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雷帕霉素靶蛋白在ⅢB期结肠癌中的异常表达及其意义
李宝秀,李春燕,刘国龙,张晓实
[摘要] 目的 探讨肿瘤细胞哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其活化形式磷酸化mTOR(pmTOR)在ⅢB期结肠癌中的表
达情况,分析其与临床病理特征之间的关系及其预后的关系。方法 收集104例有完整随访资料的IIIB期(T324N1M0)结肠癌患者,取肿瘤组织标本,搜集临床资料。采用免疫组化法检测肿瘤组织中mTOR和pmTOR的表达。分析mTOR、pmTOR表达与临床病理特征(性别、年龄、原发肿瘤部位、病理分级、病理类型、TNM分期)间的相关性,并分析其意义。结果 mTOR和pmTOR表达于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质。104例IIIB期结肠癌标本中mTOR和pmTOR的阳性表达率分别为7519%(79/104)和7619%(80/104)。偏相关分析显示,肿瘤组织mTOR及pmTOR表达与患者的临床病理特征无相关性,mTOR和pmTOR表达不影响患者的总生存,亚组分析提示pmTOR mTOR和pm2
TOR在局部晚期结肠癌患者中存在异常高表达,肿瘤浸润前沿高表达pmTOR [关键词] mTOR蛋白;结肠肿瘤;肿瘤治疗方案
[中图分类号] R735134 [文献标志码] A ()0820961205
Aberrantexpressionofmammalianycincanceranditssignificance
LIBao2xiu,LIChun,,Xiao2shi31DepartmentofOncology,GuangzhouFirstMunicipalGMedicalCollege,Guangzhou510180,China
3CE:zxs617@hotmail1com
[Abstract] Toexploretheaberrantexpressionsofmammaliantargetofrapamycin(mTOR)anditsactivationform,pmTOR,instageIIIBhumancoloncancer,andanalyzetheassociationofmTORandpmTORwithclinicopathologiccharacteristicsandpatients’prognosis.Methods Atotalof104patientswithstageIIIB(T3-4N1M0)coloncancerwithavailablefollow2updatawereenrolled.Thespecimensofcoloncancerandclinicaldatawereacquiredfromthesesubjects.TheexpressionsofmTORandpmTORintumortissuesandmatchednormaltissuesweredetectedwithimmunohistochemistry.TherelationshipanditssignificancebetweentheexpressionsofmTORandpmTORandsomeclinicopathologicalfeatures,suchasgender,age,locationofprimarytumor,pathologicalstageandTNMstage,wereanalyzed.Results ThemTORandpmTORwerefoundtobeexpressedincellmembraneandcytoplasmoftumortissues.Outofthetotal104specimens,positiverateofmTORandpmTORaccountedfor7519%(79/104)and7619%(80/104),respectively.NosignificantcorrelationwasnotedbetweentheexpressionsofmTORandpmTORandtheclinicopathologicalfeaturesbypartialcorrelationanalysis.BothunivariateanalysisandmultivariateanalysisshowedthattheexpressionsofmTORandpmTORthrewnosignificantinfluenceonthe52yearoverallsurvivalofpatients.Nevertheless,subgroupanalysissuggestedthatahighexpressionofpmTORalongtumorborderwaslikelytocontributetohigherriskofdeathinpatients.Conclusion AberrantexpressionsofmTORandpmTORarenotedinpatientswithlocallyadvancedcoloncancer.HighexpressionofpmTORalongtheborderoftumortissuemaysuggestthepossibilityofinvasionandmetastasis.
