作者：中国医师协会儿科医师分会风湿免疫专业委员会、中国医师协会儿科医师分会过敏专业委员会、中华医学会儿科分会免疫学组
选自：中华检验医学杂志, 2016,39(05): 344-349
使用流式细胞术(flow cytometry，FCM)进行淋巴细胞亚群分析已广泛应用于临床，在免疫功能评估上起到不可或缺的作用。由于FCM淋巴细胞亚群分析涉及多个参数，且各参数间关系复杂，如何有效解读、判断分析结果，并指导临床疾病诊断、治疗，目前还缺乏统一的指导原则。为了科学、合理地将FCM淋巴细胞亚群分析应用于临床疾病的诊断、疗效监测、预后评估等环节，中国医师协会儿科医师分会风湿免疫专委会、中国医师协会儿科医师分会过敏专委会及中华医学会儿科分会免疫学组共同制定FCM分析淋巴细胞亚群临床应用建议。
一、淋巴细胞亚群分析常规检测项目和报告内容
FCM是一种对单细胞或生物颗粒进行多参数、定量分析的技术，具有速度快、精度高、准确性好等优点。目前FCM广泛应用于基础医学与临床学科，在疾病的诊断、分型、治疗、预后及预防起到重要作用，其中淋巴细胞亚群分析是临床开展最多的检测项目。FCM淋巴细胞亚群分析指借助各种荧光染料标记的单克隆抗体测定各类淋巴细胞胞膜或胞内独特的分化抗原(cluster of differentiation，CD)，对淋巴细胞的各个亚群进行分析。
常规检测的淋巴细胞亚群包括T细胞(CD3＋)、B细胞(CD3-CD19＋)和NK细胞(CD3-CD16＋CD56＋)；T细胞又分为两个亚群：辅助性T细胞(CD3＋CD4＋)和杀伤性T细胞(CD3＋CD8＋)。FCM淋巴细胞亚群分析报告提供各个细胞亚群细胞的相对计数(百分比)和绝对计数。
卫生部发布的FCM检测外周血淋巴细胞亚群指南(WS/T 360-2011)[1]对于规范FCM在外周血淋巴细胞亚群分析具有重要指导意义。检测过程需注意标本采集和运输、免疫荧光染色、FCM检测和分析、结果报告和审核等方面。
FCM可以直接测得各淋巴细胞亚群的相对计数。采用定量微球，用流式细胞仪单平台方法可以直接获得淋巴细胞亚群绝对计数。如果不用定量微球，可以采用FCM测定的淋巴细胞百分比，结合全血细胞分析仪测定的白细胞数量计算得到淋巴细胞的绝对计数。建议采用单平台方法进行绝对计数检测，它减轻了室间变异并避免了多台仪器间的系统误差。
二、标本采集和运输
FCM检测淋巴细胞亚群采用外周血标本。首选乙二胺四乙酸盐(EDTA-K2/EDTA-K3)抗凝管采集淋巴细胞亚群标本，肝素钠或柠檬酸钠抗凝血也可用于检测，但如标本同时进行白细胞计数分类，则应选择EDTA作为抗凝剂。
连续检测的同一患者应固定标本采集时间，标本采集后可立即检测，不能立即检测的标本应置室温保存[2]，并在24 h内检测。
三、检测对象选择
原则上免疫功能受损者均应常规评估淋巴细胞亚群。
(一)免疫防御功能受损者
易发生感染，这种感染的特点是反复、严重、多种病原体或特殊病原体的感染，以及常规治疗效果不佳的感染。
1．反复感染：感染次数和频率过高，超出正常人群，因感染的部位不同，具体反复的次数或频率难以给出参考标准[3]。
2．严重感染：严重感染包括必须进行住院静脉使用抗感染药物的患者，以及需进行重症监护和抢救的感染患者[4]。
3．多种病原体与特殊病原体感染：包括细菌、真菌和(或)病毒等多种病原体感染者；低毒病原如卡介苗、脊髓灰质炎疫苗株等的感染，对于新发现的病原体种类或病原体不清楚的感染病例尤其应该进行淋巴细胞亚群的检测[5]，有助于对疾病状况的评估。
4．常规治疗效果不佳的感染：明确病原体种类，按照常规或指南治疗，除了耐药等原因之外还可能存在宿主免疫防御的受损，应考虑及时进行淋巴细胞亚群的检测。
