水生动物营养
青鱼生长激素基因酵母工程菌发酵条件的研究
谢帝芝1,2 李静静1 刘小青2 刘 臻2 张建设2 鲁双庆2 肖调义1
1.湖南农业大学动物科学技术学院2.长沙学院生物工程与环境科学系
摘 要 为研究青鱼生长激素基因工程菌在豆粕中的发酵工艺，试验采用L25 (56)正交设计探讨温度、pH、培养时间、豆粕质量浓度、接种量和诱导剂质量浓度等6个因素对青鱼生长激素基因工程菌的生长和蛋白表达量的影响。结果表明：各因子对蛋白表达量的影响明显，它们的作用大小依次为发酵时间>pH>接种量>发酵温度>诱导剂质量浓度>豆粕质量浓度，最优发酵组合条件为发酵时间96 h、pH 7、接种量5 %、发酵温度30 ℃、诱导剂质量浓度1 %及豆粕质量浓度6 %。确立发酵工艺后进行10 L发酵罐发酵，活菌数达到79.6亿CFU/mL，青鱼生长激素表达量占总蛋白的28.4 %。
关键词 青鱼生长激素 毕赤酵母 正交试验 发酵条件青鱼生长激素（bcGH）是由脑下垂体前叶分泌的一种单链非糖多肽激素,含有5个外显子和4个内含子,类似哺乳类GH的基因组结构，由211个氨基酸组成,相对分子质量约为23 ku，能促进鱼体生长发育、加速蛋白质的合成及促进脂类降解等。酵母是水产饵料中较为理想的蛋白源。国内外研究表明：酵母培养物可增加动物营养，提高饲料适口性；提高动物对粗蛋白、粗纤维、维生素和矿物质等各种营养成分及能量的消化、吸收和利用，促进生长；调节动物体内微生态平衡，促进肠胃有益菌群的生长，抑制病菌，提高动物免疫力等作用。而且，酵母还是外源基因理想表达受体系统，表达蛋白可以正确折叠和糖基化，具有活性等特性。酵母胞内表达蛋白的分选和区域化，增加了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒害作用。实验室已将bcGH基因整合到高效表达的毕氏酵母，表达产物经SDS-PAGE和Elisa分析，结果表明：青鱼生长激素基因在酵母体内得到高效表达。
试验利用构建好的青鱼生长激素基因工程酵母
收稿日期：2010 - 06 - 29
基金项目：湖南省高等学校重点项目（08A007） ，湖南省高等
学校优秀青年项目（09B011），长沙市科技局重点项目 (K070728—31)，湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（284）
通信作者：肖调义
菌（简称bcGH工程菌）在豆粕中发酵，这不仅能
高效表达bcGH，还能降低豆粕中胰蛋白酶抑制剂、植酸和大豆凝血素等抗营养因子。研究目的在于探讨适宜的发酵条件和稳定的发酵工艺，为生产绿色、安全和高效的新型微生物渔用配合饲料奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料1.1.1 菌种
表达质粒为pPIC3.5K的bcGH工程菌，由实验室构建并保存。 1.1.2 试剂
酵母提取物、胰蛋白胨和琼脂购自Oxoid 公司；丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺购自bio-rad公司；TEMED购自Aldrich 公司；氨苄青霉素和过硫酸铵购自Sigma 公司；抗生素G418和酵母氮源(YNB) 购自Invitrogen 公司；考马斯亮蓝购自Fluka 公司；Protein Molecular Weight Marker购于Fermentas公司；其他试剂均为国产分析纯。1.1.3 培养基
1.1.3.1 MD培养基
15 g/L琼脂粉，高压灭菌20 min，再加入过滤除菌的13.4 g/L酵母基本氮源、20 g/L葡萄糖和0.4 mg/L生物素。1.1.3.2 YPD培养基
10 g/L酵母提取物，20 g/L胰蛋白胨，20 g/L
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琼脂粉高压灭菌20 min, 再加入过滤除菌的20 g/L葡萄糖。
1.1.3.3 种子培养基
BMGY液体培养基, 10 g/L酵母粉，20 g/L胰蛋白胨，高压灭菌20 min，再加入过滤除菌的13.4 g/L酵母基本氮源、100 mmol磷酸钾pH 6、1 %甘油和0.4 mg/L生物素。1.1.3.4 发酵培养基
豆粕粉。1.1.4 仪器与设备