[Keywords] mTORprotein;colonicneoplasms;antineoplasticprotocols
目前我国结直肠癌的发病率已上升至常见肿瘤的第4位,且好发年龄比国外报道早10～15岁。即使接受新的化疗药物与分子靶向药物联合治疗,晚期结直肠癌患者的生存期也仅能延长至26个月,在治疗进入平台期时,大部分患者的疾病进展直至死亡。所以,寻求新的方法控制结直肠癌的进展是提高疗效、改善预后的关键。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian
[基金项目] 2010年华南肿瘤学国家重点实验室开放基金
[作者简介] 李宝秀,医学硕士,主治医师。主要从事肿瘤化疗与生物
targetofrapamycin,mTOR)是一种对细胞生长和增殖
都至关重要的丝、苏氨酸蛋白激酶,mTOR信号通路是
细胞内重要的生存信号转导通路,该通路的激活与肿瘤细胞的增殖、分化、逃避凋亡、耐药及血管生成密切相关[122]。本研究观察肿瘤细胞mTOR及其活化形式磷酸化mTOR(pmTOR)在ⅢB期结肠癌中的异常表达情况,分析其与临床病理特征及预后的关系,为分子靶向治疗提供实验依据。1 材料与方法
111 一般资料 中山大学肿瘤防治中心1997年1月
治疗的研究。已发表论文10余篇
[作者单位] 510180 广州 广州医学院附属广州市第一人民医院肿瘤科(李宝秀、刘国龙);400000 重庆 重庆医科大学附属第一医院生物治疗科(李春燕);510060 广州 华南肿瘤学国家重点实验室中山大学肿瘤防治中心(张晓实)
[通讯作者] 张晓实,E2mail:zxs617@hotmail1com
至2003年8月接受根治术的结肠癌患者104例,所有
病例经病理学确诊,随访资料完整,均为ⅢB期(T324N1M0)。记录患者的临床病理资料,包括性别、年龄、原
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发肿瘤部位、病理类型、病理分级、TNM分期。患者术
前均未接受放、化疗。取患者结肠癌组织及相应的近癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5cm)的样本各1份。104例患者中,男66例、女38例;年龄≥60岁者56例,
μμ体(1∶50)50l,4,滴加二抗50l,DAB显色5～
10min,苏木精复染,封固、镜检、拍照。用试剂公司提供的阳性切片作为阳性对照,以一抗稀释液代替一抗作为阴性对照。
结果评价标准:采用双盲法,由两位有经验的病理科医生读片,每张切片选择5个有代表性(细胞总数>1000个)的高倍视野。主要根据阳性细胞在全部组织细胞中所占比例以及阳性细胞染色强度来判定实验结果:①阳性百分数(阳性细胞总数/视野内细胞总数):75%(4分)。②染色强度:无染色为阴性(0分),淡黄色为弱阳性(1分),黄色为中度阳性(2分),深棕色(黄褐色,颜色偏深)为强阳性(3分)。将阳性百分数得分与染色强度得分相乘,乘积为0～1分记为(-);2～3分记为(+),4～5分记为(6),6分以上记为(7)。乘积总分≤3分判断为阴性,>3分判断为阳性[3]。
114 随访 所有病例均有住院部或门诊记录,通过电
话或信函的方式,严格按照美国国立综合癌症网络(NCCN)指南的方案进行严密随访5年以上。随访中断作为删失数据,总生存时间为疾病确诊至死亡或末次随访的时间间隔。随访截止时间为2008年8月,死亡患者以死亡日期作为截止日期,中位随访时间为65(9～102)个月。115 相关性分析 ①分析ⅢB期结肠癌患者临床病理特征(性别、年龄、原发肿瘤部位、病理分级、病理类型、mTOR表达、pmTOR表达、TNM之间的相关性,以及mTOR5年生存率的511 SPSS1510软件进行统计学处Kendall’stau2b非参数相关性检验。生存分析采用Kaplan2Meier法并采用log2rank法对结果进行显著性检验。多因素分析采用Cox比例风险回归模型,运用偏最大似然估计的前进法(ForwardLR)对变量进行筛选,分析影响ⅢB期结肠癌患者预后的因素。P
211 mTOR、pmTOR的表达情况 mTOR和pmTOR
蛋白表达于肿瘤细胞的胞膜和胞质。104例肿瘤标本中,mTOR和pmTOR表达阳性的标本分别占7519%(79/104)和7619%(80/104)。癌旁正常肠黏膜组织mTOR和pmTOR染色阴性(图1、2)。肿瘤组织中同时高表达mTOR和pmTOR者76例,仅mTOR高表达3例,仅pmTOR高表达4例。肿瘤浸润前沿高表达pmTOR的标本28例,肿瘤中心高表达pmTOR的标本39例,两部位均有高表达pmTOR13例。212 mTOR、pmTOR表达与临床病理特征间的相关性 Kendall’stau2b非参数相关检验发现,104例ⅢB期结肠癌标本中,mTOR与pmTOR呈高度正相关(r=01776,P=01000)。病理类型与病理分级呈正相关(r
