细胞生物学论文
植物细胞工程研究及展望
摘要 此文概要介绍了植物细胞工程的主要分支学科及其研究进展。包括原生质体培养、细胞融合与体细胞杂交、胚胎培养和试管受精、组织和细胞培养生产有用物质、单倍体育种、体细胞无性系变异、细胞突变体的筛选、植物快速繁殖技术、体细胞胚胎发生和人工种子、组织细胞培养物的超低温保存以及转基因植物等。
关键词 植物细胞工程概况;植物组织培养;农业生物技术
近年来随着细胞生物学与分子生物学等学科的不断发展以及各种先进技术的不断研究与结合，植物细胞工程在生物科技领域已成为热点与重点，无论在理论还是在实际应用上都有广阔的前景,[1]尤其在遗传与育种上的重要性与日俱增，所以研究植物细胞工程十分有必要，它将带来第二次绿色革命，值得我们去重视与应用。[2]
1原生质体培养
1971年,日本的Takebe和Nagata首次利用烟草叶片分离原生质体并获得再生植株。到1976 年,有12种植物的原生质体能再生植株,1983 年增加到70种,1986年超过80种,到90年代初期达到100种以上。原生质体培养是80年代的一个研究热点。日本和中国在这一领域做出了很大的贡献。日本科学家成功地进行了大约70个植物品种的原生质体培养。我国获得了30个以上品种的原生质体再生植株,其中包括难度较大的重要粮食作物和经济作物大豆(Wei and Xu,1988)、水稻(Wang等,1989)、玉米(蔡起贵等,1987;孙敬三等,1989)、小麦(王海波等,1989)、谷子(董晋江、夏镇澳,1989)、高粱(卫志明、许智宏,1988)、大麦(颜秋生等,1990)、棉花(陈志贤等,1989)、油菜(Xu ,1982)、马铃薯(李耿光等,1988)等。在木本植物、药用植物、蔬菜和真菌原生质体培养方面的进展也十分迅速。[3]
2细胞融合与体细胞杂交
第一棵体细胞杂种植株是在1972年建立的,美国的Carlson诱导粉蓝烟草和郎氏烟草的原生质体融合并获得了杂种植株。早期的研究对象主要集中在茄科的烟草属、曼陀罗属和矮牵牛属,以后逐渐转移到茄属、番茄属、颠茄属和十字花科的芸苔属、拟南芥属和伞形科的胡萝卜属、欧芹属。随着重要粮油作物的原生质体再生植株的成功,研究对象又再一次转移。用于融合的亲本细胞也由最初的品种间进展到种间、属间甚至科间。亚太地区大约诱导了50多个种间和属间的原生质体融合形成植株,其中日本占一半。通过木本植物柑桔类种属间的体细胞杂交,培育出新的柑桔杂交品种(Ohgawara ,1995),有性杂交不亲和的番茄+马铃薯间的体细胞杂交也获得了杂种植株(Melchers,1978)。通过马铃薯的栽培品种与野生种的体细胞杂交,得到了抗晚疫病和卷叶病的体细胞杂种(Austin,1985)。白菜型油菜与甘蓝的体细胞杂交,得到了甘蓝型油菜(Sundberg,1986)。科间的大豆+粉蓝烟草(Kao,1977)、大豆+烟草(Chien,1982)也产生了连续增殖的杂种细胞系,更远缘的大豆+水稻产生了愈伤组织(Niizeki,1985)。[4]日本科学家还利用不对称细胞融合技术培获得世界上第一个商品烟草雄性不育系,应用这种雄性不育系,又开发了胡萝卜、卷心菜和茄子的F1代杂种。我国科学家利用烟草与黄花烟草和粉蓝烟草的体细胞杂交开发出新的烟草商品品种。
3胚胎培养和试管受精
胚胎培养技术主要应用于一些亚洲国家。已经有100篇以上幼胚培养成为植株的报道,有40多个杂种胚培养成功。印度科学家在栽培种菜豆、黄麻和花生的远缘杂交中获得了理想的重组体。日本科学家获得了3个柑桔属、李属和芸苔属品种和5个百合栽培种。中国农科院蔬菜所培养结球甘蓝和大白菜的杂种胚得到了种间杂种。中科院植物所和北京市农科院合作育成早熟桃新品种“京早3号”,
成熟期比一般早熟桃提前15-20天。[5]西北植物所得到了节节草和普通小麦的属向杂种。中国农科院棉花所获得了栽培棉和野生棉的种间杂种。大麦+小麦、大麦+提莫菲维小麦、小麦+冰草(育成新品种小堰6号)、小麦+大赖草、小麦+簇毛麦、小麦+黑麦、硬粒小麦+簇毛麦等也通过胚培养获得了杂种。烟草属间杂种、水稻品种间杂种也已经得到。
