转化及转化子的鉴定
11243224 周雨
一、感受态细胞的制备
1、材料：E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制,eppendorf管。
2、设备 ：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
3、试剂 ：LB固体和液体培养基 ，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，麦康凯培养基(Maconkey Agar)，0.05mol/L CaCl2溶液， 含15%甘油的0.05mol/L CaCl2。
4、受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
5、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
二、转化
1、DNA和感受态细胞都置于37度恒温水浴锅中激活，然后将DNA转移到感受态细胞悬液中，反复吹打，使其均匀接触（由于细菌可以从环境中直接吸收DNA）；
2、运用热胀冷缩的原理，将混悬液放在冰水浴中半个小时到40分钟（最短时间），使得DNA与细胞表面受体结合；
3、轻轻的将混悬液置于37到45度的水浴锅45秒；
4、平稳快速的转入冰水浴中2分钟；
5、取出，加入900ul 的37℃预热的LB培养基，混匀；
6、放入37度的培养箱1小时，让菌苏醒，恢复生长；
7、取适当离心（3000至4000r/min，1min，弃部分上清液200微升）的管中细胞均匀地接种在选择培养基（LB培养基+某种抗生素）；
8、提前一天进行抗生素平板，培养基灭菌，之后，加入抗生素（青霉素），分布均匀，冷却至60度以下，适当摇瓶，摇着冷却，混匀后，涂平板，冷却凝固，再放入冰箱充分凝固，再在37度培养箱 1 小时，烘干水，离心，3000-4000 r/min 1 min ，去上清；
9、挑选部分的菌落，至少5个（随机）单菌落，进行扩大培养，以便于鉴定；
10、将菌作为PCR模板进行扩增（菌落PCR)；
11、进行菌种保藏，在液体培养基上；
12、再将菌种送到公司测序，如果是碱基突变、引起氨基酸变化等，就需要重新开始做。
二、转化子的筛选鉴定
(一)菌落PCR鉴定
重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。
抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒PET28a携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PET28a的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒PET28a进入E.coli O157 ： H7 后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coli O157 ：H7 ，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PET28a乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。
挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。
也以提取的重组质粒为模板，利用现有的引物，进行PCR扩增，检测质粒是否是所期望的重组质粒。
流程
感受态细胞的制备→质粒转化与重组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组质粒的提取与检测
结果分析
1、酶切电泳图的结果及分析 r
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
17,18泳道分别是标准λDNA酶切和自己的λDNA酶切后的产物的条带。15泳道为marker，16泳道是未酶切的λDNA的条带。12，13,14泳道分别是PET28a和商品PET28a酶切。
1泳道为我们的样品，是经酶切过的DNA PET28a 质粒，从图中可以看出只有有一条主带，这条是被Hind III切开的线性DNA PET28a 质粒，与DNA marker比较查资料可知分子量为2322，且可根据亮度看出含量不是很高。但是可以判断出我们组的载体质粒PET28a酶切很彻底。其他组的条带有些下面还有一条很浅的带是超螺旋DNA PET28a质粒，即没有被切开的质粒，分子量为2027。
2 重组子筛选结果
转化后，10个平板的菌落状况：
（1）进行酶切反应
酶切反应液的配制:
ddH2O 22μl
HindⅢ 1μl
BamHI 1μl
10×buffer 3μl
需要酶切的DNA 3μl
酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。
（2）电泳检测
反应结束后，向反应液中加入2.2μl 10×loading buffer，混匀以停止酶切反应，所有22.2μl样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：120V,45分钟左右。电泳后，观察酶切结果是否与预期的相符，即观察产品的大小；
（3）切胶回收；
（4）扩大培养（同上的扩大培养）；
（5）进行测序，看自己是否获取了正确的转化子。