免疫荧光（Immunofluorescence, IF）原理
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
紫外光激发荧光物质放射荧光示意图
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：
（1） 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；
对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2） 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。
（3） 通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应
充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。
（4） 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
（5） 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
（6） 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7） 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
（一）细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（二）固定和通透
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三：
①防止细胞从玻片上脱落；
②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；
③使标本易于保存。
标本的固定原则是：
①不能损伤细胞内的抗原；
②不能凝集蛋白质；
③应保持细胞和亚细胞结构；
④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。
最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。通常，细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。常用的通透剂是去垢剂，如Triton ，NP-40，以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。Triton X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（三）封闭
封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5，其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。
（四）抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
（五）封片及荧光观察
标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片处理。常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。
（六）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染
免疫细胞(组织)化学实验中如何选择固定剂？
固定剂主要有两类：一类是有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等。它们通过强烈脱水变性蛋白，同时它们也能够溶解脂类物质，因此产生通透效应。另一类为交联剂，如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等，它们导致细胞内分子相互连接成网状结构，从而维持在原位上。这两类固定剂各有优缺点，交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但交联可能会破坏一些细胞组分的抗原性。同时交联剂固定的细胞需要通透处理，才能让抗体穿越膜结构与胞内抗原结合。醇类固定的优势在于蛋白变性完全，对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原。醇类固定的细胞不需要再通透。
在免疫细胞(组织)化学实验中选择哪种固定方法，先要考虑所检测抗原在细胞中的定位，通常膜组分的蛋白需要用多聚甲醛固定。其他蛋白往往凭经验选择固定剂，可以试用两种方法，然后选择较好的一种。
免疫荧光，免疫细胞化学和免疫组织化学实验如何设置对照？ 设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问，同时对照的设立也有助于判断实验中出现的问题。
（1）阴性对照 阴性对照可以了解背景荧光和非特异性染色，当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。较理想的阴性对照检测遗传背景相同但仅仅不表达所研究抗原的细胞，例如把某个蛋白已敲除的细胞或动物组织样品。但这样的标本不一定存在或很难找到，常见的阴性对照也可以是针对一抗的PBS对照或来自同一种属动物的血清对照。
