生物技术通报
・综述与专论・
ＢｌｏＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹ
ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００９年第９期
青霉素酰化酶表达调控的研究进展
蒋咏梅１
章文贤１
魏东芝２
（１福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心福建师范大学生命科学学院福建省现代发酵技术工程研究中心，福州３５０１０８；
２华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室鲁华生物技术研究所，上海２００２３７）
摘要：青霉素酰化酶（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｃｙｌａｓｅ，ＰＡＣ）是抗生素工业的重要酶。它在大肠杆茵中需经过复杂的转录、翻译和后翻译才能成熟，且后翻译过程对活性酶的最终形成影响很大。在阐述ＰＡＣ的苯乙酸诱导机制的基础上，详细论述了ＰＡＣ的后翻译过程，并对几种主要的影响因素进行了分析。
关键词：青霉素酰化酶大肠杆菌诱导机制后翻译过程影响因素
ＳｔｕｄｉｅｓｏｆＲｅｇｕｌａｔｉｎｇｏｆＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＰｅｎｉｃｌｌｉｎＡｃｙｌａｓｅ
ＪｉａｎｇＹｏｎｇｍｅｉｌ
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ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＦｕｊｉａｎＭｏｄｅｍＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０１０８；２Ｓｔａｔｅ
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Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｉｎｖｏｌｖｅｓ
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ｓｔｅｐ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｎｄｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ
ｐｒｏｃｅｓｓ
ｗｈｉｃｈｉｓｔｈｅｋｅｙｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｈｉｓ
ｐａｐｅｒ
ｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＰＡＣｉｎ—
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ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
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Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎＥｆｆｅｃｔｆａｃｔｏｒ
青霉素酰化酶（Ｅ．Ｃ．３．５．１．１１）自１９５０年首次在黄青霉（Ｐｅｎｉｃｉｌｎｕｍｃｈｙｓｏｇｅｎｕｍ）Ｑ１７６中发现以来，就以其良好的催化酰化／去酰化特性受到了广泛关注。ＰＡＣ不仅能催化６．ＡＰＡ、７－ＡＤＣＡ与侧链化合物缩合生成各种高效低毒的半合成抗生素，还可应用于许多有潜在价值的反应中，如在肽的合成过程中用于保护氨基和羟基，以及用于手性化合物的拆分等…。