=
图1 mTOR在ⅢB期结肠癌标本中的表达(非生物素二步法×200)
A1癌组织;B1癌旁正常黏膜
Fig11 ExpressionofmTORinstageⅢBcoloncancer(two2stepenzymeimmunohistochemistryassaywithoutbiotion×200)
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图2 pmTOR在IIIB期结肠癌标本中的表达(非生物素二步法,×200)
A、B1肿瘤浸润前沿;C、D1肿瘤中心
Fig12 ExpressionofpmTORinstageⅢBcoloncancer(two2stepenzymeimmunohistochemistryassaywithoutbiotion×200)
01276,P=01008)。偏相关分析证实,肿瘤组织mTOR及pmTOR的表达与患者临床病理参数(如年龄、性别、
)无相关性(表1)。
表1 mTOR、pmTORTab11 Correlationsoftheexpressionofcharacteristcsofpatientswithcoloncarcinoma变量
性别
116012721
- [***********][1**********]9-0104601664-010210184-0112401243
[***********]741--[***********]02-0108901399-010160188-0107101502
[***********]49-[1**********]-0127601008-0102601803-[***********]21
病理类型
-[***********][***********]10081
mTOR表达010101927-0104601664-0108901399-[***********]611--[**************]0
TNM分期-0106101564-010210184-010160188-0102501812-0111501276-[1**********]--0104701655
pmTOR表达
0111301286-0112401243-[***********][***********]-[1**********]
-
性别 r1 P-年龄 r01116 P01272原发肿瘤部位 r01033 P01758病理分级 r01111 P01293病理类型 r-01113 P01286mTOR表达 r0101 P01927TNM分期 r-01061 P01564pmTOR表达 r01113 P01286 注“:-”示无数据;r为相关系数
-0107801461-[***********]99
213 ⅢB期结肠癌患者5年生存率影响因素的单因素
生存分析 在随访过程中,3416%的患者在5年内出现复发转移而死亡,本组患者的5年总生存率为6514%。所有指标均采用Kaplan2Meier分析法并用log2rank法绘制患者的生存率曲线(图3)。单因素生存分析证实,T分期、病理类型是影响5年生存率的危险因素。T3N1M0者的5年生存率为6916%,而T4N1M0者则为3313%(P=01010)。病理类型为管状及乳头状腺癌者的5年生存率为6813%,黏液与印戒细胞癌者的5年生存率为5415%(P=01034)。其他临
床病理参数,如年龄、性别、原发肿瘤部位、病理分级及mTOR,pmTOR的表达情况不影响局部晚期患者的5年生存率;mTOR表达阳性与阴性者的5年生存率分别为6211%与7011%(P=01294);pmTOR表达阳性与阴性者的5年生存率分别为5812%与7014%(P=01295)。但是,年龄
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图3 mTOR、pmTOR表达与ⅢB期结肠癌患者生存率的关系
A、B、C分别示mTOR表达、pmTOR表达、pmTORFig13 AssociationofoverallsurvivalwithmTORandpmTORinⅢB
表2 ⅢB期结肠癌患者5年生存率的单因素分析
Tab12 Univariateanalysisof52yrsurvivalrateinstageⅢBcoloncarcinoma项目性别 男 女年龄 ≥60岁
管状腺癌+乳头状腺癌 黏液癌+印戒细胞癌肿瘤分级 G1 G2 G3
TNM分期
579209212
[1**********]0
01010
