发布日期:2010-10-20 热门指数:3164 分享
| 收藏
A．siRNA转染的方法
哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面：
1. 转染试剂的用量
2. siRNA的用量
3. 转染时的细胞密度
4. 转染时的操作顺序
5. 细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间
B． SiMi Transfection Reagents 转染试剂
选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。SiMi Transfection Reagents适用于核酸的体内和体外操作，可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染，也可应用于DNA/siRNA的共转染操作；是一种新型的高效siRNA转染试剂。
SiMi Transfection Reagents的应用领域：
1. 原代培养细胞和转化细胞株的基因转染
2. siRNA高通量转染试验
3. DNA转染；DNA和siRNA的共转染
4. 核酸（siRNA、DNA、RNA）的体内导入试验
5. 贴壁细胞和悬浮细胞转染
SiMi Transfection Reagents 的特点：
1. 不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作
2. 在含血清培养基中也能表现高转染效率
3. 细胞毒性低；适用细胞广泛
4. 即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染
5. 基于脂质的转染试剂，确保没有RNAse活性
6. 可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入
C．SiMi Transfection Reagents适用的细胞类型
SiMi Transfection Reagents转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如：HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。
D．转染前细胞培养
在细胞板上培养细胞时，应使细胞汇合在24小时内达到70-90%。
细胞培养用品
表面积（mm2/孔）
细胞密度
培养基（μL /孔）
96孔板
50
1.5′104-5.0′104
100μL
48孔板
100
3.0′104-1.0′105
200μL
24孔板
200
8.0′104-2.0′105
500μL
12孔板
401
1.6′105-4.0′105
1.0 mL
6孔板
962
3.0′105-8.0′105
2.0 mL
35 mm
962
3.0′105-8.0′105
2.0 mL
60 mm
2827
1.0′106-2.5′106
6.0 mL
E. 合适的SiMi Transfection Reagents用量
合适的siRNA(DNA)：lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响；我们推荐的DNA：lipofetamin2000为1：0.5—1：5（ug:ul），siRNA：SiMi Transfection Reagents为1：0.01-1：0.1（pmol：ul）一般情况下，此范围内都可获得高的转染效率。
细胞培养用品
siRNA/DNA
培养基最终体积
SiMi Transfection Reagents(siRNA/DNA)
96孔板
5pmol/0.2μg
100μL
0.25μl/0.5μl
24孔板
20pmol/0.8μg
500μL
1μl /2μl
12孔板
40 pmol /1.6μg
1 mL
2μl /4μl
6孔板
100 pmol /4.0μg
2 mL
5μl /10μl
35 mm
100 pmol /4.0μg
2 mL
5μl /10μl
60 mm
600 pmol /8.0μg
5 mL
10μl /20μl
F．贴壁细胞转染程序
选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很重要。siRNA(DNA)和SiMi Transfection Reagents的用量和两者的比例可在推荐范围内适当调整。
1. 转染前一天，4-5?104细胞接种在24孔板上， 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培养基）细胞培养基。
2. 选择用于初期接种的细胞数量，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
3. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀；
4. 混匀SiMi Transfection Reagents试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl SiMi Transfection Reagents试剂（DNA转染时，则加入2μlSiMi Transfection Reagents试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟；
5. 将稀释好的siRNA和SiMi Transfection Reagents试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）复合物。
6. 将100μl siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板板。
7. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。
G．悬浮细胞转染程序
1. 转染的当天，收集细胞离心，用含FBS的培养基重悬。
2. 在50μl的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀；
3. 混匀SiMi Transfection Reagents试剂，用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl SiMi Transfection Reagents试剂（DNA转染时，则加入2μl SiMi Transfection Reagents试剂），轻轻混匀，室温放置5分钟；
4. 将稀释好的siRNA和SiMi Transfection Reagents试剂混合；轻柔混匀，室温放置20分钟,以便形成siRNA/SiMi Transfection Reagents（或DNA/SiMi Transfection Reagents）复合物。
5. 再加入400μL细胞悬浮液（细胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间）。
6. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6小时后，除去复合物，更换培养基。
H．DNA和siRNA共转染细胞程序
1. 在转染的前一天，4-5?104细胞接种在24孔板上，0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。
2. 选择用于初期接种的细胞密度，应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
3. 在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA，加入2μl SiMi Transfection Reagents试剂，充分混合，放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents复合物。
4. 将siRNA/ DNA/SiMi Transfection Reagents复合物加入培养基中，轻轻混匀。
5. 细胞在37℃温育24h-48h后，进行转染后的其它步骤。
I．siRNA体内导入方法
1. 适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中，轻轻混匀，因为注射液体积有限，建议采用高浓度的siRNA或DNA，一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。
2. 取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与SiMi Transfection Reagents混合。例如，在1#管中加入0.5μL的DNA（1μg）和0.5μL的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL的SiMi Transfection Reagents（24μg）和0.45μL不含RNA酶的无菌水中，将1#管中的溶液加入2#管中，在室温下温育30分钟，以形成siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagents复合物。
3. 制备的siRNA/DNA-SiMi Transfection Reagentse复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。