免疫组化的流程
多聚赖氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution）
Cat.No.: SGP8920 Size: 10ml
Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃
Thimerosal, 0.01%, added as preservative
多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。
适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。
[使用说明]
免疫学
操作步骤（可直接在玻片上涂布）
1． 灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。
2． 用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃
3． 将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。
4．在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。
[注意]
1． 每100mL 已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张， 超过90张片子将影响其黏合力。
2． 用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。
4． 释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。
5． 用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。
[订货信息]
￥100 / 10ml
免疫组化操作规程
（一）、仪器设备
1）18cm 不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；
2）水浴锅
（二）、试剂
1）PBS 缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB ，pH6.0，1000ml ）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。 3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml 水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH 调至pH8.0, 加水至1000ml 。
4）1mol/L的TBS 缓冲液（pH8.0）：在800ml 水中溶解121gTris 碱，用1N 的HCl 调至pH8.0, 加水至1000ml 。
5）酶消化液： a 、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b 、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N 的HCl 配制。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱剂：
a 、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
b、油和TBS(或PBS) 配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
（三）、操作流程
1、脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
2）无水乙醇中浸泡5分钟；
3）95%乙醇中浸泡5分钟；
4）70%乙醇中浸泡5分钟；
2、抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复
（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA （pH8.0）或0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M 枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR ，Bax ，Bcl-2，C-fos ，X-jun ，C-kit ，C-myc ，E-cadherin ，Chromogranin A，Cyclin ，ER ，Heat shock protein，HPV ，Ki-67，MDMZ ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein ，PKC ，PR ，PCNA ，ras ，Rb ，Topoismerase Ⅱ等。是以高温，高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。甲醛和蛋白水解交联过程中氨基酸侧链上的某些基团(抗原决定簇) 如咪唑、吲哚等基团受到影响，通过120℃高温或强碱处理后，可使交联打开。
2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen ，Complement ，Cytokeratin ，C-erB-2，GFAP ，LCA ，LN 等。
3、免疫组织化学染色
SP法
1）脱蜡、水化；
2）PBS 洗2～3次各5分钟；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA 上，室温静置10分钟；
4）PBS 洗2～3次各5分钟；
5）抗原修复；
6）PBS 洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液, 室温20分钟。甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl ，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS 洗3次各5分钟；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl ，室温静置，或37℃1小时；
12）II 抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS 洗3次各5分钟；
14）DAB 显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
15）PBS 或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC 法
1)脱蜡、水化。
2)PBS洗两次各5分钟。
3)用蒸馏水或PBS 配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4)抗原修复。
5)PBS洗5分钟。
6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
7)滴加Ⅰ抗, 室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8)PBS洗三次每次2分钟。
9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。
11)滴加试剂SABC ，20℃～37℃20分钟。
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色：DAB 显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。
免疫组化实验过程中的要点和技巧
1． 固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但
对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。 有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml ，甲醛250ml ，冰醋酸50ml ，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP 液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃ 过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存
6．脱片问题： Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸) 为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml 的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml 的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES 和Poly-L-Lysine ）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP 系统：3%双氧水灭活；AP 系统：3%HAc灭活。
8．暴露抗原：对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体
说明书) 。对于不同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。
9．封闭：在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭
10．抗体稀释：应遵循“现用现配”的原则，对于PBS 稀释的抗体一定要当天使用。
11．背景高：在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰ Tween20的PBS 洗，特别是在显色之前要多洗。
12．返蓝：在苏木素复染后，可用碱性缓冲液（如PBS ）或Na2HPO4的饱和溶液返蓝。
13．显色：一定要在显微镜下观察，注意控制背景。
DAB 法 显示过氧化物酶
〔原理〕 过氧化物酶分解H2O2的过程中，下面反应不直接发生：AH2（供氢体）+H2O2→A （供氢体的氧化物）+2H2O2实验可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶——底物（受氢体）复合体生成，在复合体最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的供氢体应是含有色原性基团的发色物质，如奈酚和联苯胺。
免疫组化染色步骤（以ABC 法为例）
溶液的配置：
1. 0.1M PBS 2000ml：NaCL 18g, NaH2PO 4·2H2O 0.8g, Na 2HPO 4·12H2O 12g. 共六份
2. 柠檬酸盐缓冲液：
贮存液：0.1M柠檬酸溶液（A）：21.01g 柠檬酸 + 1L 蒸馏水
0.1M柠檬酸三钠溶液（B）：29.41g 柠檬酸三钠 + 1L 蒸馏水
工作液：9ml A液+41ml B液+450ml 蒸馏水→0.01M 柠檬酸盐缓冲液
3. 0.03% H2O 2-甲醇：30% H2O 2 0.4ml + 400ml 纯甲醇→充分混匀
4. 20% 甘油：80ml 纯甘油 + 320ml 蒸馏水
5. 稀释抗体：1︰300 ，1︰400 ，1︰600 （临用前配）
6. 酒精的配置
染色步骤：一步法
1. 载玻片 烤箱中 60℃ 40′。
2. 二甲苯Ⅰ，60℃ 20′(水浴箱中) ，二甲苯Ⅱ，室温 15′。
3. 脱水，100%→95%→85%→75%酒精，每级均为3′。
4. 蒸馏水冲洗，PBS 5′﹡1
5. 微波炉修复抗原：0.01M 柠檬酸盐缓冲液，99℃ 肺 20′，心肾 12′
6. PBS 3′*3
7. 0.03% H2O 2-甲醇，室温20′
8. PBS冲洗，PBS 3′*3，甩干或纸巾吸去多余液体（勿碰到组织），PAP Pen划境线。 9. block solution 封闭抗原，室温10′。
10. 倾出封闭液，不洗，滴加一抗（60ul ），4℃过夜或37℃ 1～2h。
11. PBS冲洗，3′*3。
12. 除去PBS ，滴加A 增强剂，室温25′。
13. PBS冲洗，3′*3。
14. 除去PBS ，滴加B 剂，室温35′。
15. PBS冲洗，3′*3。同时配置DAB 显色剂。
16. 除去PBS ，DAB 显色10′（在显微镜下观察染色程度控制染色时间）。蒸馏水冲洗。
17. 复染：苏目素均匀滴加2滴，40′′，蒸馏水冲洗，60℃温水泡半分钟。
18. 脱水：75%酒精→85%→95%→100%（3次），每级3′。
19. 透明：二甲苯Ⅰ3′，二甲苯Ⅱ3′。
18. 封片：中性树脂，加盖玻片（组织部位切勿残留小气泡），60℃ 0.5h烘干。 结果：棕褐色反应产物代表抗原X 的定位。
拍照
1. 更换样品时，除了调整焦距和视野外，显微镜上的其他部件都不能动！所有的样品必须一次拍摄完全。特别是在拍摄过程中，不要一会用高倍镜，一会用低倍镜，来回切换物镜。
2. 数码相机必须设置为手动曝光，并且保持每张照片用同样的曝光条件，同样的曝光时间，同样的光圈。特别要注意的是，一定要将数码相机的自动白平衡功能给关掉
3. 免疫组化切片一般染色不太深，因此拍摄出的照片颜色较浅，就让它浅。拍摄出的照片中空白部位应尽可能呈现纯白色。测量其灰度应在250左右。如果呈现淡蓝色，一般是相机自动白平衡在起作用。另外一个因素是显微镜灯光电压不正确。要使灯光本身的色温正确。既不偏黄，也不偏蓝。