4组织及细胞培养生产有用物质
Arregnin和Bonner在1950年首先进行了培养橡胶茎愈伤组织获取橡胶的尝试。1967年,Kaul和Sta2ba从牙签草的组织和细胞培养物中分离出目的次生代谢物呋喃色酮。近50年来,这一领域的研究取得了飞速的发展。已经对400多种植物进行过研究,从培养细胞中分离到600多种次级代谢产物,其中60多种在含量上超过或等于其原植物,20种以上干重超过1%。紫草、人参、黄连、老鹳草等已达到商品化水平;长春花、毛地黄、烟草等已实现工业化生产;牙签草、三分三、红花等20多种植物正在向商品化过渡。在日本,人参细胞培养已达130600L发酵罐,人参根培养达2000L发酵罐;德国用1000L 发酵罐培养毛地黄细胞;加拿大用200L 发酵罐培养长春花细胞。在我国,人参细胞培养技术也已实现产业化;三分三在80年代即完成了10L 发酵罐中试;紫草、三七等的细胞培养也取得较大的进展。西洋参、云南萝芙木、三尖杉、盾叶薯芋、九连小檗、薄荷、柴胡、丹参、当归、青蒿、长春花、紫背天葵、延胡索、水仙、粗榧、水飞蓟、罗锅底、重楼等的细胞培养研究也已进行。利用培养细胞的生物转化能力生产高值化合物,德国科学家进行了出色的研究。[6]他们在毛地黄细胞的培养中加入生物合成途径的中间化合物毛地黄毒素和β-甲基毛地黄毒素,培养细胞以几乎100%的转化速率使之羟基化,变为医药强心剂地高辛。这一技术已实现工业化生产。
5单倍体育种
花粉和花药培养技术在育种上的应用研究,亚太地区一直处于领先的地位。1964年,印度的Guha和Maheshwari培养毛叶曼陀罗花药获得了第一棵单倍体植株。印度科学家应用这种方法培育的水稻品系比对照提高产量15%-49%。韩国获得了2个水稻新品种。日本也培育了具有耐寒性和口味较好的水稻品种、具有耐寒性和形状一致的花茎甘蓝品种及具有特别的橙色的卷心菜品种等。迄今为止,通过花粉和花药培养已获得了几百种植物的单倍体植株。[7]我国于1970年开始这方面的研究,并在70年代成为一个热点,也取得了很大的成果。培育40种以上植物的花粉或花药发育成单倍体植株,其中小麦、黑麦、小冰麦、玉米、橡胶树、杨树、辣椒、甜菜、白菜、油菜、柑桔、甘蔗、大豆、葡萄和苹果等的单倍体植株为我国首创。通过单倍体育种获得了水稻、小麦、烟草、辣椒和甜椒新品种,如单育1号、2号、3号烟草新品种,京花1号、2号等6个小麦新品种,中花8号、9号等15个水稻新品种,总种植面积达1000万亩。玉米获得了100多个纯合的自交系,橡胶获得了二倍体和三倍体植株。
6体细胞无性系变异
80年代以来,体细胞无性系变异成为继花粉和花药培养之后的又一种实用化的细胞工程育种新方法。体细胞无性系变异是植物组织培养过程中出现的普遍现象,并且绝大多数变异可以遗传,在再生植株中能够找到在常规诱变育种和杂交育种中所观察到的各种变异或重组类型。已经观察到体细胞无性系变异的农作物有甘
蔗、马铃薯、菠萝、水稻、小麦、玉米、燕麦、大麦、小黑麦、谷子、油菜、大豆、兰花、番茄、茄子、瓜类、甜菜、芹菜、烟草、草莓、桃、天竺葵、倒挂金钟、香石竹、水晶掌和锦带花等。澳大利亚科学家是体细胞无性系变异研究领域的先驱。他们的研究证明了这种方法在小麦、甘蔗和其它作物改良中的有效性。通过培养期间施加选择压力已经筛选获得体细胞无性系变异体及其品系,现已作为品种推广。[8]日本获得了百合、西瓜、大丁草、草莓和兰属的新品种及抗病性水稻、番茄和烟草品系。泰国获得了改良型香蕉和菊花新品种。印度从芥菜和芸苔属中诱导出早熟性、株高、成熟度都较好的变异体。我国近年来在稻麦体细胞无性系变异育种方面也取得了令人鼓舞的进展。已经培育出抗白叶枯病及赖氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、丝氨酸和酪氨酸含量高于亲本系的水稻变异体。培育的抗盐水稻在1992年就已种植3万亩。还选育出一批蛋白质含量高和白粒的小麦新品系。
7细胞突变体的筛选