5．除了宿主免疫防御受损容易造成上述少见感染状况之外，感染本身也可造成继发性免疫防御受损，因此免疫评估应注意原发和继发性两方面的问题。
(二)免疫自稳和耐受功能受损者
此类患儿易发生自身免疫或自身免疫样疾病及过敏或过敏样的疾病表现。
1．过敏性疾病：
过敏性疾病是常见多发疾病，并非所有这类患者都需要进行淋巴细胞亚群的检测。对于一些严重的过敏患者应考虑淋巴细胞亚群的检测。
(1)婴幼儿时期全身严重湿疹样表现[6]。
(2)嗜酸性粒细胞显著增多[7]。
(3)血清IgE水平明显增高(IgE>1 000 IU/L)[8]。
(4)伴有反复、严重感染的患者。
2.自身免疫和自身炎症性疾病：
自身免疫性疾病患儿检测淋巴细胞亚群有助于对疾病的免疫状况及药物治疗影响的评估，以初步了解淋巴细胞各个亚群可能存在的原发性或继发性异常。
(1)存在难以控制的自身免疫反应情况及出现明显的自身免疫性淋巴增殖情况[9,10]。
(2)合并反复感染的患者。
(3)存在自身炎症反应。
(4)长期免疫抑制药物、生物制剂使用前后[11]。
(三)免疫监视功能受损者
免疫监视功能受损，主要引起机体发生肿瘤性改变。
1．血液系统肿瘤：
儿童时期最为多见的是血液系统肿瘤[12]，这种情况应常规进行淋巴细胞亚群的评估。
2．其他肿瘤及实体瘤：
其他系统肿瘤患者也应酌情进行淋巴细胞亚群的检测，既可能存在原发性淋巴细胞亚群的异常，也可能出现继发性改变，尤其是进行各种化疗时，淋巴细胞亚群大多会受到影响[13]。
(四)其他特殊情况
1．血常规中淋巴细胞明显异常[14]。
2．家族成员中有免疫缺陷病史。
3．长期使用免疫抑制剂者。
四、结果判读
淋巴细胞亚群分析结果判读，应对淋巴细胞亚群的相对计数和绝对计数分别进行判别。
(一)基本数据判断
1．相对计数的3个基本公式：
FCM检测淋巴细胞亚群结果应首先根据下述3个公式进行评估[15]。
公式1: CD3＋%＋CD19＋%＋CD16＋/CD56＋%＝100%±5%
公式2：CD4＋%＋CD8＋%＝CD3＋%±5%
公式3：CD4＋/CD8＋比值>1.0(1.5～2.0，新生儿期可达4.0)
2．相对计数基本公式意义：
(1) CD3＋%＋CD19＋%＋CD16＋/CD56＋%明显大于或小于100%±5%，提示检测系统异常或存在明显淋巴细胞亚群异常。(2) CD4＋%＋CD8＋%之和明显大于或小于CD3＋%±5%，提示存在双阳性(CD4＋CD8＋)或双阴性(CD4-CD8-)T淋巴细胞。(3)一般情况CD4＋/CD8＋比值>1，年龄越小CD4＋/CD8＋比值越大。CD4＋/CD8＋比值
3.绝对计数的判断：
绝对数标准不同仪器和年龄段及人群存在差别。个体间变化也比较大。各个实验室所采用的标准有所不同。应根据实验室的参考范围进行评估。
(二)如何判断淋巴细胞亚群中哪种或几种细胞发生了变化
在淋巴细胞亚群结果判别中既要注意绝对计数的判别，也要判别相对计数也就是百分比的变化。淋巴细胞亚群发生变化可以是一种也可以是几种同时发生变化。
根据基本公式1和2，一种淋巴细胞亚群绝对数的变化在检测结果中不会影响到其他亚群绝对数变化，但可能引起自身相对计数和其他淋巴细胞亚群相对计数的变化。应注意判别。
1.一种淋巴细胞亚群变化：
(1)根据绝对计数判断：
依据绝对计数参考值范围进行判断，若一种淋巴细胞亚群明显高于参考值上限或低于参考值下限，其他亚群绝对计数基本正常，则可明确此群细胞存在异常。
(2)根据相对计数(百分比)进行判断：
若没有绝对计数报告，可根据相对百分比进行判断。