INFORS AGCH-4103控温摇床，Thermo Forma超净台，BECKMAN Avanti J-30I离心机，TOMYSS-325灭菌锅，SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度计，SY3000发酵罐。1.2 方法
1.2.1 种子培养方法
菌种活化：将-80 ℃冰箱保藏的bcGH基因工程菌菌种划线转接到MD平板，30 ℃恒温倒置培养3~5 d，以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。种子培养：接1环生长良好的MD平板种子至装有50 mL种子培养基的500 mL摇瓶中，重复做6个摇瓶种子，置于300 r/min恒温摇床，30 ℃振荡培养菌液A600至2-6，作为发酵用的种子。1.2.2 发酵培养方法
在250 mL三角瓶中加入相应量的豆粕粉，加蒸馏水定容至25 mL，调整pH，121 ℃灭菌20 min，冷却至室温加入工程菌种，置于相应温度环境中，300 r/min 摇床培养，从发酵表达开始，每隔24 h添加甲醇诱导剂。发酵结束，检测bcGH表达量和工程菌菌落数。
1.2.3 L625(5)正交试验设计方案
在针对影响bcGH表达的单因子试验基础上，采用L25(56)正交试验设计，对影响bcGH基因工程菌蛋白表达的6个因素(培养基组成和培养条件)间的相互作用进行研究，确定最佳发酵组合条件。1.2.4 10 L发酵罐发酵
使用火焰接种法接种bcGH基因工程菌，将摇瓶培养24 h的种子接入装填量为7 L的10 L发酵罐。空气流量为3 L/min，搅拌速度为300 r/min，在正交试验确定的最佳发酵组合条件下大规模发酵。发酵结束，检测bcGH表达量和工程菌菌落数。
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1.2.5 活菌数和bcGH表达量的检测
1.2.5.1 YPD平板计数法检测
不同条件下，培养的工程菌数越多，则bcGH表达量越高。发酵结束后，取1 mL发酵液稀释1万倍，再取25 μL稀释液涂于YPD培养基上。30 ℃，倒置培养3~5 d。计算工程菌菌落数。1.2.5.2 SDS-PAGE电泳检测
发酵结束后，3 000 r/min离心收集菌体，加PBS缓冲液重悬菌体，冰上超声波破碎。菌体超声裂解物4 ℃，1万2 000 r/min， 离心10 min，分离沉淀，沉淀再用PBS重悬。分别取上清液和沉淀，加入等量2×上样缓冲液混合后沸水浴10 min，进行15 %的SDS-PAGE电泳分析。考马斯亮蓝R-250 染色，常规脱色。通过观察目的蛋白条带的灰度和Bandscan软件分析来确定bcGH表达量。
2 结果与分析
2.1 发酵培养单因素试验
2.1.1 发酵时间对bcGH表达量的影响
发酵时间是影响外源蛋白表达量的重要因素，发酵时间过短表达量低，发酵时间过长则外源蛋白易降解增加。为了摸索发酵时间对bcGH表达量和活工程菌数的影响,在豆粕质量浓度为6 %、pH为7、接种量为5 %和发酵温度30 ℃的条件下，研究随着发酵时间不同对bcGH表达量和活工程菌数的影响。从发酵表达开始，每隔24 h添加1 %甲醇诱导剂。其结果见图1和2。
）
1-L15m・UF10C 亿（数5菌
程工0
活时间/h
图1 发酵时间对bcGH基因工程菌生长影响
从图1和2可见：前期工程菌主要以细胞生长繁殖为主，而bcGH表达主要在中后期。发酵培养72 h后，bcGH的表达量趋于平稳，其原因是由酵母菌自溶造成的。试验结果表明：发酵96 h时，bcGH基因工程菌活菌数达到11亿CFU/mL，bcGH表达量达到最大值，占总蛋白的21.5 %。
注：1为未诱导；2为蛋白质标志物；3~7的诱导时间分别为，96 、72 、48 、24 和12 h 。
1 2 3 4 5 6 7
11890u
k/量质50子分对36相白蛋2720
图2 发酵时间对bcGH基因工程菌表达量影响
2.1.2 发酵温度对bcGH表达的影响
酵母的生长繁殖和外源蛋白的合成都是在各种酶的催化下进行的，而温度是保证酶活性的重要条件，因此发酵过程须保证稳定而合适的温度环境。温度对发酵的影响体现在影响发酵动力学特征上，在一定的温度范围内，温度升高酶反应速率增加，酵母细胞的生长代谢加快，外源蛋白表达可提前。但温度升高酶失活越快，则酵母易衰老而使发酵周期缩短，从而影响外源蛋白的表达。在豆粕质量浓度为6 %、pH为7、接种量为5 %和发酵时间为72 h的条件下，仅改变发酵温度，研究随着发酵温度不同对bcGH表达量和活工程菌数的影响。从发酵表达开始，每隔24 h添加1 %甲醇诱导剂。其结果见图3和4。