产生青霉素酰化酶的微生物很多，可分为革兰氏阴性菌（Ｇ。）和革兰氏阳性菌（Ｇ＋）两大类，前者有大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉＡＴＣＣ
Ａｘ）等；后者有巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ＡＴＣＣＡＴＣＣ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ
１４９５４，Ｂｍ）与粘节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ口括ｃ∞淞１５２９４，Ａｖ）等。Ｇ。菌产生的ＰＡＣ通常定位于
周质空间，Ｇ＋菌产生的青霉素酰化酶则分泌于胞外。
目前研究最多的是大肠杆菌来源的青霉素酰化酶，它定位于周质空间，由仅（２４ｋＤ）和Ｂ（６５ｋＤ）两个亚基组成。ｐａｃ基因首先转录表达产生前体ＰＡＣ，再经复杂的后翻译形成有活性的成熟酶。该过程与哺乳动物中的激素形成相似，这在细菌中极为罕见。
１１１０５。Ｅｃ），嗜柠
檬酸克鲁沃尔氏菌（ＫｌｕｙｖｅｒａｃｉｔｒｏｐｈｉｌａＡＴＣＣ２１２８５，
ｒｅｔｔｇｅｒｉＡＴＣＣ
１青霉素酰化酶基因的表达调控
大肠杆菌中，ｐａｃ的转录效率通常很低，将ｐａｃ基因置于强启动子的控制下，并在核糖体结合位点和起始密码子之间插入一段间隔序列能够分别提高
Ｋｃ），雷氏普罗威登斯菌（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ
３１０５２，Ｖｒ），粪产碱杆菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ，Ａｆ）与无色杆菌木糖氧化属（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ
ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ，
收稿日期：２００９—０５・２０
基金项目：上海市重点学科建设项目（Ｂ５０５）
作者简介：蒋咏梅（１９７１・），博士，研究方向：生物化工；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｍｊｉａｎｓｂｉｏ＠ｑｎｕ．ｅｄｕ．Ｃｌｌ
通讯作者：魏东芝（１９６３－），男，教授，博士生导师，研究方向：生物催化工程和生物制药工程；Ｅ・ｍａｉｌ：ｄｚｈｗｅｉ＠ｅＣＵＳｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
万方数据
２００９年第９期蒋咏梅等：青霉素酰化酶表达调控的研究进展
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转录和翻译效率，并最终提高ＰＡＣ产量，但过表达的酶无活性且发现了包涵体的聚集嵋一。
对青霉素酰化酶在大肠杆菌中的表达研究发现，主要存在３种调控机制：分解代谢阻遏、ＰＡＡ诱导，温度调节。在野生型大肠杆菌中，ＰＡＣ的表达受碳源的调节，有些碳源如甘油、乳糖、果糖和葡萄糖对ｐａｃ基因的表达有代谢抑制作用，而苯乙酸作为惟一碳源对ｐａｃ基因转录有诱导作用，这些底物是在转录水平上影响ｐａｃ基因的表达＂ｏ。尼ｃｉｔｒｏ—ｐｈｉｌａ中ＰＡＣ的合成也存在类似情况。在Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ中则恰恰相反，ＰＡＣ的表达既不受ＰＡＡ诱导也不受