二一判别法[15]：用于判别T、B、NK三群淋巴细胞亚群中哪一种是引起相对计数改变的原因。根据百分比，在三种淋巴细胞中，找出二种变化趋势一致的，另一种则是异常的根源。
一二判别法[15]：用于判别T细胞两个亚群中哪一种是引起相对计数变化的原因。
以CD3＋T细胞百分比变化为基准，两种T细胞亚群CD4＋和CD8＋哪种百分比变化趋势与CD3＋T细胞一致，这种T细胞亚群则是异常的根源。
可通过相同样本血常规淋巴细胞计数换算出淋巴细胞亚群的绝对计数进行验证。
2．两种或以上淋巴细胞亚群变化：
此类情况不适合使用上述'二一判别法'和'一二判别法' 。
两种或以上的淋巴细胞亚群发生变化，需要仔细甄别，这种情况也比较多见。一种情况是两种淋巴细胞亚群同时发生变化，如联合免疫缺陷病，T、B细胞都缺如；还有些是原发于一种淋巴细胞亚群的变化，其他淋巴细胞亚群因感染等因素，发生继发性改变。
3.数据判别流程：
详见图1。
图1 淋巴细胞亚群结果判别流程
五、淋巴细胞亚群变化的特点和临床价值
此部分内容很多情况使用'可能'、'也可能'等不确定词汇，说明外周血T、B、NK细胞绝对计数和相对百分比变化程度较大。这种变化一方面来自于儿童随年龄变化的特征，另一方面还受到许多环境、发育和疾病因素的综合影响。因此，评估淋巴细胞亚群的变化不应是孤立的，应同时结合临床与其他辅助检查结果，对临床价值做出判断。淋巴细胞亚群的变化也很少与临床疾病有一一对应的情况，这些变化与临床疾病往往是一对多或多对一的。在本部分内容中，'典型案例'是属于相对比较确定或常见的情况，其他可能出现的变化，临床实际中也可能并不出现。使用本手册时应将其作为重要的临床辅助手段对待。熟练的应用还需要结合临床疾病不断地训练和总结。
(一)单一淋巴细胞亚群变化
1.仅CD3＋T细胞增多：
CD3＋T%增高；根据基本公式1，CD19＋%和CD16＋/CD56＋%相对降低。例如：CD3＋T 5 000个/μl；其他淋巴细胞无变化；CD3＋T：90%；CD19＋：8%；CD16＋/CD56＋：1%。CD3＋T细胞增多又可分为如下：
(1) CD4＋细胞增多为主，CD4＋%增高；根据基本公式2，CD8＋%相对降低；CD4＋/CD8＋比值增高。例如：生理现象，生命早期CD4＋T细胞相对较多，比例较高；一些细菌感染可使CD4＋T细胞增多，比例增高；CD4＋/CD8＋比值也增高。锌制剂可能使CD4＋增多[16]。
(2) CD8＋细胞增多为主，CD8＋%增高；根据基本公式2，CD4＋%相对降低；CD4＋/CD8＋比值降低。例如：EBV感染引起的传染性单核细胞增多症[17]；其他许多病毒感染、真菌感染及肿瘤等也可出现此类变化。
(3) CD4＋和CD8＋T细胞均增多，CD4＋%，CD8＋%无改变；CD4＋/CD8＋比值正常。
2.仅CD3＋T细胞减少：
CD3＋T%降低；根据基本公式1，CD19＋%和CD16＋/CD56＋%相对增高。例如：CD3＋T 500个/μl；其他淋巴细胞无变化；CD3＋T：10%；CD19＋：80%；CD16＋/CD56＋：10%。可分为如下：
(1) CD4＋细胞减少为主，CD4＋%降低；根据基本公式2，CD8＋%相对增高；CD4＋/CD8＋比值降低。例如：HIV感染[18]；先天性CD4＋T细胞缺陷[19]，特发性CD4＋T细胞减少症[20]；因原发性或继发性淋巴管扩张腹泻可丢失CD4＋，CD4＋减少[21]。
(2) CD8＋细胞减少为主，CD8＋%降低；根据基本公式2，CD4＋%相对增高；CD4＋/CD8＋比值增高。例如：先天性CD8＋T细胞缺陷。
