安徽农学通报, Anhui Agri 1Sci 1Bull 12009, 15(5) 47
蛋白质工程的主要研究方法和进展
李 强 施碧红 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐
(福建师范大学生命科学学院, 福建福州 350108)
3
摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。
关键词:蛋白质工程; 定点诱变; 定向进化
中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 7731() Advances i n The Techn i ques i n i g
L i Q i a ng et a l (Fuzhou 350108, China )
Abstract:t o i m p r ove p r otein molecular 1I n this paper, several methods and their p rinci p les f molecular modificati on have been revie wed 1Key words:Pr engineering; site -directed mutagenesis; directed evoluti on
20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体, 对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化, 已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。
短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于本身独特的发光性质, 被应用到细胞生物学当中, 作为体内原位跟踪蛋白质的一个极其有效的工具。D iscos oma 红色荧光蛋白(D s Red ) 在荧光共振能量转移技术(fluorescence
res onance energy transfer ) 中可以和绿色荧光蛋白一起作
1 理性进化
理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知
DNA 序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达
到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth 通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR ⅤDNA 甲基化酶进行改造, 使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍
[1]
用, 作为研究两种蛋白质相互作用的有效工具, 但是野生型的D s Red 由于显色速率较慢, 而且稳定性较差, B r ooke
Bevis 建立随机突变文库, 在103-105个转化子中筛选到
。定点突变还主要应用于蛋
白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP ) 的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Cahoo 通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由Δ6-16:0-ACP 脱氢酶变成Δ9-18:0-ACP 脱氢酶
[2]
了大大提高显色效率的突变体, 使显色效率提高了10-15倍
[5-6]
。
易错PCR 是利用DNA 聚合酶不具有3’-5’校对功能的性质, 在PCR 扩增待进化酶基因的反应中, 使用低保真度的聚合酶, 改变四种d NTP 的比例, 加入锰离子并增加镁离子的浓度, 使DNA 聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突变, 并构建突变库。Moore 等对鼠伤寒沙门菌Sal m onella typhi m uriu m 产生的门冬氨酰二肽酶(as p 2
artyldi pep tidase ) 进行改良, 经两次易错PCR 引入随机突
。Van den Burg 利用蛋白同源建模和定点突变技术
结合的方法将从Bacillus stear other mophilus 分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100℃在变性剂存在的情况下还能发挥作用
[3]
, 但是大部分单个
[4]
氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小, 很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响蛋白质分子。
, 所
变, 并结合DNA 改组和正向选择筛选, 得到的pepEm 074突变株, 其酶活力比野生菌提高47倍
[7]
3
以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造。
DNA 改组(DNA shuffling ) 技术克服了随机突变的随
2 非理性进化
非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化, 在实验室中模拟自然进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短, 在
机性较大的限制, 能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起, 它的原理是使用DNase Ⅰ酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因, 这些小片段随机出现部分片段的重叠, 产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR, 通过随机的自身引导或在组装PCR 过程中重
作者简介:李强(1983-) , 男, 辽宁抚顺人, 硕士研究生, 研究方向:分子遗传育种。3通讯作者 收稿日期:2009-01-15
48安徽农学通报, Anhui Agri 1Sci 1Bull 12009, 15(5)
新组装成全长的基因, 由于存在不同的模板, 使得到的全长基因具有不同谱系之间的重组, 再进行最后一轮PCR, 加入全长引物, 扩增得到改造过的全长基因。利用DNA β-葡萄糖苷酶、改组已成功进化了编码β-内酰胺酶、脂肪酶、绿色荧光蛋白、烷基转移酶、苯甲基脂酶基因以及编码砷酸盐和阿特拉津降解酶的整个操纵子
[8]
法需要亲本基因具有极高的同源性, 而且每次重组只能进行两个亲本, 这也在一定程度上限制了它的应用。