葡萄糖的抑制，但ＴＣＡ循环中的琥珀酸，延胡索酸，
苹果酸却能够抑制ＰＡＣ的表达Ｈｏ。Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ，Ａ．ｔ，ｉ￥ＣＯ￥１ｔ和Ｂ．Ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ中的ＰＡＣ表达同样受ＰＡＡ诱导，但不受分解代谢阻遏抑制。ＰＡＣ表达的温度调控则广泛存在于上述菌株中。
２００４年Ｋｉｍ等¨１对ＰＡＡ的诱导机制进行了研究，发现在Ｅ．ｃｏｌｉＷ
ＡＴＣＣ
１１１０５中，ＰａａＸ是ｐａｃ基
因表达的阻遏物，ＰＡＡ的真正作用是将ｐａｃ基因从ＰａａＸ的阻遏中解脱出来，具体机制如图１所示。
Ａ—逗重≥恒国————臣卜匦卜１∞
Ｂ
Ｃ
Ａ．ｐａｃ启动子；Ｂ．正常生活状态下ＰａａＸ阻遏ｐａｃ表达；Ｃ．ＰＡＡ的去阻遏作用
图１
ｐａｅ基因调控模型‘５１
在大肠杆菌ｐａｃ的启动中，ＰａａＸ和ｃＡＭＰ—ＣＲＰ复合物竞争性地与ＣＲＰ结合位点Ｉ相结合，因而它们的存在对ｐａｃ的表达产生相反的作用。在ＰＡＡ不存在时的正常生长状况，ＰａａＸ结合于ｐａｃ操纵子
万方数据
上的结合位点，由于该位点与ＣＲＰ的结合位点相交叠，导致ｃＡＭＰ—ＣＲＰ复合物无法与ＣＲＰ位点结合，因此ＰＡＣ不能表达（图１）。当培养基中存在ＰＡＡ时，它进入细胞核质内被ＰａａＫ催化形成ＰＡＡ—ＣｏＡ复合物，进而阻止ＰａａＸ之间的相互作用，使ＰａａＸ无法与ｐａｃ操纵子相结合。而ｃＡＭＰ—ＣＲＰ复合物在与高亲合性的ＣＲＰ结合位点Ⅱ结合后，便可以与空闲的ＣＲＰ结合位点Ｉ结合，继而启动ｐａｃ的转录。
２青霉素酰化酶的后翻译过程
大肠杆菌中，形成活性ＰＡＣ的过程较为复杂，首先经转录和翻译形成带有信号肽，间隔肽，仅和Ｂ亚基的前蛋白酶原（ｐｐＰＡＣ，９５ｋＤ），后翻译过程包括：（１）在信号肽的引导和分子伴侣的帮助下，ｐｐ—ＰＡＣ转运至周质空间，通过质膜的同时，２６个氨基酸的信号肽被蛋白酶水解除去形成酶原（ｐＰＡＣ，９１ｋＤ）；（２）从１３亚基的Ｎ端切除连接肽产生１３亚基（５５７个氨基酸，６５ｋＤ）；（３）ａ亚基进一步通过分子内或分子间的自催化作用从Ｃ端水解，同时５４个氨基酸的间隔肽被切除（２０９个氨基酸，２４ｋＤ）Ｌ６１，最终产生由２０９个氨基酸的Ｏｔ亚基和５５７个氨基酸的１３亚基折叠成的活性酶。青霉素酰化酶基因表达及其后加工过程见图２。
ｇｅｎｅ
５，，，＝＝ＣＲＰ５’：＝］３’
ＣＲＰ－３５－１０
ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ３３，
葡蒜嚣刘．ＲＢＳ转录ｐａｃ
－，，———一．。—’～ｍＲＮＡ
１．翻译
巧ａｊ［＝］ｊ匕］［＝］［＝ｊ
Ｉ
ｐ∞ｐｍＰＡＣ
信号肽移除ｌ转运
进入周质空间Ｊ
－
‘Ｉ。。。‘。。‘。‘ａ‘’。。。。。。Ｉ’。。‘‘（‘．。。。。‘。。。ｉ’‘。‘。。‘。‘‘。‘‘。’８。‘‘。‘。。’‘。‘‘。‘。‘Ｉ
ｐｍＰＡＣ
连鬻除ｌ加工
亡互＝］匕＝＝匿＝＝］ＰＡＣ
Ｓ．信号肽；ｃｔ．ｎ亚基；ｃ．连接肽；Ｂ．Ｂ亚基
圈２大肠杆菌中ＰＡＣ的表达及成熟过程‘７１
成熟的青霉素酰化酶是由仅亚基和１３亚基组
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生物技术通报Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
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成的，但这两个亚基在单独存在时均无活性，将它们的基因分别构建在不同的质粒上，放入同一个宿主中表达时，细胞质中的酶活则可恢复至野生菌株的水平。此外，间隔肽对酶活的影响也很大，在ｏｔ亚基与ｐ亚基之间加上一个长度为５４个氨基酸的间隔肽时，活力明显降低。