(3) CD4＋和CD8＋T细胞均减少，CD4＋%，CD8＋%无改变；CD4＋/CD8＋比值正常，也可因感染等因素改变。例如：先天性胸腺发育不良CD4＋T、CD8＋T细胞均减少[22]；细菌感染或一些病毒感染也可以造成暂时性CD4＋和CD8＋T细胞均减少；皮肌炎：CD4＋和CD8＋T细胞均减少[23]。
3.仅CD19＋B细胞增多：
CD19＋B%增高；根据基本公式1，CD3＋%和CD16＋/CD56＋%相对降低；CD4＋/CD8＋比值正常。
例如：CD19＋B 5 000个/μl；CD3＋T：45%；CD19＋：50%；CD16＋/CD56＋：5%。例如：一些淋巴瘤患者CD19＋B细胞增高明显；一些细菌、病毒感染等可以使CD19＋B细胞暂时性增多，比例增高，程度相对较轻。
4．仅CD19＋B细胞减少：
CD19＋B%降低；根据基本公式1，CD3＋%和CD16＋/CD56＋%相对增高；CD4＋/CD8＋比值正常。
例如：CD19＋B：50个/μl；CD3＋T：85%；CD19＋：1%；CD16＋/CD56＋：14%。例如：原发性B细胞缺陷者[24]；部分EBV感染者，使用利妥昔单抗治疗及部分白血病患者也可出现CD19＋B显著减少[25]。
5．仅CD16＋/CD56＋NK细胞增多：
CD16＋/CD56＋NK%增高；根据基本公式1，CD3＋%和CD19＋%相对降低；CD4＋/CD8＋比值正常。
例如：CD16＋/CD56＋NK细胞5 000个/μl；CD3＋T：40%；CD19＋：10%；CD16＋/CD56＋：50%。例如：NK细胞淋巴瘤或白血病；病毒感染，化学毒物或药物中毒也可能引起。
6.仅CD16＋/CD56＋NK细胞减少：
CD16＋/CD56＋NK%降低；根据基本公式1，CD19＋%和CD3＋T%相对增高；CD4＋/CD8＋比值正常。
例如：CD16＋/CD56＋NK细胞10个/μl；CD3＋T：80%；CD19＋：19%；CD16＋/CD56＋：1%。应注意，由于CD16＋/CD56＋NK细胞正常绝对计数较少，因此其减少对其他淋巴细胞亚群的相对计数影响常常并不明显。可见于先天性NK细胞缺陷，但十分罕见。
(二)两种淋巴细胞亚群变化
1. CD3＋T细胞和CD19＋B细胞增多：
CD3＋T细胞和CD19＋B%增高；根据基本公式1，CD16＋/CD56＋%相对降低。例如：CD3＋T细胞5 000个/μl；CD19＋B 3 000个/μl；CD3＋T：70%；CD19＋：29%；CD16＋/CD56＋：1%。注意：CD3＋T细胞增多也要参照上述'仅CD3＋T细胞增多'时判断CD4＋和(或)CD8＋增多的情况进行进一步判断。例如：部分EBV感染病例CD8＋反应性增高，CD19＋可因感染增高；化脓性细菌感染可使CD19＋B、CD4＋T细胞增多，因此CD3＋T细胞也增多；CD4＋/CD8＋比值增高。其他化学品(如苯[26])也可能引起类似改变。
2. CD3＋T细胞和CD19＋B细胞减少：
CD3＋T细胞和CD19＋B%降低；根据基本公式1，CD16＋/CD56＋%相对增高。例如：CD3＋T细胞100个/μl；CD19＋B 10个/μl；CD3＋T：10%；CD19＋：1%；CD16＋/CD56＋：89%。注意：CD3＋T细胞减少也要参照上述'仅CD3＋T细胞减少'时判断CD4＋和(或)CD8＋减少的情况进一步判断。例如：许多重症联合免疫缺陷病：CD3＋T和CD19＋B细胞明显减少甚至可为0[27]；一些严重感染或炎症可能使T、B细胞减少。身体耗竭(如重症感染等)时也会出现类似现象，但一般不会完全缺如[28,29]。
3. CD3＋T细胞和CD16＋/CD56＋NK细胞增多：