细胞突变体的筛选最早始于1959年,G.Melchers在金鱼草悬浮细胞培养中获得了温度突变体。1970年,P.S.Carlson、H.Binding和Y.M.Heimer等人分别分离出烟草营养缺陷型细胞、矮牵牛抗链霉素细胞系及烟草抗苏氨酸细胞系。迄今为止,已经在不少于15个科、45个种的植物细胞培养中筛选出100个以上的细胞突变体或变异体,其中包括水稻、小麦、玉米、高粱、大麦、燕麦、甘蔗、大豆、亚麻、番茄、马铃薯、胡萝卜、苜蓿、烟草、向日葵等重要经济作物。[9]筛选出的突变体有抗病细胞突变体、抗氨基酸及其类似物细胞突变体、逆境胁迫抗性突变体、抗除草剂细胞突变体及营养缺陷型细胞突变体等。
8植物快速繁殖技术
60年代,法国的Morel用茎尖培养的方法大量繁殖兰花获得成功。植物快速繁殖技术、试管苗工厂化生产和无病毒种苗生产技术在70年代得到了快速的发展。通过离体培养获得小植株并且具有快速繁殖潜力的植物已有100多科、1000 种以上,有的已经发展成为工业化生产的商品。种类也由以观赏植物为主逐渐发展到果树、林木、蔬菜和大田作物。美国、法国、意大利、荷兰等欧美国家试管苗的年产量均在数千万株以上,并且以每年7%-8%的速度增加。我国快速繁殖和无病毒种苗生产的研究始于70年代。[10]“六五”期间主要是研究、积累阶段,到“七五”期间研究成果开始向应用转化并大见成效。马铃薯无毒种薯和甘蔗种苗已在生产上大面积种植。兰花、香石竹、月季、菊花、唐菖蒲、百合、花烛、非洲菊、蒲包花、大花萱草、非洲紫罗兰、大岩桐、重瓣玉簪、花叶芋、瑞香、橡皮树、草莓、茶花、桉树、杨树、苹果、柑桔、枣树、枸杞、醋栗、葡萄、木薯、无籽西瓜已进行规模化生产或中间试验。试管苗的年产量已由90年代初期的2000万株左右发展到现在的5000万到1亿株以上。此外,一些生产上适用的技术也不断被开发出来,如微型脱毒马铃薯生产技术、马铃薯脱毒小薯的喷雾无基质栽培技术等。
9体细胞胚胎发生和人工种子
1958年,Reinert在胡萝卜的组织培养中最先发现了体细胞胚胎(胚状体)。据不完全统计,能大量产生胚状体的植物已有43科、92属、100多种。一些重要作物如水稻、小麦、玉米、珍珠谷等,也能通过离体培养产生胚状体。1977
年,Murashige第一次提出利用植物组织培养中体细胞胚胎发生的特点,把胚状体包埋在胶囊内形成球状结构,使其具有种子的机能并可直接播种于田间的设想。[11]80年代初,美、日、法等国相继开展了人工种子的研究,并且在胡萝卜、苜蓿、芹菜、花椰菜、莴苣、花旗松等植物上获得了初步的成功。欧洲将人工种子研究纳入“尤里卡计划”。印度、芬兰、瑞士、韩国等国也开展了研究。我国人工种子的研究开始于“七五”期间,并且被列入了“863高技术研究发展计划”。对胡萝卜、芹菜、黄连、苜蓿、西洋参、云杉、华腺萼木、四会贡桃、番木瓜、芫荽等十几种材料进行了系统的研究。目前这一领域存在的最主要的问题是模拟人工种皮。相信随着人工种皮制作和其它一些问题的突破,人工种子总有一天会实现工业化生产,给农业生产带来根本性的变革。
10组织细胞培养物的超低温保存及种质库的建立
植物细胞全能性的发现和证实,为植物的种质资源的长期保存开辟了一条新途径。许多植物的组织培养物在液氮中超低温保存以后,仍然能保持很高的存活率,并且能再生出新植株和保持原来的遗传特性。如胡萝卜和烟草的悬浮细胞超低温保存6个月以后仍然能恢复生长并分化出植株。超低温保存的材料,可以是愈伤组织和悬浮细胞、原生质体和花粉,也可以是胚状体、幼胚、芽和茎尖分生组织等。有关这方面的研究近20年来已经取得了很大的进展。
11转基因植物