由图２可见，青霉素酰化酶表达的基因调控过程很复杂，影响因素也较多。为得到高产量的活性青霉素酰化酶，除了从转录和转译水平促进ＰＡＣ的表达外，还需要提高后翻译的效率。Ｉｇｎａｔｏｖａ¨１通过在培养基中加入氯霉素阻止蛋白质继续合成，研究后翻译水平对ＰＡＣ产量的影响，发现ＰＡＣ的成熟过程中，限制其产量的关键步骤包括蛋白酶水解，通过质膜的转运过程和分子伴侣介导的蛋白重折叠。
３影响后翻译过程的因素
３．１蛋白酶水解
大肠杆菌中，外源蛋白在细胞内的过表达常常引起一系列生理反应，如中间代谢和调节功能的改变，细胞生长停滞，核糖体破坏和细胞死亡等，给宿主本身带来严重的生理负担归１。因此，细胞的胞质内，周质空间和质膜上有大量内肽酶用于水解外源蛋白，水解后的肽链则继续被肽末端降解酶消化。研究表明，胞内超过９０％已合成的ＰＡＣ前体被胞内蛋白降解¨ｏ。为减少ＰＡＣ的降解，可采用某些特定的方法，如使用蛋白酶缺陷菌株，低温培养宿主菌，共表达分子伴侣，调整发酵条件，降低细胞生长速率，改变蛋白质特定的氨基酸残基以消除蛋白酶切位点等。３．２通过质膜的过程
外源蛋白在胞质内合成后，可能定位于不同的细胞部位，如周质空间，细胞外膜，甚至胞外的培养基中¨…。周质空间为氧化状态，其中存在利于含二硫键蛋白正确折叠的酶，且细胞的大多数自身蛋白聚集于胞内，因而外源蛋白定位于周质空间对后期的提取更为有利，这就需要正确的信号肽来引导蛋白通过合适的转运系统跨越质膜。
３．２．１
信号肽的影响信号肽在ＰＡＣ前体肽的跨
膜转运过程中起着极其重要的作用，它可协助完整的前体蛋白转移到周质空间，信号肽的切除则是ＰＡＣ在大肠杆菌中表达加工过程的关键步骤，发生在前体蛋白穿过原生质膜的过程中。移除信号肽的
万方数据
突变株虽然可以完成部分后翻译过程，但ＰＡＣ活性明显下降，无活性的前体肽积累在胞浆中，且间隔肽未被加工切除…１。有人曾通过设计引导肽的序列使蛋白前体顺利通过质膜¨２１。采用疏水性的信号肽可带动ｐｐＰＣＡ从胞浆内转运到周质空间，提高青霉素酰化酶的分泌和折叠能力。Ｍｏｎｒｏｙ¨刮对大肠杆菌的信号肽基因序列的Ｌｙｓ２一Ｔｈｒｌ３（Ｎ端）和Ａｌａｌ４一Ｌｅｕ２５（Ｃ端）进行随机诱变，发现有几个信号肽突变株的分泌表达水平比野生型提高了４倍。３．２．２转运系统
大肠杆菌中大多数蛋白都是通
过Ｓｅｃ系统转运的。其中，ＳｅｃＢ是帮助转运胞外蛋白和周质空间蛋白分泌的重要组分，缺失ＳｅｃＢ的突变株则失去了生产活性ＰＡＣ的能力，这种缺陷可通过染色体外的ＳｅｃＢ共表达得以恢复。但是，过表达ＳｅｃＢ并不能提高活性ＰＡＣ的产量，只能减少胞内包涵体的形成，说明ＳｅｃＢ的主要作用在于有效地转运ｐｐＰＡＣ进入周质空间¨“。
最近发现的双精氨基酸转运系统（Ｔａｔ）能够转运Ｓｅｃ不能转运的蛋白。识别序列为ＳＲＲＸＦＬＫ，其中含有两个精氨酸残基¨引。大肠杆菌ｐｐＰＡＣ的信号肽虽然只含有被天冬氨酸分隔开的两个精氨酸残基，但在研究Ｅ．ｃｏｌｉＪＡＲＶｌ５的Ｔａｔ突变体发现，ｐｐＰＡＣ的信号肽也能有效地通过Ｔａｔ转运。而且，两个精氨酸中间天冬氨酸缺失或被Ｌｙｓ置换也不会对Ｔａｔ转运造成影响。但是如果将第二个精氨酸转变成丝氨酸，则Ｔａｔ转运系统失效，ｐｐＰＡＣ转而进入Ｓｅｃ转运系统¨６１。将ｐｐＰＡＣ原来的信号肽转换成依赖ＳｅｃＢ的ＯｍｐＴ信号肽，随着ＳｅｃＢ的过表达，仍然发现ｐＰＡＣ成功地转运至周质空间中Ⅲ’。
３．２．３
辅因子的影响酶的辅因子为酶的生物学