）
1-L12m・10UF8C 亿6（数4菌2程工0
活24 26 28 30 32
温度/℃
图3 发酵温度对bcGH基因工程菌生长的影响
试验结果表明：bcGH基因工程酵母菌的生长
和表达外源蛋白适宜的温度为28~30 ℃，温度超过32 ℃时目的蛋白表达明显减少。bcGH基因工程酵母菌生长和表达外源蛋白最适宜的温度为30 ℃，活菌数达到12亿 CFU/mL，bcGH表达量占总蛋白的22.5 %，这一结果与韩冬和陈志瑾运用重组毕赤酵母菌表达外源蛋白的温度一致。
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注：1为蛋白质标志物；2~6的发酵温度分别为，32 、30 、28 、26 和24 ℃；7为未诱导。
1 2 3 4 5 6 7 118u
90k/量质50子分对36相白蛋27
20
图4 发酵温度对bcGH基因工程菌表达量影响
2.1.3 接种量对bcGH表达的影响
接种量的大小影响菌种的生长繁殖，接种量大小取决于生产菌种在发酵培养基中的生长繁殖速度，接种量大可缩短延迟期，加快菌体生长，使产物形成期提前，但接种量过多时菌体生长过快，导致培养基被过早耗尽，且发酵液黏度增大，造成溶氧不足而影响产物形成；接种量过少则延长发酵期。因此，在优化接种量固定豆粕质量浓度为6 %、发酵时间为72 h、发酵温度为30 ℃和pH为7的条件下，研究随着接种量的增加，bcGH表达量和活工程菌数变化。从发酵表达开始，每24 h添加1 %甲醇诱导剂。结果见图5和6。
）
121-Lm10・U8FC亿6（4数菌2程工0
活2 3 4 5 6
接种量/%
图5 接种量对bcGH基因工程菌生长影响
注：1为未诱导；2~6的接种量分别为，2 %、3 %、4 %、5 %和6 %；7为蛋白质标志物。
1 2 3 4 5 6 7
118u
90k/量50质子分36对相27
白蛋20
图6 接种量对bcGH基因工程菌诱导表达影响
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从图5和6可见：6 %的接种量时，活菌数最多，高外源蛋白表达量。然而，质量浓度过高的甲醇会bcGH表达量也最高，但当接种量在5 %后，活菌数也多，bcGH表达量与6 %接种量的相当，综合成本考虑，选 5 %接种量为宜。
2.1.4 豆粕质量浓度对bcGH表达的影响
发酵培养基既要有利于工程菌的生长繁殖，又要有利于目的蛋白的表达。培养基中氮源的含量因发酵目的产物不同而不同，若目的产物中有氮素存在（外源蛋白表达），则对氮源的需求量远大于那些无氮素的目的产物发酵。豆粕是微生物发酵常用的有机氮源之一，其添加量势必影响目的蛋白的表达。在发酵时间为72 h、发酵温度为30 ℃、pH为7和接种量为5 %的条件下，研究随着豆粕质量浓度对bcGH表达量和活工程菌数的影响。从发酵表达开始，每隔24 h添加1 %甲醇诱导剂。其结果见图7和8。
）
112-Lm10・UF8C亿6（数4菌程2工0
活豆粕质量浓度/%
图7 豆粕质量浓度对bcGH基因工程菌生长影响
注：1为蛋白质标志物；2~6的豆粕质量浓度分别为，7 %、6 %、5 %、4 %和3 %；7为未诱导。
1 2 3 4 5 6 7 118
u
k/90量质50子分对36相白27蛋20
图8 豆粕质量浓度对bcGH基因工程菌诱导表达影响
试验结果表明：随着豆粕质量浓度的增加，bcGH的表达和活菌数也增加，但当豆粕质量浓度达到6 %后，活菌数和bcGH表达量增加率很少。基于原料成本考虑，豆粕的添加量宜为6 %。2.1.5 诱导剂质量浓度对bcGH表达的影响
甲醇在毕赤酵母体内，首先被氧化成甲醛，一部分继续氧化成甲酸进而生成CO2，产生菌体所需的能量；另一部分可以被菌体同化，进入小分子碳架的合成途径，提供菌体生长所需的碳源。甲醇既是它的诱导剂也是碳源，因此较高质量浓度的甲醇，有利于细胞生长和AOXI强启动子的作用，从而提
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毒害细胞。在发酵时间为72 h、发酵温度为30 ℃、pH为7、接种量为5 %和豆粕质量浓度为6 %的条件下，研究诱导剂质量浓度对bcGH表达量和活工程菌数的影响。其结果见图9和10。