通过同源重组或随机突变产生的蛋白突变体一定程度上都是依照模板蛋白进行的, 它们与模板蛋白的相似程度较大, 而非同源重组(Nonhomol ogous Reco mbinati on ) 能够产生完全不同于模板的新的蛋白质, 新的蛋白可能在自然界中并不存在, 为研究进化蛋白提供了潜在的可能性, 很多种方法可以进行非同源重组, 如杂交酶递增切断技术
(I ncre mental truncati on f or the on of hybrid enzy mes, I )
[15]
。
在DNA 改组技术的基础上又发展出外显子改组(ex 2
on shuffling ) 和家族改组(fa m ily shuffling ) 。外显子改组是
靠同一种分子间内含子的同源性带动, 而使DNA 改组不受任何限制, 发生在整个基因片段上, 更适用于真核生物, 并可获得各种大小的随机文库。交错延伸重组(staggered
extensi on p r ocess, StEP ) 是一种简化的DNA Ⅲ代替DNase ⅠI (I T L s ) , 对靶序列末端, 并通过降低切断温度、改变消化缓冲液浓度和加入酶抑制剂等方法改变外切酶在37℃消化过快的问题。最后将两种I T L s 混合后进行DNA 改组建立
SCRATCHY 库(shuffled I TCHY libraries ) 。这项技术降低
是在PCR 反应中, , 多轮变性、, 伸, 由于模板转换而实现不同模板间的重组, 如此重复直至获得全长基因片段
[9]
。RPR 法(Random -Pri m ing Re 2
了家族改组对同源性的要求, 使家族DNA 改组的概念和应用得到了进一步深化和延伸, 并在其他领域得到有效的运用。Gris wold 等将序列同源性仅5413%、且对底物的专
一性不同的人类和大白鼠θ类GST 酶进行家族改组, 利用
I TCHY 技术对两者的同源编码基因进行融合重组, 获得的
combinati on DNA Shuffling ) 是以单链DNA 为模板, 配合一
套随机序列引物, 先产生大量互补于模板不同位点的短
DNA 片段, 由于碱基的错配和错误引发, 这些短DNA 片
段中也会有少量的点突变, 在随后的PCR 反应中, 它们互为引物进行合成, 伴随组合, 再组装成完整的基因长度
[10]
重组表达蛋白SCR23活性是人类θ类GST 酶的300倍, 同时突变体酶还获得了催化谷胱甘肽和利尿酸结合的合成酶活性
[16]
。过渡模板随机嵌合(random chi m eragenesis on tran 2
sient te mp lates, ACH I TT ) 技术是改进的基因改组技术, 不
。
包括热循环、链转移或交错延伸反应, 而是将随机切割的基因片段杂交到一个临时DNA 模板上进行排序、修剪、空隙填补和连接, 其中的悬垂切割步骤可使短片段得以重组, 提高重组的频率和密度
[11]
3 展望
蛋白质工程作为分子生物学水平上对蛋白质结构和功能进行改造的手段已经受到越来越多的研究人员的关注, 并且其应用广泛, 目前已经在蛋白质药物、工业酶制剂、农业生物技术、生物代谢途径等等研究领域取得了很大进步。在分子生物学手段日益发展的今天, 新的蛋白质工程手段逐渐面世, 对于蛋白质分子改造起到了极其重要的作用, 通过这种手段提高蛋白质的特性如热稳定性、耐酸性、耐碱性等仍然是目前的重要研究方向。
参考文献
[1]Roth,M 1and A 1Jeltsch, Changing the target base s pecificity of the
EcoRV DNA methyltransferase by rati onal de novo p r otein -design 12001:3137-3144
[2]Cahoon, E 1B 1, et al 1, Redesign of s oluble fatty acid desaturases
fr om p lants for altered substrate s pecificity and double bond positi on 11997:4872-4877
[3]Vanden Burg, B 1, et al 1, Engineering an enzy me t o resist boiling 1
1998:2056-2060
[4]Hermes, J 1D 1, S 1C 1B lackl ow, and J 1R 1Knowles, Searching se 2
quence s pace by definably random mutagenesis:i m p r oving the cata 2lytic potency of an enzy me 11990:696-700
[5]Bevis,B 1J 1and B 1S 1Glick, Rap idlymaturing variants of the D isco 2
s oma red fluorescent p r otein (D s Red ) 1Nat B i otech, 2002120(1) :83-87
[6]Ca mpbell, R 1E 1, et al 1, A monomeric red fluorescent p r otein 1
2002:7877-7882
。
发酵过程常常由于微生物对温度、pH 、溶液的影响而导致产量低, 微生物的自身调控系统十分复杂和精细, 致使单个基因的突变很难对其产生某种产物的能力造成影响, 因此, 对微生物的进化要在整个基因组的水平上进行才能起到有效的作用, 于是出现了一种叫全基因组改组
(W hole -Genome Shuffling ) 的技术, 它结合了DNA shuff 2ling 和传统的育种技术的优点, 传统的育种技术耗时较
长, 经常由于亲本的相容性不好而影响育种效果, 而且实验过程完全可以用随机突变和筛选文库来完成, Zhang 等从能产泰乐菌素的Strep t omyces fradiae 的改造过程中证明了这种方法可以快速改善泰乐菌素的产量
[12]
, Ranjan Pat 2
naik 比较了传统育种方法和基因组改组技术之后, 发现乳
酸菌Lact obacillus 能在pH410的条件下产出比野生菌株多三倍的乳酸, 而传统育种方法明显没有基因组改组取得的效果好
[13]
。
体外异源杂交和体内修复, 这种方法首先在体外进行异源杂交DNA 双链, 转化细菌, 在胞内完成修复, 同时产生出一种新的以亲本DNA 为模板的杂交DNA 文库, 这是对DNA Shuffling 等已存在的基因重组方法的补充, 特别适用于大片段DNA 和整个操作子的重组
[14]
, 但是这种方(下转51页)
安徽农学通报, Anhui Agri 1Sci 1Bull 12009, 15(5)
use f or i m munizati on 1Methods, 2004, 32:21-24
