湖南农业大学课程论文
学 院： 生物科学技术学院 班 级：生物科学二班
姓 名： 李晔 学 号：[1**********]0 课程论文题目：土壤中产木糖醇酵母菌株的筛选其发酵条件优化 课程名称：发酵工程
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土壤中产木糖醇酵母菌株的筛选其发酵条件优化
13级生科二班 李晔 [1**********]0
摘要：本文以木糖为唯一碳源从土壤中筛选得到可以耐受高浓度木糖的菌株，再经过复筛选出一株高产木糖醇的酵母菌株 Y-9。经高效液相色谱(HPLC）和红外扫描分析，确定菌株 Y-9 发酵利用木糖转化得到的主要产物为木糖醇。通过单因素实验、正交试验等 手段，对菌株 Y-9 发酵产木糖醇的培养基组分和发酵条件进行了优化，进一步提高了目的菌株的木糖醇产率和转化率，确定了菌株Y-9 摇瓶发酵木糖转化木糖醇的最优培养基和发酵条件。在木糖初始浓度为 200 g/L氮源为酵母膏 3.0 g/L，硫酸铵 2.0 g/L，玉米浆10.0 mL/L，硫酸镁 0.1 g/L，初始 pH 为 6.0，转速为 180 r/min，接种量为 4%的条件下，菌株 Y-9 的木糖醇产率为 160 g/L 左右木糖醇生成速率为1.67 g/L·h，木糖/木糖醇转化率达到 80%以上，是一株具有良好工业化研究开发价值的木糖醇生产菌株。
关键字：木糖 木糖醇 发酵 条件优化
木糖醇在自然界中广泛存在于许多水果、蔬菜中，同时也是人体糖类代谢的一种中间代谢产物，每天正常的新陈代谢产生 5~15 g 的木糖醇。木糖醇为白色结晶或结晶性粉末，甜度与蔗糖相当，易溶于水，但吸湿性小，无美拉德反应。口腔内多数的微生物不能利用，因此木糖醇有防龋齿功效。木糖醇在人体内的吸收代谢不需要胰岛素的参与，而且能促进胰岛素的分泌，是糖尿病人理想的食品与治疗良药。木糖醇还具有多元醇的多种特性，因此木糖醇被广泛应用于食品、医药工业，另外，在造纸、卷烟、牙膏、涂料等领域也有较好的应用潜力 。目前，木糖醇的工业化生产主通过木糖镍催化加氢还原制造，成本高，耗能大，对环境污染也比较大。随着世界人口和环境压力的增加，人们对环保和节约能源的意识加强，以及人们对功能性食品的需求的增长，微生物生产木糖醇可以作为更加经济实惠的一种替代方式。微生物发酵法生产木糖醇以其条件温和、操作简便、副产物少、环境污染低等优点已经引起人们的广泛关注。根据相关文献报道，发现可以利用木糖转化为木糖醇的微生物中细菌很少、大部分是霉菌和酵母。其中研究最多的
是酵母。细菌、霉菌中转化木糖为木糖醇能力普遍较差。据报道酵母转化木糖醇的能力最强，前景最好。但是目前，木糖/木糖醇转化率和木糖醇产率是限制微生物转化生产木糖醇规模化的关键因素。因此，获得优良菌株、优化发酵工艺控制仍是生物转化木糖醇生产研究的重点。
1 材料与方法
1.1 培养基
富集培养基：木糖 300 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L， KH2PO4 2 g/L，
(NH4)2SO4 2 g/L，NaCl 2 g/L；平板筛 选培养基：木糖 100 g/L，酵
母膏 3 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO4 2 g/L，NaCl 2 g/L，琼脂
20 g/L；复筛 培养基：木糖 100 g/L，酵母膏 5 g/L，玉米浆 10 mL/L， (NH4)2SO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，KH2PO4 2 g/L， NaCl 2
g/L ，pH 自然；
种子培养基：木糖 50 g/L，酵母膏 5 g/L，MgSO4 1 g/L，KH2PO4 2 g/L，NaCl 2 g/L；发酵培养基：同复 筛培养基。所有培养基中的木糖均与其它成分分开灭菌.