）
1-12Lm・10UF8C亿6（数4菌程2工活0
0.5 1 .0 1.5 2.0 2.5
诱导剂添加量/%
图9 甲醇质量浓度对bcGH基因工程菌生长影响
注：1为蛋白质标志物；2~6的甲醇质量浓度分别为，2.5 %、2 %、1.5 %、1 %和0.5 %；7为未诱导。
1 2 3 4 5 6 7
118u
k90/量质50子分36对相白27蛋20
图10 甲醇质量浓度对bcGH基因工程菌诱导表达影响
试验结果表明：当甲醇质量浓度为1 %时，活菌数和bcGH表达量都最高。2.1.6 pH对bcGH表达的影响
发酵培养基的pH对微生物生长具有非常明显的影响；另外，培养基的pH也是影响发酵过程中各种酶活的重要因素，培养基的pH可通过弱酸(或弱碱)过膜而间接影响细胞内的H+或OH－离子质量浓度，进而影响酶蛋白的解离度和电荷情况，改变酶的结构和功能，引起酶活性改变，从而影响菌体生长和分泌。在发酵时间为72 h、发酵温度为30 ℃、接种量为5 %和豆粕质量浓度为6 %的条件下，研究培养基pH对bcGH表达量和活工程菌数的影响。从发酵表达开始，每隔24 h添加1 %甲醇诱导剂，其结果见图11和12。
）
1-L12m・10UFC8亿6（数4菌程2工0
活5 6 7 8 9
pH
图11 pH对bcGH基因工程菌生长影响
注：1为蛋白质标志物；2~6的pH分别为，9、8、7、6和5；7为未诱导。
1 2 3 4 5 6 7
118
u
k/90量质子50分对36相白27蛋20
图12 pH对bcGH基因工程菌诱导表达影响
经SDS-PAGE电泳和Bandscan软件分析，工程菌表达bcGH的初始pH在6~8时表达量较高，尤以pH为7最优，其中bcGH表达量占总蛋白的22.2 %，活菌数达到11.8亿CFU/mL。
2.2 多因子正交试验2.2.1 因素与水平确定
通过单因素试验得知，发酵时间、发酵温度、接种量、豆粕质量浓度、pH和诱导剂质量浓度对工程菌表达外源蛋白和活菌数均有较大的影响，为此采用正交试验对上述6个因素进行处理，正交试验的设计见表1。
表1 L25（56）正交试验因子水平
水A(温度)/
C(发酵
D(诱导剂E(接种F(豆粕质量平℃B( pH)
时间)/h质量浓度)/%量)/%浓度)/%
1245120.523226 6241.0343287481.545430 8722.0565
32
9
96
2.5
6
7
2.2.2 正交试验结果及分析
确定因素和水平后，按L625（5）安排试验，共25次，发酵培养的条件与单因子试验相同，检测bcGH表达量，结果见表2。
从表2可见：比较各因素极差R值大小，可以看出各因素bcGH表达量的影响主次顺序为C> B> E > A >D>F，最优发酵组合条件为A4B3C5D2E4F4，即发酵时间为96 h，pH为7，接种量为5 %，发酵温度为30 ℃，诱导剂质量浓度为1 %，豆粕质量浓度为6 %。
2.2.3 正交试验验证试验
将正交试验得到的bcGH表达最佳组合（13号）与理论最佳组合进行比较，每组合重复3次，确定最佳组合。
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表2 L625（5）正交试验结果 %
项目
因素和水平bcGH占总蛋白
A
B
CD
E
F
的比例
1
[***********]335.941444446.151555554.362123453.072234514.582345127.692451237.[***********].[1**********].[1**********].[***********].8164142538.[1**********].[***********].2204531436.6215154327.[***********].1245432155.4255543213.1
K116.322.431.631.329.9K222.733.314.132.114.021.7K335.536.725.728.529.923.9K435.923.337.719.933.831.0K521.115.854.019.422.525.0k13.264.486.326.265.98k24.546.662.826.422.804.34k37.107.345.145.705.984.78k47.184.667.543.986.766.20k54.223.1610.803.884.505.00R