[8]Cheng E N , Qut ob S, Pavliv M , et al 1HSP 27is better ass ociated
with the exp ressi on of inducible ther mot olerance in human pancreatic tumor cell lines than HSP 70, p53or p21/waf1/ci p11Ther m B i ol, 2002, 27(1) :47-54
[9]Carver J A 1, L indner R A 1, Lyon C, et al 1The interacti on of the mo 2
lecular chaperone α-crystallin with unf olding α-lactalbum in:a struc 2tural and kinetic s pectroscop ic study 1J 1Mol 1B i ol 12002, 318:815
Mol 1L ife 1Sci 12000, 57:899∃913
51
[20]Farns worth P, Ka malendra S 1Structure functi on relati onshi p a mong a
-crystallin related s mall heat shock p r oteins 1Experi m ental Eye Re 2search 12004, 79:787∃794
[21]Kle menz R, Frohli E, Steiger R H, et al 1αB -crystallin is a s mall
heat shock p rotein 1Pr oc Natl Acad Sci US A , 1991, 88:3652-3656[22]Martin H , A thanasi os I, Helen S, et al 1A Domain in the N -ter m i 2
nal Part of H s p26is Essential for Chaperone Functi on and O ligomeriza 2ti on 1J 1Mol 1B i ol 12004, 343, 445∃455
[23]Stromer T, Fischer E, R ichter K, et al 1Analysis of the regulati on of
the chaperone H s p26te -induced dissociati on:the N inal or assembly and the of p r J i 12004, 279, 11222∃[]S, L i B , Xia Q Y, et al 1Gene Encoding S mall Heat Shock
Pr oteins of the Silkwor m , Bombyx mori 1B i oci 1B i otechnol 1B i oche m , 2006, 70(10) :2443-2450
[25]Koteiche H A and Mchaourab H S 1Mechanis m of chaperone functi on
in s mall heat -shock p r oteins 1Phosphorylati on -induced activati on of t w o -mode binding in αB -crystallin 1J 1B i ol 1Che m 12003, 278:10361∃10367
[26]Crack J A 1, Mans ourM , Sun Y, et al 1Functi onal analysis of a s mall
∃827
[10]B is was A 1and Das K 1P 1Role of ATP on the interacti on of α-crys 2
tallin with its substrates and its i m p licati ons for the molecular chaper one functi on 1J 1B i ol 1Che m 12004, 279:42648∃42657
[11]Derha m B K 1, Ell ory J C 1, B r on A J, et al 1The molecular 2
one α--crystallin incorporated int o red p r me Na /K-ATPase against 1Eur 1i chem 12003, ∃[12]PerngM D 1, , et al 1I nter mediate fila ment inter 2
acti ons can be by HSP27and αB -crystallin 1J 1Cell Sci 11999, 112:2099∃2112
[13]Fujita Y, Oht o E, Katayama E, et al 1αB -crystallin -coated MAP
m icrotubule resists nocodazole and calcium induced disasse mbly 1J 1Cell Sci 12004, 117:1719∃1726
[14]Narberhaus F 1α-crystallin -type heat shock p roteins:s ocializing
m inichaper ones in the context of a multichaperone net w ork 1M icr obi ol 1Mol 1B i ol 1Rev 12002, 66:64∃93
[15]BorrelliM J, Bernock L J, Landry J, et al 1Stress p r otecti on by a flu 2
orescent H sp27chi m era that is independent of nuclear transl ocati on or multi m eric dissociati on 1Cell Stress Chaper ones 12002, 7:281∃296[16]de W it N J W 1, Verschuure P, Kapp éG, et al 1Testis -specific hu 2man s mall heat shock p rotein HSPB9is a cancer/testis antigen, and potentially interacts with the dynein subunit TCTEL11Eur 1J 1Cell B i 2ol 12004, 83:337∃345
[17]Q iu Z J, Bossier P, W ang X M , et al 1D iversity, structure, and ex 2
