中国卫生检验杂志2014年4月第24卷第7期ChinJHealthLabTec，Apr2014，Vol24，No7·965·
·临床检验·
血清肌钙蛋白Ⅰ纳米胶乳增强免疫比浊法试剂的研制
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方兴，黄信用
1．金华市人民医院，金华职业技术学院附属医院，浙江金华321000；2．金华强盛生物科技有限公司，浙江金华321000摘要：目的研制一种新的血清肌钙蛋白Ⅰ胶乳增强免疫比浊法检测试剂，以满足各级医院实验室的检测需求。方
“吸附抗人cTnⅠ胶乳颗粒”，在合适的缓冲液中，通法用cTnⅠ单克隆抗体和新型纳米胶乳颗粒进行化学交联制备成
过免疫比浊法原理检测血清cTnⅠ浓度。结果该试剂的空白吸光度、线性范围、分析灵敏度、准确度、测量精密度等性能指标均符合产品注册标准的要求。产品注册检验结果合格。产品临床试验表明产品性能方面均符合标准要求；与对比产品检测结果的量值差异无统计学意义（P＞0．05）；与对比产品检测结果的两组测试数值差异有统计学意义（P＜0．001）。结论血清肌钙蛋白Ⅰ纳米胶乳增强免疫比浊法设计合理、性能指标符合临床要求。本法既可满足大型医院大批量样本的检测，又能满足配备了普通生化分析仪的基层医院实验室测定，值得推广应用。关键词：肌钙蛋白Ⅰ;纳米胶乳颗粒;性能指标;免疫比浊法中图分类号：Ｒ446．11文献标识码：A文章编号：1004－8685（2014）07－0965－03
Developmentofnanolatexenhancedimmunoturbidimetricreagent
ofcardiactroponinI
FANGXing*，HUANGXin－yong
JinhuaPeople'sHospital，TheAffiliatedHospitalofJinhuaPolytechnicInstitute，Jinhua321000，China
Abstract：ObjectiveTodevelopanewnano－latexenhancedimmunoturbidimetricreagentofcardiactroponinI，inordertomeetthelaboratorydetectionneedofalllevelsofhospitals．MethodsAbsorbentanti－humancTnIlatexparticleswerepre-paredbychemicalcrosslinkingofcTnImonoclonalantibodyandnewnano－latexparticles，thentheserumcTnIlevelwasdetec-tedintheappropriatebuffersolutionbyimmunoturbidimetry．ＲesultsTheblankabsorbance，linearrange，sensitivityforanal-ysis，accuracy，precisionandotherperformanceindexesofthereagentwereallinlinewiththeproductregistrationstandard．Thetestresultsofproductregistrationwerequalified．Clinicaltrialsshowedthattheperformanceindexesofthereagentcouldmeetthestandardrequirement．Comparedwiththetestingresultsofcontrastproducts，thedifferencehadnostatisticalsignifi-cance（P＞0．05），whilesignificantcorrelationwasfoundbetweenthereagentandthecontrastproductintwogroupsoftestval-ues（P＜0．001）．ConclusionThedesignofserumcardiactroponinⅠnanolatexenhancedimmunoturbidimetryisreasonableandtheperformanceindexescanmeettheclinicalrequirements．Thismethodcannotonlymeetthedetectionneedoflargenum-berofsamplesinlargehospitals，butalsosatisfythelaboratorydeterminationinordinarygrass－rootshospitalequippedwithbi-ochemicalanalyzer，worthyofpopularizationandapplication．
