，除去粗渣，补足水分。无须调整pH。加入琼脂，煮沸溶解，有沉淀物再过滤1次，分装试管，121℃灭
一、液体培养基—石蕊牛乳培养基
[用途]
观察细菌对牛乳的凝固及发酵作用。
[配法]
新鲜脱脂牛乳1L，20g/L石蕊水溶液10ml(16g/L溴甲酚紫乙醇溶液 1ml)（pH6.8）。
将新鲜牛乳隔水煮沸30min，冷却后置4℃冰箱内过夜。用吸管吸出下层乳
汁，注入另一烧瓶内，弃去上层乳脂。加入石蕊溶液，分装试管，灭菌113℃15min（或间歇灭菌）。置35℃ 培养24～48h，若无细菌生长，即可4℃冷藏备用。
菌15min备用。
用玻璃片法点种后，置平皿内，保持一定湿度，置23～26℃下培养24～48h。取出玻片培养物，用高倍镜观察真假菌丝和有无厚壁孢子。
[质量控制]
白色念珠菌（ATCC 26790）厚膜孢子阳性；新型隐球菌（ATCC 9763）厚膜孢子阴性。
注：
⑴ 玉米粉可用糯米粉或可溶性淀粉代替,效果相同。
⑵ 该培养基加入10ml/L Tween-80，制成玉米粉Tween-80琼脂，用途相同，效果更好。
第十节 厌氧菌培养基
为胨，培养基上层液体变清，底部可留有未被完全胨化的酪蛋白。
产碱 乳糖不发酵，因分解含氮物质，生成胺及氨，培养基变碱，指示剂变为蓝色。
不变 乳糖不发酵，指示剂无变化，与未接种管相同。
白色 石蕊被还原成白色。 急骤发酵；酸凝块被产生的大量气体所破坏。
[质量控制]
粪产碱杆菌，碱性反应，培养基呈蓝色；变形杆菌，没有变化，培养基仍呈紫色；产气荚膜梭菌，急骤发酵，酸凝块被气体破坏。
注：培养基在灭菌前加入凡士林，可观察厌氧菌对牛乳中乳糖分解情况。若全脂牛奶需行脱脂处理，该培养基pH 6.8，呈紫色。
[用法]
将被检菌接种于上述培养基中， 若为芽胞梭菌，要在培养基内加入微量铁末，于35℃培养8～24h，必要时可延长至14天。
[观察结果]
产酸 因发酵乳糖而产酸，使指示剂变为粉红色。
产气 发酵乳糖同时产气，可冲开上面的凡士林。
凝固 因产酸太多而使牛乳中的酪蛋白凝固。
胨化 将凝固的酪蛋白继续水解
二、疱肉培养基
[用途]
主要用于梭菌属的培养。 [配方] 牛肉渣 0.5g，牛肉浸液7ml（pH 7.6）。
将干燥的肉渣0.5g装入
15mm×150mm试管内，再加入pH 7.6牛肉浸液7ml，两者高度比例为1︰
2。在试管液面上加一层3～4mm 厚度的融化凡士林。 用橡皮塞塞紧，经121℃ 灭菌15min后，置4℃冰箱备用。
[用法]
将各种采集的标本，在2h内取0.5ml种入培养基底层，立即置35～37℃厌氧恒温箱内进行培养，2～7天观察结果。若发现培养基有混浊、沉淀、粘性菌膜生长现象，及培养物的臭味、肉渣的消化、变色、产气等情况，用以判断结果，并进行涂片染色镜检及分离培养。一般在培养48h以
后开始观察，直至 3周，无细菌生长，即可报告阴性。
[质量控制]
破伤风杆菌或坏死梭杆菌48h的培养物稀释1 000倍，接种0.01ml，生长良好。
[保存]
置4℃冰箱内，数月有效。
注：培养基的管口要密封，使用时将培养基置于水浴中煮沸10min，以除去管内残存的氧。为提高培养效果，在底层可放少许铁粉作为还原剂。
第十一节 医院感染管理应用的试剂与培养基
（见第三章医院感染与监控）