p ressi on of the gene for p26, a s mall heat shock p r otein from A rtem ia 1Genom ics 12006, 88(2) :230-2401
[18]Adhikari A S, Rao K S, Rangaraj N , et al 1Heat stress -induced l o 2
calizati on of s mall heat shock p roteins in mouse myoblasts:intranuclear la m in A /Cspeckles as target f or αB -crystallin and H s p251Exp 1Cell Res 12004, 299:393∃403
[19]MacRae T H 1Structure and functi on of s mall heat shock /alpha -crystallin p r oteins:established concep ts and e merging ideas 1Cell 1
α-crystallin p r otein from A rte m ia franciscana O ligomeriza 2heat shock /
ti on and ther mot olerance 1Eur 1J 1B i oche m 12002, 269, 933-942[27]Guo Z And Cooper L F 1An N -ter m inal 33-a m ino -acid -deleti on
variant of hsp25retains oligomerizati on and functi onal p r operties 1B i o 2che m 1B i ophys 1Res 1Comm 12000, 270, 183-189
[28]Aquilina J A , Benesch J L, D ing L L , et al 1Subunit exchange of
polydisperse p r oteins 1Mass spectr ometry reveals consequences of αA -crystallin truncati on 1J 1B i ol 1Che m 12005, 280:14485∃14491[29]Bova M P, Mchaourab H S, Han Y, et al 1Subunit exchange of s mall
heat shock p r oteins 1Analysis of oligomer f or mati on of αA -crystallin and H sp27by fluorescence resonance energy transfer and site -directed truncati ons 1J 1B i ol 1Che m 12000, 275:1035∃1042
[30]Chowdary T K, Raman B, Ra makrishna T, et al 1Ma mmalian H sp22
is a heat -inducible s mall heatshock p rotein with chaper one -like ac 2tivity 1B i ochem 1J 12004, 381:379∃387
[31]Haslbeck M , W alke S, Str omer T, et al 1H s p26:a te mperature -regulated chaperone 1E MBO J 11999, 18:6744∃6751
(责编:张琪琪)
(上接48页) [7]Moore,J 1C 1and F 1H 1A rnold, D irected evoluti on
of a para -nitr obenzyl esterase for aqueous -organic s olvents 1Nat B i o 2tech, 1996114(4) :458-467
[8]Farinas, E 1T 1, T 1Bulter, and F 1H 1A rnold, D irected enzy me evo 2
luti on 1Current Op ini on in B i otechnol ogy, 2001112(6) :545-5511[9]Zhao, H 1, et al 1, Molecular evoluti on by staggered extensi on p r ocess
(StEP ) in vitr o recombinati on 1Nat B i otech, 1998116(3) :258-261
[10]Shao, Z 1, et al 1, Random -p ri m ing in vitr o recombinati on:an ef 2
fective t ool for directed evoluti on 11998:681-683
[11]Pelletier, J 1N 1, A RACH I TT for our t oolbox 1Nat B i otech, 20011
19(4) :314-315
[12]YingXin, Z 1, et al 1, Genome shuffling leads t o rap id phenotyp ic
i m p r ovement in bacteria 1Nature, 20021415(6872) :644-646[13]Patnaik, R 1, et al 1, Genome shuffling of Lact obacillus f or i m p r oved
acid t olerance 1Nat B i otech, 2002120(7) :707-712
[14]Volkov, A 1A 1, Z 1Shao, and F 1H 1A rnold, Recombinati on and
chi m eragenesis by in vitr o heter odup lex for mati on and in vivo repair 11999
[15]Oster meier, M 1, J 1H 1Shi m , and S 1J 1Benkovic, A combinat orial
app r oach t o hybrid enzy mes independent of DNA homol ogy 1Nat B i o 2tech, 1999117(12) :p 11205-1209
[16]Gris wold, K 1E 1, et al 1, Evoluti on of highly active enzy mes by ho 2mol ogy -independent recombinati on 12005:10082-10087
(责编:张琪琪)