（2）阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，这种阳性对照可验证Protocol，排除实验过程中出现的差错。另一种阳性对照可以是在细胞内过表达所研究的抗原。同时也可以在这个抗原上接上商业化的表达标签，如Flag, Myc, His tag等。 什么是免疫荧光双标记，怎么进行荧光双标实验？ 免疫荧光双标记（Double Immunofluorescence）是用两种不同荧光染料标记的抗体同时检测两种抗原。标记这两种抗体的荧光素具有不同的颜色（激发和发射波长不同），通过荧光显微镜可以在同一细胞上分别观察到两种抗原，并可通过图像处理软件将它们同时呈现在一张图片上。
由于在同一个样本使用两种染料，为此就要求每一种检测试剂仅能识别一种抗原。主要有两种方法能够达到这一目的。最确定的方法就是直接标记一抗，如其中一种标记FITC，另一种标记Texas红，一般会有满意的结果。第二种方法是应用两套种属特异性的检测试剂。在进行这类进行荧光双标前，最好先验证单标对特定组织或细胞是有效的。在操作上与单标方法并无不同，但两种一抗必须来源于不同种属的动物，且两种二抗不能存在交叉反应。
应该选择什么样的抗体进行免疫荧光及免疫细胞（组织）化学实验？
如果使用商业化的抗体，在使用之前要仔细阅读公司关于抗体的说明，该抗体是否能用来做免疫荧光或免疫细胞（组织）化学实验。对于自己生产的抗体，在生产抗体时选用的免疫原对获得高质量的试验结果非常重要。
其次，就是单抗和多抗的选择问题。这方面基本上遵循着通用的原则，多抗的优点是来源动物种属多，亲和力高，反应性广，可以识别抗原的多种亚型，缺点是特异性相对较差，有时容易带来假阳性结果，且抗体质量存在批次差异；单抗的最大优点是特异性好，质量稳定，但缺点是动物来源受限（绝大多数是小鼠），灵敏度较低，而且价格较高。单抗对固定的容忍度不如多抗，因为它们识别的位点比较单一，更容易受到破坏。 免疫荧光实验中用于标记抗体的荧光素有哪些，在选择上有什么考虑？ 以下列举几种常用的荧光素，更多的荧光素可以从相关网站上找到： 1. FITC（Fluorescein） Excitation 495nm，Emission 525nm，黄绿色荧光；
2. Rhodamine (TRITC) Excitation 552nm，Emission 570nm，橙红色荧光；
3. R-Phycoerythrin (PE) Excitation 488nm，Emission 578nm，橙红色荧光；
4. Texas Red Excitation 596nm，Emission 620nm，红色荧光。
选择荧光素主要考虑以下几点： ①高消光系数（extinction coefficient）和光子产量（Quantum yield），这意味着光捕获能力强和效率高；
②光稳定性较好；
③与常见光源和滤光器匹配性较好；
④不干扰抗体反映；
⑤水溶性以及pH稳定性。此外，还需要考虑到是否有毒性以及荧光素的颜色是否与背景颜色反差大对比鲜明等。
免疫酶标细胞(组织)化学中有哪些显色液，它们的各自特性是什么？ 免疫酶标细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：
1．DAB（Diaminobenzidine；3，3-二氨基苯联胺）显色液
DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明，半永久保存，且其终产物具嗜饿性，既可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，适于电镜下确定抗原存在的部位。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，应尽量减少吸入和接触次数，最好将DAB制成10倍贮存液，分装于-20℃保存，应用时稀释、过滤。操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
2．CN（4-Cl-1-Naphthol，4-氯-1-萘酚）显色液
4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。与DAB比较，CN敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。
3．AEC（3-amino-9-ethyl-carbozole, 3-氨基-9-乙基卡唑）显色液
该显色液作用后，阳性部分呈深红色，加以苏木精或亮绿等作为背景染色，则效果更佳。由于终产物溶于酒精和水，故需用甘油封固。AEC染色后的颜色比DAB好看，但是灵敏度比DAB低，而且保存时间短，易褪色。 4．TMB显色液
TMB即四甲基联苯胺（Tetrabenzidine）是一种脂溶性较强的基团，因此容易进入细胞与细胞器中的HRP反应，且由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物，这使得TMB成为组化实验中的一种很好的发色团。同时反应产物的沉淀，使得HRP的活性部位更加暴露，利于酶氧化反应进行。TMB的反应产物为深蓝色，利于光镜观察，且反应产物越聚越大，常超出单个细胞器的范围（而DAB则被限制在其内），故TMB反应的检测阈较低。由于上述优点，目前TMB常用于光镜及超微结构水平的HRP及HRP-WGA神经投射的研究。需要注意的是：TMB显色液中的A液和B液应在2h内新鲜配制。另外，TMB是一种较强的皮肤刺激剂，并有致癌的潜在可能，故使用时应带手套及在通风条件下操作。
5．BCIP/NBT显色液
是碱性磷酸酶的显色底物。BCIP即5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate）。NBT即四唑氮蓝