KeyWords：CardiactroponinI；Nano－latexparticles；Performanceindex；Immunoturbidimetry
*
肌钙蛋白Ⅰ（cTnⅠ）是心肌肌钙蛋白（cTn）的三
cTnT等组成肌钙蛋白复合体，个亚基之一，与cTnC、
是表达心肌收缩功能的一组蛋白。当心肌损伤或坏死时，因心肌细胞通透性增加和（或）cTn从心肌纤维上降解增加而导致血清cTn增高。其中cTnT和cTnⅠ是心肌特有的抗原，前者呈迅速而短暂性升高，后
因此检测血清cTnⅠ浓度可反应心者呈持续性升高，
肌损伤的情况，并以其高灵敏度和特异性成为评价心
［1］
肌损伤的确定性标志物。目前cTnⅠ已取代肌酸激酶同工酶（CK－MB）成为急性冠状动脉综合征
基金项目：金华市科学技术研究计划项目（2010－1－110）作者简介：方兴（1973－），男，硕士，副主任技师，主要从事生物化
学及检验技术及医疗卫生管理。
（ACS）的首选心脏标志物［2］。本研究应用新型的纳
米胶乳颗粒包被cTnⅠ单克隆抗体，根据胶乳增强免疫比浊法的基本原理，研发了血清cTnⅠ检测试剂盒，并顺利取得了医疗器械产品注册证（浙食药监械准字2010第2400347号）。1
材料与方法
1．1材料甘氨酸（分析纯）、新型纳米胶乳颗粒：粒
cTnⅠ单克隆径为50nm～80nm和120nm～200nm、
抗体等。
1．2方法本试剂反应体系按双试剂法设计，所有生产过程均在10万级洁净车间进行。试剂Ⅰ：0．1mol/L甘氨酸缓冲液，以称量法配置，用5．0mol/LNaOH或2．0mol/LHCl调节酸碱度（pH）至7．5。试
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剂Ⅱ：吸附抗人cTnⅠ的胶乳颗粒溶液。试剂Ⅱ制备在一定浓度的甘氨酸缓冲液中，通过pH、磁力搅拌、高速离心时间、超声、冰浴等条件的控制，用cTnⅠ单克隆抗体和新型纳米胶乳颗粒进行化学交联。
1．3分析性能指标该产品企业注册标准规定的主要性能指标包括：空白吸光度≤1．500；线性范围：0μg/L～25μg/L，r≥0．990；分析灵敏度△A≥0．005/20μg/L；准确度：相对偏差（Bias）≤10%；测量精密度CV≤7．0%；批间差≤10．0%。
1．4检验检测（1）生产企业质量自检：生产批号20090622，仪器：全自动生化分析仪，型号：7020，生产厂家：日本HITACHI公司。cTnⅠ校准品：罗氏校准品，批号：180122－01。cTnⅠ质控品：贝克曼质控品，批号：M705513。（2）产品注册检验委托浙江省医疗器械检验所，送检试剂批号：20090622，检测项目：全性能检验。（3）产品临床试验委托国家药物临床试验
表1
出厂检验结果注册检验结果结果判定
均匀液体均匀液体合格
0．830．65合格
机构：温州医学院附属第一医院和温州医学院附属第二医院进行。送检试剂批号：20090803，试验项目：对比试验。对比试验的产品选用市场上普遍认为质量比较好的产品，对比产品名称：肌钙蛋白Ⅰ测定试剂盒，批号：20090922，生产厂家：太原市川至生物工程有限公司。试验过程严格按照相关仪器设备标准操作规程进行检测，应用常规质量控制方法进行质量控制。
1．5统计学方法主要包括Bias、变异系数（CV）、配对t检验、相关性检验等统计方法和指标，以P＜0．05为差异有统计学意义。2
结
果
2．1产品出厂检验结果与产品注册检验报告结果见表1。8个检验项目的检测结果均符合注册产品标准规定的要求。
血清肌钙蛋白Ⅰ检测试剂盒出厂检验结果与产品注册检验报告结果
0．824．19合格
2．412．43合格
0．3245
0．4870合格
0．09180．0727合格
r=0．99981．46
r=0．9999合格
1．89合格
注：表1注册检验结果数据摘录浙江省医疗器械检验所检验报告，报告编号：Z20100024。
2．2临床试验报告结论①送检产品与对比产品在具体结果见表2。产品性能方面均符合标准要求，
②对样本测定的配对检验结果表明，送检产品与对比产品检测结果的量值差异无统计学意义，温附一医院
P＞0．05；温附二医院的配的配对t检验：t值0．0070，
2
温附一温附二
送检产品对比产品送检产品对比产品
0．073
0．0720．0370．035
P＞0．05。③经过相关性检验对t检验：t值0．1568，
送检产品与对比产品检测结果的两组测试数值表明，
差异具有统计学意义，温附一医院的相关系数r=0．9785，P＜0．001；温附二医院的相关系数r
=0．9919，P＜0．001。
0．781．590．244．70
r=0．9997
r=0．9997r=0．9996r=0．9983
0．020．040．260．12
符合符合符合符合
注：表2数据摘录体外诊断试剂临床试验总报告，报告编号：温附二20091201。
3讨论
cTnⅠ是临床实验室最常见的生化检验指标之
。一，被认为是诊断急性心肌梗死（AMI）的“金指标”