1.2 方法
1.2.1菌种筛选
取土样5 g，加入到50 mL 无菌水中，振荡10 min， 静置后取 5 mL 上清液接种到富集培养基中，180 r/min 摇床培养 7 d。将富集后的培养液进行适当稀释，涂布 在平板筛选培养基上，30 ℃培养 3~5 d，挑取酵母状 菌落转接到斜面。斜面在 30 ℃培养 2~3 d斜面菌种培养成熟后，转接到三角瓶复筛培养基， 于 30 ℃，180 r/min 摇床振荡培养 72 h，离心。用纸 层析检测挑选有木糖醇斑点的菌株并用 HPLC 检测发 酵清液中的木糖残余量和木糖醇产量，筛选木糖利用率高、木糖醇产量高的菌株。
1.2.2 生物量测定 将发酵液稀释20 倍，用可见分析光度计在570 nm波长下测定吸光 度。
1.2.3 pH 值测定
利用 PSH-2C 精密型酸度计进行测定。
1.2.4 产物定性 将发酵液离心取取上清液，稀释 10 倍进行采用纸 层析法进行产物的定性。
展开剂：V（正丁醇）:V（吡啶）:V（水）=2:2:1。
显色剂：硝酸银-氢氧化钠溶液
1.2.5 木糖、木糖醇定量分析 将发酵液离心取取上清液，稀释适当的倍数，采 用 HPLC 发酵液
中的木糖、木糖醇浓度进行定量分析。 分析条件：色谱柱 HYPERSIL 250 mm×4.6 mm×5 μm NH2(大连依利特 )，检测器（RID，ShodexRI100），
柱温 60 ℃，检测温度 35 ℃，流动相为乙腈:水=80:20，
流速 0.5 mL/min，进样量 25 μL。
1.2.6 产物鉴定 发酵结束后离心去菌体，取上清液经活性炭脱色、 浓缩、结晶、重结晶得到目标产物的样品，然后用 VERTEX-70 傅里叶红外吸收光谱进行分析，并与标准 木糖醇样品图谱做比较。
2 结果与分析
2.1 产木糖醇菌株的筛选
经富集培养、平板初筛，共挑取耐高浓度木糖的 酵母菌株 260 株。经摇瓶发酵、纸层析检测，共得到 60 株有木糖醇斑点的菌株，经 HPLC 分析，其中木糖 /木糖醇转化率达 50%以上的菌株有 24 株。通过多次 摇瓶发酵复筛转化率稳定在 60%左右的有 6 株，结果 见表 1。
表 1 木糖醇产生菌株复筛结果
转化率 木糖醇产
量/(g/L) /%
Y-9 0.97±0.25 0.20±0.11 63.06±0.76 63.36±0.20
Y-29 0.81±0.11 4.92±0.36 57.83±1.59 60.82±1.44
Y-55 0.93±0.13 2.1±3.40 58.44±0.86 59.85±0.81
Y-126 1.20±0.16 4.12±1.24 57.63±0.81 60.22±0.84
Y-151 0.93±0.12 3.20±1.43 57.87±0.64 60.13±0.93
Y-256 0.90±0.10 5.62±1.07 55.51±1.31 58.82±1.25 菌株 编号 菌体 浓度 木糖残余 量/(g/L)
比较而言，菌株 Y-9 的木糖利用率和木糖醇转化 率都比较高，初始木糖浓度为 100 g/L 时，该菌株在30 ℃、180 r/min 培养 48 h 后，木糖消耗完全，木糖 醇产率可达 63 g/L，经过多次复筛实验中发现菌株 Y-9 和一些国内外研究报道的菌株比较，木糖消耗速度和 木糖醇转化率都具有一定的优势，可以作为生物转化木糖醇的出发菌株，作为下一步研究的对象。
2.2 菌株 Y-9 木糖醇发酵条件的优化
2.2.1 木糖初始浓度对菌株 Y-9 木糖醇发酵的 影响 木糖醇发酵过程中，培养基中的木糖除用于转化生成木糖醇外，还要为菌体的生长和代谢提供碳源和能源，如果初始木糖浓度偏低,木糖用于细胞的生长比例就相对较高,木糖醇转化率相对较低，但如果初始 木糖浓度过高，可能会抑制细胞的生长，从而导致发 酵效率下降。
2.2.2 氮源对菌株 Y-9 木糖醇发酵的影响
文献报道氮源种类和浓度是影响酵母木糖醇发酵的关键因素[5]。常用氮源有硫酸铵、脲、酵母浸出物、蛋白胨等，但不同的菌株差异较大。本文在菌株 筛选阶段采用的培养基氮源为酵母膏、玉米浆和硫酸 铵的复合氮源，现选用几种常用的有机和无机氮源,考察他们单独或复合使用时对菌株 Y-9 木糖醇发酵的影响。
3 讨论
本实验以木糖为唯一碳源从土壤中筛选得到可以耐受高浓度木糖且木糖醇转化率较高的酵母菌株 Y-9，并对其发酵培养基组分和培养条件进行优化以提高木糖醇转化率。