3.92
4.18
10.80
2.44
3.96
1.56
表3 bcGH表达量正交试验验证结果 %组合bcGH占总蛋白的比例重复1重复2重复3平均值
A3B3C5D2E4F1
20.419.620.220.0A4B3C4D4E2F3
24.4
25.625.3
23.8
从表3可见：通过正交试验所获得最佳诱导发酵工艺条件，重复性很好，平均蛋白表达量可占总蛋白的23.8 %，平均值比13号(A3B3C5D2E4F1)试验结果高，说明优化条件具有很好的重现性和可靠性。
2.2.4 10 L发酵罐发酵试验结果
在最优发酵组合条件下，将bcGH工程菌种接种到10 L发酵罐中，300 r/min验证其在发酵罐中的发酵效果。发酵结束，经平板计数和SDS-PAGE电泳检测，活工程菌数和bcGH表达量都高于摇瓶发酵，活菌数达到79.6亿CFU/mL，bcGH表达量占总蛋白28.4 %。
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3 讨论
试验通过单因子试验和正交试验优化，证实了各因子对蛋白表达量的影响都显著，它们的作用大小依次为发酵时间> pH>接种量>发酵温度 >诱导剂质量浓度>豆粕质量浓度，最优发酵组合条件为发酵时间96 h、pH 7、接种量5 %、发酵温度30 ℃、诱导剂质量浓度1 %和豆粕质量浓度6 %。按照该工艺条件在10 L发酵罐中发酵，活菌数达到79.6亿CFU/mL，bcGH表达量占总蛋白的比例高达28.4 %。
在正交试验优化的最佳发酵条件下， 10 L发酵罐中bcGH工程菌的表达效果好于摇瓶中发酵表达。可能的原因是：由于摇瓶培养过程中，溶氧水平只能由摇床的转速来调节，造成了溶氧不充分和不均匀；而在发酵罐发酵中，氧气的传递效率远高于摇瓶发酵，溶氧水平可通过调节搅拌的转速和通气量达到很好的动态控制，因此，发酵罐发酵更适合bcGH工程菌的生长繁殖和表达。
有关生长激素工程菌发酵条件的研究比较多，但该试验是以来源广泛的豆粕为培养基，成功地将
bcGH工程菌应用到发酵豆粕上，使bcGH得到高效地表达，大大降低了大规模生产bcGH的成本，为bcGH工程菌的工业化运用奠定了基础。bcGH工程菌发酵产物的效果如何，是否有利于促进鱼类生长和提高鱼类免疫力，还有待于下一步的养殖试验。
参考文献
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通信地址：湖南长沙湖南农业大学动物科技学
院 410128
奶牛“金钥匙工程”培训班在乌鲁木齐市举办
2010年8月16—17日，由农业部奶业管理办公室、国家奶牛产业技术体系、中国奶业协会、新疆自治区畜牧厅、新疆生产建设兵团农业局主办，自治区奶办、新疆农业大学、 新疆克拉玛依奶牛实验站、新疆呼图壁乳肉兼用奶牛实验站承办的奶牛“金钥匙工程”第16期新疆培训班在乌鲁木齐市翼龙大酒店召开。疆维吾尔自治区畜牧厅总畜牧师赵新春、国家奶牛产业技术体系专家李胜利、肖定汉、余雄及新疆建设兵团和各地州畜牧兽医局代表、农业大学教授、奶牛养殖和生乳生产企业相关管理人员、技术人员、专职岗位人员（场长、鲜奶质量检验员、奶厅挤奶员、TMR日粮操作员、配种员、兽医、营养师等）200余人参加此次培训班。
培训班开幕式上，赵新春总畜牧师代表新疆维吾尔自治区畜牧厅致欢迎辞，李胜利教授代表主办方重点强调了这次培训班的目的和意义。培训班上，有关专家详细讲解了生鲜标准、乳监管条例与规章解读、泌乳奶牛饲养管理技术要点、奶牛生产性能测定技术及其应用、后备牛培育饲养管理技术要点、规模化养殖的疾病防控与治疗等内容；培训班还专门安排半天的时间请专家们与在座的代表精英进行现场互动交流，答疑解惑，资深专家们的精彩解答赢得全场阵阵掌声和笑声，会场气氛十分活跃和热烈，互动时间大大超出了会议的计划。
本次培训班受到了与会领导及学员们的一致好评，认为本次培训班学习内容多，实用性强，信息量大，对学员可操作性强，受益非浅，促进了奶牛饲养管理更上一个新的台阶，对我区奶业更好更快地可持续发展大有益处，希望以后能多办此类培训班。
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