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武警医学院学报
Acta Academiae Medicinae CPAF 第17卷第6期2008年6月 V ol 117 N o 16June 2008
综述
荧光标记技术及其应用的研究进展
R ecent advances on the techniques of fluorescent 2labeling and its application
张桂芬1, 靳 颖1, 张爱民1, 张燕玲2
(11武警医学院附属医院检验科, 天津300162; 21天津医科大学医学检验系生化教研室, 天津300203)
关键词:荧光标化; 自由基; 量子点
【文章编号】 100825041(2008) 0620550203 【中图分类号】 R44611 【文献标识码】 B
在生命科学及现代分子生物学领域里, 研究和应用高灵敏度的非同位素检测方法一直是各国学者共同努力的方向。目前生命科学研究主要集中于核酸、蛋白质等生物大分子的分析中。生物大分子检测的主要方法是标记分析法, 其中发光标记是最主要的方法之一, 检测的灵敏度很大程度上取决于标记物的发光强度和稳定性染料因自身的某些性质限制了其应用范围, 窄、发射光谱宽等[1]。因此, 光量子产率高的将利于促进生物技术的发展[2]。
1 荧光标记染料
体染料, 另一类是多甲川系列菁染[5]。菁染料主要用于标记核酸, 高志宇等[6]研究表明, 在喹啉环氮上引入适当的亲水性取代基, 领域、, 。刘晓瑭等[7]以M 2B 4O 7(M =Na , K ) 为基质, 在空气中掺杂稀土元素Eu 3+得到了Na 2B 4O 7:Eu 3+和K 2B 4O 7:Eu 3+荧光体并研究了其光谱特征。
2 荧光标记技术的应用
有关荧光标记技术应用于蛋白质和核酸分析研究中的报道很多, 但实际上这种标记方法在其它物质的检测中同样具有重要的作用。
211 荧光标记多糖[8]
荧光素类和罗丹明类是生物技术中最常用的标记染料, 广泛应用于蛋白质和核酸的检测分析中, 人们对其结构和性能已经有了深入的了解。近年来, 菁染料逐渐受到人们的关注。菁染料是一种比较特殊的染料, 在光照下不稳定。但随着对其性质的深入了解, 以及其它相关技术的发展, 人们开始利用它摩尔消光系数高、光谱范围广且光量子产率高等特性, 将其应用于生物大分子荧光标记[3]。
Lee 等1990年合成了含有苯并噻唑环和嘌呤环的菁染
近30年来, 随着分子生物学及现代分析技术的飞速发展, 作为生命三大物质之一的多糖倍受人们关注。多糖具有许多生物学功能, 但由于多糖组成与结构的复杂性, 致使其结构生物学研究受到极大的限制。
有关多糖荧光标记的研究目前国内外报道较少, 已有的标记方法大多缺乏选择性, 不能很好地反映多糖的生物学性质。Malsch 等[9]用亚硝酸降解肝素, 对低分子肝素进行选择性末端标记, 较好地避免了非选择性标记对肝素内部活性结构的影响。但该方法需要一个自由的末端醛基, 因此不适用于一般多糖和寡糖。
李福川等[8]利用多糖及寡糖具有还原性末端的特点, 将硫酸多糖(911) 还原性末端的半缩醛基, 通过还原胺化反
料, 用于对RNA 进行染色。Wenceslao 等[4]1997年合成了第一个杂环为苯并噻唑、硒唑、咪唑系列, 第二杂环为嘌呤环系的菁染料, 并研究了其荧光特性。菁染料也可以与寡核苷酸探针同时使用, 以显示和定量分析细胞中的特定核酸序列。目前研究比较活跃的标记菁染料主要有两大类, 一类是T O (thiazole orange ) 、Y O (oxazole orange ) 系列及其二聚
【基金项目】天津市高等学校科技发展基金资助项目(020131) 【收稿日期】2007-11-24; 【修回日期】2008-03-19
【作者简介】张桂芬(1981-) , 女, 籍贯天津市, 本科, 技师, 主要从事临床微生物和免疫工作。
应与酪胺(T yr ) 的氨基共价偶联, 硫酸多糖911—T yr 中酪胺引入的仲氨基通过与异硫氰酸荧光素(FIT C ) 进行亲核反应, 实现对硫酸多糖911还原末端的选择性标记。该方法对硫酸多糖911的抗凝活性无明显影响, 也无明显的细胞
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毒性, 适用于具有还原末端的多糖及寡糖的荧光标记。 过程提供了革命性的手段。
212 荧光标记药物[10]
311 量子点的结构特征及其优越性
甲磺酸培氟沙星(pefloxacin mesylate , P M ) 是一种新型喹诺酮类抗菌药, 在pH516的乙酸2乙酸钠缓冲液中, La 3+与
P M 形成络合物, 其荧光强度比P M 增加50%, 且抗干扰能
量子点(quantum dots , QDs ) 又被称为半导体纳米微晶粒
(semiconductor nanoctystal ) , 是一种直径在1～100nm 之间,
能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒, 由Ⅱ2Ⅵ族或Ⅲ2Ⅴ族元素组成, 其中研究较多的是CdX (X =S 、Se 、
T e ) 。量子点的光谱性质主要取决于半导体纳米粒子的半
力与稳定性显著增强。利用该体系的分子荧光特性能直接测定药品与人血清中P M 的含量。
213 荧光标记用于Ca 2+测定[11]