活性或成熟所必须的离子或分子。这些金属离子不直接参与酶的功能，但对于成熟，活性和酶的稳定性很重要。成熟ＥｃＰＡＣ的晶体结构中观察到每个酶分子都与一个钙离子紧密结合¨引。来源于Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｐ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ，Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ，Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓ和Ｋ．ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ的青霉素酰化酶¨９’驯中也同样发现了钙离子的踪迹。钙被ＰＡＣ分子包埋在内部深处，说明它的结合优先于转运的发生。
钙离子是ｐｐＰＡＣ的膜转运、正确折叠和成熟所必需的辅因子，因此活性ＰＡＣ的产量就部分依赖于
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培养基中的钙离子浓度。当培养基中钙离子浓度增加到６０—７５０ｐ．Ｍ时，Ｅ．ｃｏｉｌＢＬ２１（ＤＥ３）中ＡｆＰＡＣ和ＥｃＰＡＣ的产量增加了两个数量级旧“。分别通过Ｔａｔ系统和Ｓｅｅ系统转运的ＥｃｐｐＰＡＣ和ＡｆＰＡＣ，均发现钙缺乏时前体肽在胞质内的积累。Ｅ
ｃｏｌｉＢＬ２１
（ＤＥ３）中表达ＥｃＰＡＣ时，培养基中钙离子浓度增加到１００ｍＭ可使产量提高３倍，ＰＡＣ从胞内向周质空间的转运能力也得到大幅提高ｍＪ。３．３蛋白的重折叠
青霉素酰化酶的前体酶原（ｐｐＰＡＣ）去除信号肽进入周质空间后，还需要分子伴侣切除空间肽才能折叠成有活性的ＰＡＣ。分子伴侣通常分为两种，一种是转运系统中的组分蛋白，如ＳｅｃＢ；另一种通常是些热休克蛋白，如ＧｒｏＥｌ和ＤｎａＫ。自从发现周质空间也存在包涵体以来，周质空间内的蛋白折叠同样成为一个普遍的问题旧］。过表达分子伴侣提高周质蛋白产量的策略被广泛应用。ＣｈｏｕⅢ１发现，胞质和周质空间都有成熟的ＰＡＣ，说明后翻译过程同时存在于胞质和周质空间。还通过共表达分子伴侣ｔｒｉｇｇｅｒ因子，ＧｒｏＥＬ／ＥＳ和ＤｎａＫ／Ｊ—ＧｒｐＥ，增加了ＰＧＡ成熟限制性ＤｅｇＰ是同时具有蛋白酶活性和分子伴侣活性的热休克蛋白，为大肠杆菌细胞外膜蛋白水解所必须。ＤｅｇＰ在周质空间的共表达可防止前体ＰＡＣ在周质空间的错误折叠，明显减少了包涵体量，但该策略对胞内ＰＡＣ前体的累积没有效果汹，２６１。当共表达缺失蛋白酶活性而保留分子伴侣活性的ＤｅｇＰ
时，ＰＡＣ活性没有增加，说明ＤｅｇＰ的蛋白酶活性是的蛋白需要它来降解。但是，周质空间蛋白酶的缺失并非形成包涵体的主要原因，因为共表达与ＤｅｇＰ相似的周质空间蛋白酶ＤｅｇＳ或ＤｅｇＱ也同样无法
提高ＰＡＣ的活性，说明ＤｅｇＰ的分子伴侣活性和蛋白酶活性都是ＰＡＣ成熟过程所必须的Ｂ“。
青霉素酰化酶的表达包括转录、转译及复杂的后翻译过程。细胞中，首先形成的是ＰＡＣ的前体多肽，万方数据
可能成为产生活性青霉素酰化酶的瓶颈。因此，在ＰＡＣ的表达中，仅仅提高ｐａｃ基因的转录和翻译效率，提高蛋白表达量远远不够。只有通过调控菌体生长的代谢过程和环境中的诸多因素，维持一个从转录，翻译到后翻译过程的蛋白合成流，才能最大限度减少包涵体的形成，提高活性ＰＡＣ的产量。
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步骤的效率，其中ｔｒｉｇｇｅｒ因子效果最为明显。
促进折叠的主要因素，可能ｐａｃ过表达时错误折叠４总结
包括引导肽，连接肽和ａ，Ｂ亚基，在跨越质膜进入周质空间的过程中去除引导肽和连接肽，再经重新折叠才能形成有活性的ＰＡＣ。该过程中的任何步骤都有