生物化学实验报告
一、实验目的
1. 学习并掌握肝糖原提取和鉴定原理和方法；
2. 学习并掌握蒽酮比色测定糖原含量的原理、注意事项和操作方法； 3. 学习并掌握刻度吸管和微量加样枪的使用方式； 4. 正确掌握使用离心机的方法步骤； 5. 正确掌握使用分光光度计的方法步骤。
二、实验原理
1. 肝糖原的提取与鉴定
糖原是生物的主要储能物质之一，主要储存与肝细胞中，采用研磨匀浆等方法可以使肝细胞破碎。肝细胞破碎，细胞内容物流出。低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶并且使蛋白质沉淀，糖原则能够稳定地保存在上清液中，从而达到分离糖原与蛋白质等其他成分的目的。糖原不溶于乙醇但可溶于热水，故可以先用95%乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。此外，糖原还可以被酸水解成葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可以判定肝组织中糖原的存在。糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min 后会出现砖红色沉淀。
2. 肝糖原的定量测定
糖原在浓碱溶液中非常稳定，故可将肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，保留肝糖原。糖原可以被浓酸水解成葡萄糖，而浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成5-羟甲基呋喃甲醛，该化合物与蒽酮脱水缩合可以生成蓝色的化合物。该物质在620nm 处有最大吸收。糖含量在10-100μg ，溶液颜色的深浅与可溶性糖的含量成正比。利用该反应原理处理标准葡萄糖溶液，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。
三、材料与方法： 1. 实验材料
（1）肝糖原的提取与鉴定
样品：1.50g 的鸡肝
试剂：5%CCl3COOH 、95%乙醇、蒸馏水、浓HCl 溶液、50%NaOH溶液、碘试剂和班氏试剂 仪器和器材：离心机、试管、玻璃棒、室温至100℃恒温水浴箱、剪刀、镊子、刻度吸管、微量加样枪和白瓷反应板
（2）肝糖原的定量测定
样品：0.15g 的鸡肝
试剂：30%KOH溶液、蒸馏水、标准葡萄糖溶液和0.2%蒽酮溶液
仪器和器材：室温至100℃恒温水浴箱、比色皿、分光光度计、试管、剪刀、镊子、刻度吸管和微量加样枪
2. 实验流程
（1）肝糖原的提取与鉴定
（2）肝糖原的定量测定
取3支试管，按下表操作：
试剂（ml ） 蒸馏水 标准葡萄糖溶液 糖原提取液 0.2%蒽酮溶液
空白管 1.0 -- -- 2.5
标准管 -- 1.0 -- 2.5
样品管 -- -- 1.0 2.5
混匀后，沸水浴10min ，冷却。在分光光度计620 nm波长处，用空白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A ）。
四、结果与讨论：
1. 实验结果
（1）肝糖原的提取与鉴定
所获糖原溶液如下图：
经与蒸馏水比较，所获糖原溶液呈乳样光泽。
经加碘试剂呈色反应，结果如下图：
经检验，糖原溶液与碘试剂混合后呈红棕色，故结论是：鸡肝样品中含有糖原。 经班氏试剂与糖原溶液混匀后沸水浴2min ，结果如下图：
经检验，糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min 后出现砖红色沉淀。故结论是：鸡肝样品中含有糖原，糖原水解后产生葡萄糖。
（2）肝糖原的定量检测
空白管、样品管和标准管比色如下：
测定次数
1 2 3 各管平均值A 620
空白管 0 0 0 0
样品
标准液 0.793 0.794 0.794 0.794
/A
标准
样品液 0.190 0.192 0.191 0.191
根据公式：肝糖原（g/100g肝组织）=A1.11
0.05×100/肝组织重(g)×100/1000×
得本组实验：肝糖原=0.89g/100g肝组织
故本次实验结论为：该鸡肝样品含有肝组织，且肝糖原含量为0.89g/100g肝组织。
2. 结果分析
经查阅资料得：饱食鸡肝的肝糖原含量为：2～3g/100g肝组织
而本组实验测得肝糖原=0.89g/100g肝组织，即本次实验测得的肝糖原含量偏低。
3. 讨论总结
经查阅资料和与搭档讨论得以下注意事项：
（1）试剂中有强酸、强碱，如蒽酮试剂是用浓硫酸配制的，具有强腐蚀性，故操作中要注意安全；
（2）0.2%蒽酮溶液和30%KOH 1.5ml 应用刻度吸管移取，可减少实验误差，比起使用微量加样枪操作也更安全，避免损毁微量加样枪；
（3）比色皿盛装溶液体积不得超过比色皿2/3，防止溶液溢出，腐蚀比色杯架； （4）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则将影响比色； （5）使用离心机前一定要配平，否则会损坏离心机；
（6）糖原水解溶液与班氏试剂混匀沸水浴加热2min 后若出现黑色浑浊，则是因为班氏试剂过量所致；
（7）蒽酮试剂必须2倍于被测液； （8）沸水浴时，注意打开方式，避免烫伤；
（9）糖原提取并转移到100ml 容量瓶中进行样品糖原溶液配制时必须注意仔细定容，以免导致稀释倍数过大，导致实验误差；
（10）肝糖原提取时，向上清液中加入等量的95%乙醇后，务必混合均匀。由于上清液为水溶液，比重＞95%乙醇，溶液分为两层。加之上清液容积较大，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀；
（11）实验材料应选取饱食鸡肝，否则所测肝糖原含量会偏低。