径大小, 而与其组成无关, 粒子越大, 波长越长, 通过改变粒子的大小可获得从紫外到近红外范围内的任意点光谱。被激发的量子点根据其半导体核心直径的不同, 可发射绿色→黄色→橙色→橙红色的荧光。量子点的荧光谱峰狭窄而对称, 半高峰宽通常只有40nm 甚至更小, 这样就允许同时使用具有不同发射光谱特征的量子点来获得多种颜色的荧光。
目前QDs :(1) 是依靠静电。) QDs 包覆一层聚, , 再将抗体、链QDs 上。而应用于生物学QDs 必须具有水溶性, 1998年, Nie 等[16]的研究小组宣布解决了在有机相中生成的QDs 的疏水性问题。将巯基乙醇连到CdS/ZnS 的ZnS 外壳上, 游离在外的羧基使
QDs 具有良好的水溶性, 而且为生物分子的共价偶联提供
钙离子荧光探针是钙螯合剂EG T A 的衍生物, 具有荧光基团, 并有多个羧基作为Ca 2+的结合部位, 与Ca 2+结合后其荧光光谱发生变化。钙离子荧光探针有多种, 如Quin 22、
Indo 21、Fura 22和Fluo 23等。目前应用最多的是Fluo 23。它与Ca 2+亲和力低, 易于解离, 因而提高了时间分辨率。Fluo 23
与胞浆内的Ca 2+结合后产生荧光, 荧光的强度及分布即反映了胞浆内钙离子的浓度及分布。对细胞凋亡的研究发现, 许多凋亡诱导剂都是通过促使细胞内游离钙的升高来激活细胞凋亡的。因此, 通过LSC M 检测细胞内游离钙的变化动态, 可以筛选细胞凋亡的诱导剂和抑制剂, 为肿瘤防治提供一种新的研究方法。
214 12泛关注。・OH 自由基。党亚敏等[12]4222, 2, 6, 62四甲基哌啶氮氧
) 用于标记α自由基(H O -TE MPO ・2萘甲酸获得自旋标记荧光
了连接位点。
312 量子点的应用
31211 标记DNA 和蛋白质:Wu 等[17]成功地用荧光免疫法
探针42萘甲酸酯22, 2, 6, 62四甲基哌啶氮氧自由基(NA 2
) , 并将其用于表征蛋白质和DNA 等氧化损伤所形TE MPO ・
成的活性碳中心自由基。当H O 2TE MPO ・通过酯键结合到萘环上形成自旋标记荧光探针NA 2TE MPO ・后, 其荧光强度急剧下降。NA 2TE MPO ・自身为弱荧光分子, 对・OH 不具备直接捕获作用, 但当反应体系中加入脱氧鸟嘌呤核甘酸(5′2
dG MP ) 后, ・OH 能诱导其损伤产生活性碳中心自由基。NA 2TE MPO ・能与碳中心自由基形成稳定的烷氧胺类化合物, 使
标记了细胞(使用直径在714～10nm 的量子点) , 用疏水的改良聚丙烯酸包被量子点, 使之与免疫球蛋白G 和链霉亲和素相结合, 使其能准确地结合并标记在细胞表面蛋白、细胞支架蛋白和细胞核内的蛋白质上。在Jaiswal 等[18]的实验中, DH LA 包被的量子点被用于标记海拉(HeLa ) 细胞, 培育12d 后还可以看到细胞内的量子点荧光, 且细胞仍具有活性。
31212 生物活体显像:2002年, Dubertret 等[19]将单个量子
体系的荧光强度显著增高。甲酸钠是一种・OH 清除剂, 将起加入上述反应体系中, 可减弱・OH 对5′2dG MP 的氧化损伤作用, 形成的碳中心自由基中间体减少, 表现为自旋荧光标记分子2自由基捕获物减少, 体系荧光强度增量减少。这一结果表明自旋标记荧光探针荧光强度与捕获的碳中心自由基存在一定的定量关系。
3 纳米材料在现代医学领域中的应用[13-15]
点包于磷脂中, 不但能够用于体内及体外成像, 作为特异性DNA 杂交探针, 还可将其注入到爪蟾类的胚胎中观察其胚胎形成的整个过程。
31213 生物芯片:量子点在生物芯片领域的前景也很广。Han 等[20]的研究结果证明, 包入量子点的高分子聚合微球
随着人们对生命现象研究的不断深入, 为了要准确研究生物分子之间的相互作用以及实现对重大疾病的早期诊断, 就迫切地需要在微观尺度上原位、活体、实时地获取被研究对象的信息。纳米标记物的出现为这一信息的获取
可标记寡核苷酸探针或抗体, 用于基因芯片或蛋白质芯片的搜索。理论上使用6种颜色和10种强度的量子点就可以对106个核酸或蛋白质序列进行编码。如要达到精确检测, 不带有任何光谱交叠, 可编码的量子点微粒达到1～4万个
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应该没有问题。人类具有的基因不超过4万个, 该技术可对这些基因探针进行编码标记, 这样, 研究人员就可以很容易地将基因材料样本与已知的DNA 序列进行比较, 还可以找出哪些基因在特定细胞或组织中较为活跃。量子点在研究蛋白质与蛋白质相互作用的芯片中同样意义重大。利用量子点密码微球标记物, 在同一波长的光激发下, 就可同时检测标记蛋白与芯片蛋白之间的相互作用, 实现了双高通量分析检测。
31214 量子点的其它应用:量子点还可应用于溶液矩阵(s olution array ) , 即将不同的量子点或量子点微粒标记在每
=Na , K ) 荧光体极其性质表征[J].高等学校化学学报, 2004, 25(10) :1789-1792.
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综上所述, 新型荧光标记材料的研发及其应用范围的不断拓展, 使人们对生命现象的探索进程又加深了一步, 为人们在微观尺度上观测分子行为提供了强有力的研究工具。随着科学技术的不断发展以及标记材料和方法的不断完善, 人类在生物领域的研究前景将十分光明。
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