（Nitro-Blue-Tetrazolium）,MW=818,为深蓝色无定形微溶物质。当二者存在时，在碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）作用下，NBT被还原形成显微镜下可见的蓝色或紫色沉淀。
有没有办法增强IF/ICC/IHC中的特异性染色，减少非特异性染色？
为了获得高质量的结果，在免疫染色中应特别注意增强特异性染色，减少或消除非特异性染色。在各种免疫染色中都必须注意以下几个问题：
1．增强特异性染色的方法
（1）蛋白酶消化法：其作用是暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色和避免非特异性染色。
这种方法已广泛用于各种免疫细胞化学染色，常用的蛋白酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶以及链霉蛋白酶（pronase）等，也可用3mol/L尿素处理切片，达到酶消化的目的。酶消化的时间和温度因各种抗原对消化的敏感性不同，应根据酶的活性通过预试验确定，消化的时间还与组织固定的时间有关，一般是陈旧固定组织所需时间长，以37℃为宜，消化时间短的组织可在室温中进行。消化处理时间过长能损伤组织，易使切片脱落，应使用切片粘附剂，消化时间尽量缩短。
（2）合适的抗体稀释度：抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子远远多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴
性结果。此阴性结果并不一定缺少抗原，而是由于抗体过量。这种现象类似于凝集反应中的前带效应（Prozone effect）。因此，必须使用一系列稀释或作“棋盘式效价滴定”检测抗体的合适稀释度，以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色。抗体稀释度应根据：
①抗体效价，溶液中特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；
②一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间越长；
③抗体中非特异性蛋白含量，只有高稀释度时才能防止非特异性背景染色； ④稀释用缓冲液的种类、标本的固定和处理过程等也可影响稀释度。所以合适的稀释度应根据自己的情况测定。抗体的稀释主要是指第一抗体，因为第一抗体中特异性抗体合适的尝试是关键，应用高稀释度第一抗体仅显示主亲和力的特异性染色反应，可减少或消除
其中交叉抗体反应。 （3）温育时间：大部分抗体温育时间为30-60min，必要时可4℃过夜（约18h）。温育的温度常用37℃，也可在室温中进行，对抗原抗体
反应强的以室温为佳。37℃可增强抗原抗体反应，适用于多数抗体染色，但应注意在湿盒中进行，防止切片干燥而导致失败。
（4）多层染色法：对弱的抗原可用间接法（双层）、PAP和ABC法（三层）、四或五层PAP法或ABC法，或PAP和ABC联合染色法等，
可以很大程度的提高敏感性，获得良好结果。
（5）显色增敏剂的应用，如在过氧化物酶底物中加入氯化镍，可提高显色敏感度4倍。
2．减少或消除非特异性染色的方法
组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清（1：5-1：20）封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%-5%牛血清白蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为10-20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清（非免疫的）。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。免疫荧光染色时，可用0.01%伊文氏兰（PBS溶液）稀释荧光抗体，对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入0.85%~1%NaCl成为高盐溶液，充分洗涤切片，能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。
如何判断免疫细胞（组织）化学实验的结果？
对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验。染色结果呈阴性并非都是抗原不表达，要考虑是否与组织中的抗原受到破坏有关；对新发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复实验，要求用几种方法进行验证，如用PAP法阳性，可再用ABC法验证。
必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色。非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。
阳性细胞具有如下的染色特征：（1）阳性结果应定位在细胞中相应的部位，比如在细胞膜表达的抗原阳性结果应定位在细胞膜上，在其他部位的阳性反应均为非特异性染色。不当的抗原修复会导致抗原在组织细胞中定位的改变。根据所检测抗原的不同，抗原分别定位在：①细胞