1983年,人们从细菌中分离出分解抗生素的基因,并且转移到植物细胞中获得能在抗生素培养基上生长的植株。到90年代初期就有60多种转基因植株问世,这些植物有烟草、番茄、马铃薯、矮牵牛、胡萝卜、向日葵、油菜、苜蓿、亚麻、甜菜、棉花、芹菜、黄瓜、拟南芥、大白菜、大豆、水稻、玉米、莴苣、豇豆及稞大麦等。[12]90年代是转基因植物研究快速发展的时期,已经进入市场的有可较长时期贮存的番茄和抗病毒番茄、抗除草剂的大豆和油菜及抗虫棉花等。美国还培育出能生产保暖性比普通棉织品高8.6%的包含聚酯纤维的工程棉花。澳大利亚培育出蓝花玫瑰、开花期延长一倍的重组麝香石竹及高产、优质的小麦新品种。美国孟山都公司培育的转基因大豆和玉米不但在本国大面积栽培,而且还出口到欧洲国家和一些发展中国家。1997年,美国种植的转基因棉花、玉米和大豆已达数百万英亩。现在,全世界进入田间试验的转基因植物已经超过146项。许多专家认为,到2000年,在价值200亿美元的种子中,有很大一部分是通过组织培养或重组DNA技术将一些有益性状引入到植物中得到的。我国在1995年培育出抗黄矮病的转基因小麦,之后又培育成抗条锈病的小麦新品种。将冰草基因导入小麦,获得了小麦优良品种。培育的优质、高产的转基因大豆新品种,蛋白质含量比标准品种提高45%-48%,产量提高10%-20%。培育的“中国抗虫棉”已在生产中推广。将鱼的抗冻基因导入番茄,获得了耐寒、高产的转基因番茄。转基因抗盐马铃薯也获得成功。
12 植物细胞工程展望
加强植物细胞工程基础研究植物细胞工程的发展有赖于基础科学的进步与发展。应用现代分子生物学理论和技术研究植物细胞全能性表达、细胞脱分化、器官发生和形态建成相关基因的功能和表达调控,将揭示植物再生的分子基础,有利于实现植物再生的人工调控。同时,加强植物代谢工程的基础研究,加快植物
细胞工程与植物基因工程的整合,结合分子标记辅助育种技术,将大大推进转基因植物、植物生物反应器的研究和应用。完善植物细胞工程技术体系植物细胞工程技术体系是植物组织培养技术的集成和优化。培养和选育高效型的优良细胞株系,建立植物高频率再生体系,优化突变体筛选、无糖培养和快繁技术,开发适合规模生产的低成本培养基,优化植物细胞生物反应器的设计和工艺,加强计算机技术和自动化控制技术在植物细胞工程中的应用,形成一套集成创新的技术体系,将推动植物细胞工程技术向高效、可控和多样化的方向发展。开拓新的研究和应用领域植物细胞工程技术是现代生物技术中发展比较成熟的技术,是植物改良的有效途径和方法。随着现代农业的不断拓展,植物细胞工程技术应不断开拓新的应用领域,如推动植物细胞工程技术与空间技术的结合,发展空间细胞融合技术,加强海洋生物技术的应用,利用植物细胞工程技术培育海藻新品种,生产海洋来源的植物功能产品,开拓植物细胞工程在环境保护中的应用等。加快植物细胞工程技术的应用植物细胞工程技术的应用,催生了一大批先进实用的研究成果和技术,培育了一批优良品种。在大力推广常规脱毒和快繁技术的同时,加快发展植物快繁生物反应器和光自养微繁技术,将为种苗业带来新的变革。生产微型营养器官的人工种子可能成为最先规模化应用的人工种子技术,以体细胞胚为繁殖体的人工种子技术需要进一步研究和完善。应用植物细胞培养技术生产植物来源的生物产品,尽管目前仅在少数植物上实现了商业化生产,但随着植物细胞工程生物反应器技术的完善,其应用领域将进一步扩大。重视植物细胞工程质量管理植物细胞工程技术呈现发展规模化、管理规范化和操作自动化的趋势。目前国外一些国家在组织培养实验室、种苗快繁的质量管理以及植物来源生物产品的生产和质量管理中实行良好实验室规范(GLP)、良好生产规范(GMP)和危害分析和关键控制点(HACCP)系统,我国一些植物快繁企业也开展了GMP论证。植物细胞工程技术在产生巨大的社会经济效益的同时,必然对其技术产品的质量管理提出更高的要求。植物细胞工程的研究与应用,推动了现代生物技术的发展。作为一个相对独立的学科和技术体系,植物细胞工程为高效、优质、可持续的现代农业做出了重大贡献。植物细胞工程的发展,有赖于生命科学技术和工程技术的进步,同时也促进了现代生命科学技术的进步和发展。重视植物细胞工程的基础研究,加强学科交叉融合,突出技术集成创新,将为植物细胞工程的发展提供更为广阔的空间,为现代农业和生命科学技术的发展做出更大的贡献。
参考文献
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