在监测缺血再灌注和估计梗死面、预测不稳定型心绞
围手术期心肌损伤监测等方面都具有较高痛（UAP）、
的价值，其灵敏性和特异性均高于心肌酶，尤其对微小的、小灶性心肌梗死的诊断更有价值。cTnI水平增高的患者与cTnI水平稳定或降低的患者比较有更高
［3，4］
。目前国内外检测cTnⅠ方法主要包括的死亡率
金标法、胶乳增强免疫比浊法等。其中化学发光法、
化学发光法的优点是灵敏度高、准确度好，缺点是需要专用的设备，而且试剂成本高，测定过程相对繁琐。金标法的优点是方法简单快捷、不需要专用设备，缺点是只能定性或半定量。胶乳增强免疫比浊法是一种只要具备合适的试剂即能在普通生化分析仪上实现自动定量检测的技术和方法，试剂成本相对较低，
［5，6］
。灵敏度和准确度能满足临床需求
（下转第969页）
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直接测量标本，而不需要任何的稀释、浓缩或其他预处理等非通常检测过程部分，分析物值的范围。实验数据的精密度是线性验证成功的前提，所以有必要对实验数据进行误差量化以判断其可接受性，本实验中
各浓度的混合物各浓度所测值的变异系数均＜5%，
系统误差加上2倍的方法不精密度也均＜10%，数据完全符合要求，如果重复实验精密度不好，则须重做
当重复次数＞3次，而精密度不好时，此浓度的实验，
应做离群值检查，剔除离群值后计算观其CV值有无
b、r均符合要求，改善。本实验分析后所得a、则可证
实本检测系统检测E2的分析范围为0pg/ml～
b存4680pg/ml，并在此范围内具有直线线性。若a、
在较大差异，则试着舍去某组数据，若缩小分析范围
a、b均符合要求，回归式有明显改善，则缩小的分后，
析范围是真实的分析测量范围。本实验的数据分析较繁琐的CLSIEP6－A2方案有较大改善。做线性评价实验时，混合血清中的低值的基础浓度要尽可能低，才能使评价结果客观，因为高的基础浓度会加大线性回归中的截矩，因此对低值的选择最好是接近检测限或0水平，也有专家建议取功能灵敏度附近的值，因为这样提高了系列浓度的准确性；高值的浓度
否则即使在小的范水平应高于厂家提供的范围上限，
也不能充分证实厂家分析范围的可靠围内验证成功，
性。对于超出线性范围的检测值，可通过最大稀释度结合功能灵敏度和AMＲ上限来确定CＲＲ。本实验首
除了10倍先对各个梯度数据的可靠性进行了分析，
稀释外，其它浓度重复性均＜5%，所选择的2个浓度
所以确的样本在8倍稀释内均有满足要求的回收率，
定最大稀释倍数为8倍，本实验室BECKMANDXI800化学发光检测系统检测E2的临床可报告范围为
16．85pg/ml～37440pg/ml，范围较宽，可满足临床需要。功能灵敏度是检测系统在实验室条件下所能定量报告的最低浓度，可作CＲＲ的下限，作者认为万腊
［7］
根等人用LOQ作为CＲＲ下限值欠妥，因为大于检测
但是方法还不低限的响应信号说明样品内有分析物，
能正确报告定量结果，不能将此结果报告给临床，所以作者认为LOQ只能作为AMＲ的下限，并建议E2在16．85pg/ml以下时应报告＜16．85pg/ml，或者以实测值附上不确定度的方式报告临床，如此更为科学。
本研究所选用的可报告范围评价方案及提出的实验建议具有很强的操作性和实用性，对化学发光法
AFP、HCG等的可报告范围评定量检测项目如孕酮、
价有一定指导意义。
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收稿日期：2013－11－06
（上接第966页）
在本研究中，应用了2种不同粒径（50nm～80nm和120nm～200nm）的新型纳米胶乳颗粒，纳米微球表面具有一定数量的氨基和羧基；同时选用2株亲和力强、有高度特异性的cTnⅠ单克隆抗体进行包被，在合适的缓冲液中，通过化学交联的条件控制（包括缓冲液浓度、pH、磁力搅拌、高速离心时间、超
。当冰浴等）制备成“吸附抗人cTnⅠ胶乳颗粒”声、
“吸附抗人cTnⅠ胶乳颗粒”血清样本中的cTnⅠ与表相邻的胶乳颗粒彼此交联，使测量溶面的抗体结合，
液浊度增加，在500nm处读取吸光度，与标准曲线比较计算出样本中cTnⅠ的含量。实验表明，不同粒径
高度特异性cTnⅠ的新型纳米胶乳颗粒和亲和力强、
单克隆抗体的应用，提高了检测灵敏度，同时使反应更稳定。在研发过程中，该试剂的空白吸光度、线性范围、分析灵敏度、准确度、测量精密度等性能指标均达到了设计要求。企业的质量自检结果、产品注册检
产品临床试验结果均达到了产品注册标准的验结果、
要求，完全能满足临床试验室的需求。
本试剂的成功研发，既可满足大型医院大批量样
又能满足配备了普通生化分析仪的各级基本的检测，
层医院的实验室测定需求，可产生良好的社会效益和经济效益。
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收稿日期：2013－10－23