膜，如LCA和UCHL1等；②细胞质，如Keratin和Lysozyme等；③细胞核，如PCNA和ER等。大部分抗原定位于细胞质（胞浆），可见于整个胞浆或部分胞浆。（2）阳性细胞分布可分为烟性和弥漫性。（3）由于细胞内含抗原量的不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。（4）阳性细胞染色定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。（5）切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，但绝大多数是非特异性染色，不能用于判断阳性。
Troubleshooting the IF, ICC/ IHC 免疫荧光
问题 可能的原因
目标蛋白在细胞中没有表达 解决方法 制备细胞裂解液，用Western Blotting验证目标蛋白在细胞中有表达
标本中使用更多的细胞，试用其他瞬时转染方法，或者使用稳定转染
表达目标蛋白的细胞过少
细胞系
细胞通透性差 增加通透剂作用的时间或者浓度，或改用其他的通透剂
信号弱或无信号，染色细胞
过少 染色前的固定步骤破坏了抗原表位 改用其他固定方法 通透使抗原丢失 减少通透剂作用的时间或强度
抗体不识别 换用其他抗体
同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释
一抗稀释度过大
比例
二抗选择错误
一抗质量不高 使用正确的二抗 使用特异性高，效价高的一抗
同一样品按最佳的二抗用量作一抗稀释曲线，以确定最佳的一抗稀释
一抗浓度太高
比例
同一样品按最佳的一抗用量作二抗稀释曲线，以确定最佳的二抗稀释
背景过高 二抗浓度太高
比例
封闭不完全 使用二抗来源动物的非免疫血清进行封闭；改善封闭条件
封闭液BSA中含IgG 使用高纯度（IgG free）的BSA
洗涤不充分
细胞片被风干
细胞呈扁平状或像撞击坑
使用了甲醇固定 充分洗涤 在任何时候都不要让细胞片干燥；使用湿盒 甲醇可破坏细胞膜，因此不能很好保持细胞形态。改用甲醛或戊二醛
等其他固定剂
使用了戊二醛固定
细胞有自发荧光
材料本身（如石蜡）有自发荧光
因洗涤不充分导致背景太亮
细胞模糊，封片剂明亮
二抗结合太弱
二抗浓度过高
整个细胞片都出现荧光亮点
二抗发生沉淀 在固定后荧光染色前进行荧光淬灭，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前检查自发荧光 充分洗涤 确保抗体牢固结合，确保固定良好 降低二抗浓度 过滤或离心荧光标记二抗
免疫细胞（组织）化学
问题
染色弱或者没有染
色 可能原因 组织不表达待测抗原或者表达水平太低 切片时选错蜡块和选错切片 参照阳性对照片确定为真阴性结果 用HE染色验证 解决方法
漏加试剂或者试剂使用顺序错误 重复实验，确保每一步均正确
试剂孵育时间不充分 确保试剂孵育了足够的时间
抗体不正确，或检测系统和一抗不匹配 选择正确的一抗和匹配的二抗
底物和酶不匹配 选用匹配的底物
抗体浓度太低 通过抗体稀释曲线决定最佳浓度
将一滴标记有酶的抗体加入到制备好的底物溶液中，如果底物发生预期的颜色变
色原/底物溶液失效
化，则可排除底物的因素。否则需更换新的酶标抗体或底物
抗体储存不当，导致失效 根据抗体说明书进行适当的保存
一抗失效（过了有效期） 换用新的一抗
二抗失效 换用新的抗体（能否成功与其它一抗配合？）
冲洗液和反应试剂不匹配 检查溶液的pH值很重要，与过氧化物酶底物匹配的溶液中不应含有叠氮钠。 脱石腊不充分 延长脱腊时间或者换用新的二甲苯
组织固定不充分或者不当（如温度过高） 增加固定时间或者改用不同的固定方法
组织固定过度 减少固定时间或4℃固定。若已固定过度，则需使用正确的或者推荐的抗原修复
方法
抗原修复方式不当 采用合适的抗原修复方式
洗液中加入0.05%Triton-100，有助于抗体渗透入细胞内，也可降解内源性Fc
细胞内抗原未使用穿孔剂
受体
选择正确的试剂（荧光素染色封片要选用水溶性封片剂，藻胆素蛋白染剂不能用
复染剂、脱水、透明和封片剂和所使用的色原不匹
含甘油的封片剂。AEC, AP Red/Fast Red, INF 和其它水溶性染料不能用二甲苯
配
有机溶剂透明）
清洗不充分 选择适当的清洗液，严格按操作步骤进行
在加入一抗之前使用新鲜配制的3%的H2O2-甲醇封闭内源性HRP活性，使用左
组织含有内源性的酶，如HRP/AP
旋咪唑（levamisole） 溶液阻断内源性AP活性。或者换用葡萄糖氧化酶系统
在加入一抗之前，血清封闭之后使用avidin/biotin阻断试剂。或者避免使用
组织含有内源性生物素（尤其肾脏、肝和脾）
biotin-avidin系统或改用IF方法
染色背景高 一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高 增加一抗的稀释度 ，或选用特异性更好，纯度和效价更高的抗体
使用与二抗动物的正常血清（一般是3-10%）封闭，必要时可以将血清浓度加大；
二抗和组织非特异性结合
或者用其它无关蛋白，如牛血清白蛋白或5%脱脂奶粉替代血清进行抗原封闭
组织抗原弥散 染色结构不清，主要见于冰冻切片固定不及时造成。切片后应立即固定 使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织 在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂
切片干透
一抗或者二抗浓度过高
孵育时间过长 保持在高湿环境中，避免干透 降低抗体浓度，通过抗体稀释曲线确定最佳浓度 减少孵育时间
染色过度 孵育温度太高 降低孵育温度，在4℃过夜或者37℃0.5-1小时或者室温
底物孵育时间过长 减少孵育时间
干片 染色过程中避免出现干片现象