69163313
01294
89159817
62117011
01295
58127014
8222
68135415
01183
6341
71145611
01034
5648
75105711
01201
6638
62117111
01068
(n)5)P值
01638
生存时间长。年
,为0135,RR的95%CI为0115～018,P=01013,但其在单因素分析中与生存率无关,所以应予以剔除。此外,性别、原发肿瘤部位、病理分级,mTOR和pm2TOR表达情况与本组ⅢB期患者的死亡率无相关性(P>0105)。3 讨 论
T3N1M0 T4N1M0
mTOR表达
阳性 阴性
pmTOR表达
阳性 阴性
214 ⅢB期结肠癌患者5年生存率影响因素的多因素
分析 Cox比例风险回归模型显示,T分期、年龄和病
理类型是影响预后的独立危险因素。TNM分期的偏回归系数(B)11613,RR为51018,P=01001,RR的95%的可信区间(95%CI)为1195～1219,分期越高死亡风险越大。病理类型的B为01869,RR为21385,RR的95%CI为1102～51559,P=01044,提示病理类型为管
哺乳动物雷帕霉素标靶(mTOR)是一种对细胞的生长和增殖至关重要的蛋白激酶。mTOR激酶复合物由mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2)组成,其中mTORC1的发现早于mTORC2,其作用主要是通过调节蛋白质合成从而影响细胞的生长和增殖,并同时调节线粒体形成,其活性能够被雷帕霉素抑制;mTORC2复合物的活性不能被雷帕霉素抑制,主要参与细胞骨架蛋白的构成[426]。mTORC1及mTORC2都参与Akt信号级联放大反应,而Akt信号通路在许多人类癌症中呈现高度活跃的状态[7]。mTOR信号传导通路控制着众多在肿瘤发生发展中至关重要的细胞生物学过程,包括对细胞自噬、凋亡、增殖、代谢、炎症反应、血管新生以及细胞周期的调控等[829]。该通路在遗传学上的改变和生化条件下引起的激活经常发生在恶变早期和肿瘤进展期。同时,该信号通路的激活程度也是判断肿瘤患者预后的重要指标之一。抑制该信号通路已成为肿瘤预防和靶向治疗的热点[10]。磷酸化mTOR(pmTOR)在很多肿瘤包括乳腺癌、胃肠癌、肾癌、肺癌、神经内分泌肿瘤、淋巴瘤、胶质母细胞瘤和肉瘤、前列腺癌等[11212]中均有报道。mTOR抑制剂已经在部分肿瘤中证实可以抑制肿瘤生长。
本研究发现,mTOR和pmTOR分别在7519%和7619%的IIIB期结肠癌患者中呈现异常高表达。单因素及多因素分析显示,mTOR、pmTOR表达与生存率
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不存在相关性,不影响局部晚期结肠癌患者的预后,这个结论与Tampellini等[13]的报道一致。笔者认为,在局部晚期结肠癌中,mTOR通路的异常活化可能只影响早期和晚期结肠癌的某些生物学行为,如增殖和新生血管形成等。
另外,本研究还发现,pmTOR在肿瘤浸润前沿细胞内的高表达,可以提示患者有死亡率增加的趋势,这是本研究得出的新观点,以往未见报道。同时,肿瘤浸润前沿高表达pmTOR的肿瘤细胞可能易发生浸润、转移,主要与浸润前沿细胞的分化差或增殖力强有关。这与Yu等[14]报道的胃癌中mTOR、pmTOR表达情况有一定的相似,也有一些差别:Yu等证实胃癌中mTOR过表达与肿瘤的分化、TNM分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期肿瘤的进展相关,pmTOR过表达与淋巴结转移和TOR成。过表达在ⅢB期,也与T分期无关。分析原因可能与胃癌、结肠癌在信号传导通路及生物学行为学上存在较大差异相关。
本研究选择ⅢB期结肠癌患者作为研究对象,因为其占局部晚期结肠癌的绝大多数,并且局限在一个亚期可以增加同一性,减少误差及混杂因素,对分析结直肠癌的分子生物学特性有利。由于本研究只能观察到肿瘤浸润前沿高表达pmTOR有增加死亡风险的趋势,扩大样本量后可能会发现统计学差异。这种发现提示结肠癌mTOR、pmTOR的异常表达在结肠癌的发生发展过程中是很重要的事件,pmTOR有望成为新的预测结肠癌患者预后的分子标记物,研发以mTORC1和mTORC2为标靶的mTOR抑制剂可能可以治疗由于mTOR信号异常而引发的结肠肿瘤。
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(收稿日期:2010203213;修回日期:2010206224)
(责任编辑:沈宁)
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