CD3＋T细胞和CD16＋/CD56＋NK细胞增高；根据基本公式1，CD19＋%相对降低。注意：CD3＋T细胞增多也要参照上述'仅CD3＋T细胞增多'时判断CD4＋和(或)CD8＋增多的情况进一步判断。例如：部分病毒感染可致CD8＋T细胞和CD16＋/CD56＋增多；一些肿瘤性疾病、自身免疫性疾病、一些病原体感染也可能出现类似情况。
4. CD3＋T细胞和CD16＋/CD56＋NK细胞减少：
CD3＋T%和CD16＋/CD56＋%降低；根据基本公式1，CD19＋B%相对增高。注意：CD3＋T减少也要参照上述'仅CD3＋T细胞减少'时判断CD4＋和(或)CD8＋减少的情况进一步判断。例如：部分重症联合免疫缺陷病CD3＋T细胞和CD16＋/CD56＋可明显低下[29]。
5. CD19＋B细胞和CD16＋/CD56＋NK细胞增多：
CD19＋B%和CD16＋/CD56＋ %增高；根据基本公式1，CD3＋T%相对降低少见，长期暴露于甲醛的工作者可能出现[30]；一些病毒感染，例如人乳头瘤病毒感染可能引起这种改变。
6. CD19＋B细胞和CD16＋/CD56＋NK细胞减少：
CD19＋B%和CD16＋/CD56＋NK%降低；根据基本公式1，CD3＋T%相对增高。临床这种情况罕见。
(三)3种淋巴细胞亚群变化
1. CD3＋T、CD19＋B和CD16＋/CD56＋NK细胞增多：
CD3＋T、CD19＋B%和CD16＋/CD56＋NK%可能都正常，CD4＋/CD8＋比值可增高、正常或降低。注意：这种情况若无绝对计数会造成误判。如仅有相对计数时，可根据流式细胞术检测时的血常规中淋巴细胞绝对计数判断淋巴细胞是否增多。一些感染性疾病可能引起一过性的类似的改变，例如感染所致的类白血病反应。
2．CD3＋T、CD19＋B和CD16＋/CD56＋NK细胞减少：
CD3＋T细胞、CD19＋B%和CD16＋/CD56＋NK%可能都正常，CD4＋/CD8＋比值可增高、正常或降低。注意：这种情况若无绝对计数会造成误判。如仅有相对计数时，可根据流式细胞术检测时的血常规中淋巴细胞绝对计数判断淋巴细胞是否减少。如：噬血细胞综合征三系下降，各个淋巴细胞亚群也可能都减少；一些化学品如：三氯乙烯可使T、B、NK细胞均减少[31]。
临床上除上述较为常见的淋巴细胞亚群变化特点外，还有其他更为复杂的变化情况，如也可存在一种细胞亚群绝对计数增多或减少，同时另两种减少或增多的情况。
声明：本共识旨在结合临床已有经验介绍FCM淋巴细胞亚群分析应用于临床疾病的诊断、疗效监测、预后评估等环节的方法。以指导临床应用和结果判读为主要目的，注重实用性和可操作性。而限于淋巴细胞亚群的影响因素众多，以及当前研究相对较少，组织临床、检验等领域专家制定本共识，不可避免带有专家经验。随着医学科学技术的发展，本共识将适时修订，以适应医学发展和临床应用的需要。
编写组成员：王晓川(复旦大学附属儿科医院临床免疫科)，吴凤岐(首都儿科研究所风湿免疫科)，赵晓东(重庆医科大学附属儿童医院免疫科)，刘哲伟(首都儿科研究所)，农光民(广西医科大学附属医院儿科)，刘钢(北京儿童医院感染科)，黄文彦(上海交通大学附属儿童医院肾脏风湿科)，孙金峤(复旦大学附属儿科医院临床免疫科)，盛晓阳(上海交通大学附属新华医院儿童保健科)，沈立松(上海交通大学附属新华医院检验科)，崔巍(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院检验科)，吴丽娟(成都军区总医院转化医学科)，娄加陶(上海交通大学附属胸科医院检验科)
执笔：王晓川(复旦大学附属儿科医院临床免疫科)，沈立松(上海交通大学附属新华医院检验科)
参考文献：略