冰冻切片制作方法与注意事项
一、固定：
固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。
固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。
固定液分为单纯固定液和混合固定液。单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。
固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。
【注意事项】
1. 固定要及时。
2. 组织块的大小要合适。
3. 应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。
4. 固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。
5. 要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。
6. 选择合适的固定液。
7. 一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。
二、脱水
脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。 本实验所用的是乙醇脱水。乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。 脱水时间视组织块大小、性质和类型而定。
【注意事项】
1.脱水必须彻底，组织块只有脱水充分才能在透明剂中有良好的透明，也有利于染色。脱水须在有盖子的瓶中进行，高浓度乙醇易吸收空气中的水分。
2.脱水剂的用量不能太少，应为组织块的5~10倍以上，并及时更换。
三、透明
在切片制作过程中有两次透明，第一次是脱水以后组织块的透明，第二次是染色以后切片的透明。二甲苯是最常用的透明剂。它是一种无色透明的液体，容易挥发，透其明能力强，但易使组织收缩变脆，所以组织块在二甲苯中不宜久留。
【注意事项】
1. 透明剂的用量不能太少，应为组织块的5~10倍以上。
2. 透明过程中用的器材如镊子必须干燥，不得将水滴入二甲苯中。
3. 二甲苯是一种易挥发的有毒气体，长期接触对呼吸道粘膜等有刺激作用，所以
在使用时应在盛二甲苯的容器上加盖盖子。
四、组织切片（冰冻切片法）
操作程序：
1. 切片前先安装好刀片，调整好切片厚度及切片角度。根据标本的组织类型，确定最
佳切片温度。
2. 将待切的组织块平放在软塑瓶盖或特质小盆内，直接或涂敷包埋剂后马上放到冷冻
台上冷冻。
3. 将冻好的组织块安装到组织块夹持器上，调整好刀片与组织块之间的角度和距离，
调整好防卷板的位置和角度。
4. 准备好后，转动切片机旋转轮的手柄进行切片。将切好的切片黏附在载玻片上，室
温下自然晾干1-2小时后可根据不同的需要进行固定、染色等制片步骤，也可用锡纸包好后封存于-20C摄氏度冰箱中待用。
【注意事项】
1. 切片时恒冷箱内的适宜温度是-20—-15摄氏度。
2. 为防止组织中形成冰晶而影响细胞的形态，甚至破坏细胞的结构，在组织冰冻时要
采用速冻的方法。
3. 组织块在冰冻时，应根据组织的形状和结构来放，切片也是如此。
4. 切片时，若发现冰冻过度，可将冰冻组织块取出在室温下放置片刻再切片。
五、染色（HE染色）
（一） 染色试剂配制
1.苏木精染液苏木精染液是常用的一种燃料，主要用于对细胞核的染色。苏木精本身与组织的亲和力很弱，HE染色实际是通过苏木精的氧化物—苏木红对组织细胞进行染色。苏木精可通过自然和化学方法两种方式氧化成苏木红。自然方法是将苏木精溶液爆率在阳光下或空气中。化学方法是将化学氧化剂加入苏木精溶液。 Harris苏木精配方：A液（苏木精1g，无水乙醇10ml），B液（钾明矾20g，蒸馏水200ml），氧化汞0.5g，冰醋酸8ml。
配制方法：想将A液搅拌溶解，再将B液煮沸融化去火。将A液缓缓加入B液，混合后煮沸约1分钟。离火后在该混合液中加入氯化汞，用玻璃棒充分搅拌至染液变为紫红色，冷却后加入冰醋酸混匀，过滤后即可使用。
2.伊红染液伊红是一种煤焦油染料，是细胞质较为想的染色剂。常用的是1%伊红
醇溶液。其配方是在95%乙醇100ml中加入1g伊红，玻璃棒搅拌均匀。
3.1%盐酸酒精分化液 36%-38%的盐酸1ml加入75%乙醇99ml中混匀即可。
（二） 染色过程
1． 切片进入苏木精染液5-30min（根据不同需要和颜色情况决定染色时间）。
2． 自来水洗去浮色。
3． 1%盐酸酒精分化数秒。
4． 自来水冲洗半小时以上，是切片蓝化。
5． 蒸馏水洗。
6． 如伊红染液复染1-10分钟，使细胞质染成红色。
7． 按顺序经95%乙醇ǀ、ǁ中脱水兼分化伊红颜色各1min。
8． 入无水乙醇中彻底脱水4-5min（ǀ、ǁ各两分钟左右）。
9． 1/2二甲苯（无水乙醇：二甲苯=1:1）1min。
10.二甲苯ǀ、ǁ透明，每次各约2-3min。
11.封固切片
（三）染色结果
细胞核被苏木精染成鲜艳的蓝色，细胞质、结缔组织和嗜酸性颗粒等被伊红染成不同程度的
红色，红蓝相应色彩鲜明，对比明显。
【注意事项】
1. 掌握好染色时间和分化时间。
2. 自来水冲洗过程中应注意不要用水直接冲自组织。
3. 切片染色后用乙醇脱水应从低浓度到高浓度进行。