中国修复重建外科杂志２００８年１月第２２卷第１期
・７５・
大鼠胰岛的分离纯化方法改进与功能鉴定
袁宇１
丛聪１
麦刚２
【摘要】
张静１李幼平１
魏玲玲１程惊秋１
李胜富１陆燕蓉１
金熙１
目的通过改进胰腺消化和分离的技术条件，提高成年大鼠胰岛分离纯化产率和质量。方法用
胶原酶Ⅺ液灌注消化成年ＳＤ大鼠胰腺，对胰岛分离纯化方法加以改进：以４种比重的Ｅｕｒｏ．Ｆｉｃｏｌｌ（Ｆ１：Ｄ＝Ｉ．１３２，Ｆ２：Ｄ＝Ｉ．１０８，Ｆ４：Ｄ－－１．０６９）和Ｈａｎｋ’Ｓ液（Ｆ５：Ｄ＝Ｉ．０２３）不连续密度梯度离心，以离心半径１５
ｃｍ，２０００
ｒ／ｒａｉｎ于４℃缓慢升
降离心２０ｍｉｎ，收集位于Ｆｌ和Ｆ２界面的胰岛。双硫腙特异染色法鉴定胰岛纯度；二醋酸酯荧光素／碘化丙啶染色法计算胰岛成活率；放射免疫分析法检测葡萄糖刺激的胰岛素分泌量，计算刺激指数。将胰岛当量（ｉｓｌｅｔｓ
ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｑｕａｎｔｉｔｙ，
ＩＥＱ）为１０００的胰岛移植于同品系糖尿病大鼠肾包膜下，９ｄ内隔日观察动物血糖的变化，评价胰岛功能。比较分离条件优化前后收获胰岛的产率和质量。
结果改进纯化方法后每只大鼠胰岛收获量为（９２０－Ｍ２２）ＩＥＱ，胰岛纯度＞９０％，胰
岛细胞成活率为９１％士２％。胰岛细胞功能良好，在低糖和高糖刺激后培养液中胰岛素浓度分别为（１８．２５士０．３２）ｍＵ／Ｌ和（３６．７０士３．５７）ｍＵ／Ｌ，刺激指数为２．０１士０．１５。ｌ正常。
０００
ＩＥＱ胰岛移植于糖尿病大鼠肾包膜下，观察期内可维持动物血糖水平
大鼠
结论改进后的胶原酶灌注消化和不连续梯度离心方法提高了胰岛的产率，保证了胰岛的高纯度及高成活率。
胰岛
分离
Ｒ３１８
【关键词】纯化胰岛素
中图分类号：Ｑ８１３．０１文献标志码：Ａ
ＩＭＰＲＯＶＥＤＭＥＴＨＯＤＦＯＲＯＰＴＩＭＩＺＥＤＩＳＯＬＡＴＩＯＮＡＮＤＰＵＲＩＦＩＣＡＴｌ０ＮＯＦＲＡＴＩＳＬＥＴＳＡＮＤＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ
ＦＵＮＣＴＩＯＮ｜ＹＵＡＮＹ“．ＣＯＮＧＣｏｎｆ，ＺＨＡＮＧ］ｉｎｆ，ｗＥｌＬｉｎ孛ｉｎｇ．ｕｓｈｅｎｇ船．｛ＩＮ硷．ＭＡｌＧａｎ窖．ｎＹｏｕｐｉｎ∥，ＣＨＥＮＧ ］ｉｎｇｑｉｕｔ，ＬＵＹａｎｒｏｎ∥．’ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒａｎｓｐｌａｎｔＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｎｅｒａｌＳｕｒｇｅｒｙ，ＷｅｓｔＣｈｉ－
ＯＦ
ｎａＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｉｃｈｕａｎＵｎｉｖｅｒｓｉ仍ＣｈｅｎｇｄｕＳｉｃｈｕａｎ，６１００４１，Ｐ．兄Ｃｈｉｎａ．Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬＵＹａｎｒｏｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｙａｎｒｏｎｇ＠
ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］
ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｒａｔ
Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅｇｏｏｄｐａｎｃｒｅａｔａｂｙ
ａ
ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｍｅｔｈｏｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙ
ａ
ｒａｔ
ｉｓｌｅｔｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｉｓｌｅｔｓ
ｆｒｏｍｍａｌｅＳＤ
ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ
ｍｏｄｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄ：ａｄｄｅｄ４ｋｉｎｄｓ
ｃｅｎ—
ｏｆＥｕｒｏ—Ｆｉｃｏｌｌｏｆｔｒｉｆｕｇｅｔｈｅｔｕｂｅａｓｓｅｓｓｅｄ
ａｔ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｎｓｉｔｉｅｓ（ＦＩ：Ｄ＝Ｉ．１３２，Ｆ２：Ｄ＝Ｉ．１０８，Ｆ４：Ｄ＝Ｉ．０６９，Ｆ５：Ｄ＝Ｉ．０２３），ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅｎｔ
２０００
ｒ／ｍｉｎｆｏｒ２０ｍｉｎｕｔｅｓ
ａｔ
４＂Ｃ，ｔｈｅｎｔｈｅｉｓｌｅｔｓｂｅｔｗｅｅｎＦ１ａｎｄＦ２ｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｉｓｌｅｔｓｗａｓ
ｂｙｄｉｔｈｉｚｏｎｅｓｔａｉｎｉｎｇｗｉｔｈｉｓｌｅｔｓｃｏｕｎｔｅｄａｎｄｓｃｏｒｅｄｆｏｒｓｉｚｅ．ＩｓｌｅｔｓｖｉａｂｉｌｉｔｙＷａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ／ｐｒｏｐ・
ｔｅｓｔ
ｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ．Ｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｉｓｌｅｔｓｗａｓｊｕｄｇｅｄｂｙｔｈｅｏｆｉｎｓｕｌｉｎｒｅｌｅａｓｅａｎｄｉｓｌｅｔｓｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ａｆｔｅｒ
ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｏｐｔｉｍｉｚｅｄｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（９２０＋１２２）ＩＥＱｐｕｒｉｆｉｅｄｉｓｌｅｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｏｎｅｒａｔ．Ｂｏｔｈｔｈｅ
ｐｕｒｉｔｙａｎｄ
ａｔ
ｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｉｓｌｅｔｓｗｅｒｅ
ｏｖｅｒ
９０％．ＴｈｅａｍｏｕｎｔｏｆｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎＷａｓ（１８．２５＿＋０．３２）ｍＵ／Ｌａｎｄ（３６．７０＿＋３．５７）ｍＵ／Ｌ
２．２
ｍｍｏｌ／Ｌａｎｄ２２．２ｍｍｏｌ／Ｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｇｌｕｃｏｓｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏｐｈａｓｅｓ
ｒｅｌｅａｓｅｉｎｄｅｘｗａｓ２．０１＿＋０．１５．Ｕｎｄｅｒ１０００
沪＜０．０５）．Ｔｈｅｉｎｓｕｌｉｎ
ａｎｄｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ
ＩＥｑｉｓｌｅｔｓｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅｎｏｒｍａｌｇｌｕｃｏｓｅｌｅｖｅｌｃｏｕｌｄｂｅ
ｃａｎ
ｒｅｍａｉｎｅｄｉｎｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｓｉｏｎ
ｏｎ
Ｈｉｇｈｐｕｒｉｔｙａｎｄｈｉｇｈｖｉａｂｉｌｉｔｙｉｓｌｅｔｃｅｌｌｓ
ｂｅｇｏｔ
ｔｈｒｏｕｇｈｉｍｐｒｏｖｅｄｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｐｅｒｆｕ－
ｇｒａｄｉｅｎｔｓｍｅｔｈｏｄ．
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＩｓｌｅｔｓＩｎｓｕｌｉｎＲａｔ
ｉｔｅｍｓ：ＮａｔｉｏｎａｌＢａｓｉｃＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＧｒａｎｔｓ（２００３ＣＢｌ５５０４）；ＧｒａｎｔｆｏｒＣｈａｎｇｊｉａｎｇＳｃｈｏｌａｒｓａｎｄＩｎ－
ｎｏｖａｔｉｏｎＧｒｏｕｐｓｏｆｔｈｅＥｄｕｃａｔｉｏｎＭｉｎｉｓｔｒｙ（ＩＲＴ０４５０）
胰岛移植作为一种潜在治愈糖尿病的方法¨１，一
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３）资助项目（２００３ＣＢｌ５５０４）；教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目
（ＩＲＴ０４５０）
直是糖尿病研究领域的热点。虽然胰岛移植的相关研究在近几十年来得到了很大发展，但目前胰岛移植的效果尚不理想［５－６］。在人体的胰岛移植中，移植胰岛保持１年以上成活率的不超过４５％１７】。胰岛移植物的质量与数量不足是影响胰岛移植效果的重要原因之一。如何才能获得高纯度、高产量及高成活率的胰岛不仅是临床胰岛移植亟待解决的问题，也是进行各种胰岛移植实验研究的基础。
作者单位：ｌ四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室（成都，６１００４１），２普外科
通讯作者；陆燕蓉，副教授，硬士导师，研究方向：胰岛移植的实验研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｕｙａｎｒｏｎｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｌｌ
・７６・
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ
ｏｆＲｅｐａｒａｔ—ｉｖｅ—ａｎｄＲｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ
Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｊａｎｕａｒｙ２００８，Ｖ０１．２２，Ｎｏ．１
大鼠是胰岛移植研究常用的动物模型，虽早有文献报道大鼠胰岛分离纯化的方法，但分离纯化过程复
杂，影响因素太多，技术难度大，微小环节也会对结果产生直接影响ｉｓ－９］。我们的实验通过改进胰腺胶原酶消化及胰岛密度梯度离心纯化胰岛，提高了胰岛的产率和质量，获得了较满意的结果。１材料与方法
１．１
实验动物与主要材料
健康雄性清洁级ＳＤ大鼠５０只，体重２５０～３５０
ｇ，
由四川大学华西实验动物中心提供，于独立通风笼具系统内饲养。
胶原酶ＸＩ（Ｓｉｇｍａ公司，美国）：用Ｈａｎｋ’Ｓ液（ｐＨ７．２）溶解至Ｏ．５ｍｇ／ｍＬ，０．２２Ｉｘｍ针头滤器过滤除菌后，－２０℃保存备用；双硫腙（ｄｉｔｈｉｚｏｎｅ，ＤＴＺ，上海试剂三厂）：１０
ｍｇ
ＤＴＺ溶于３ｍＬ无水乙醇和５０血
氨水中，加Ｈａｎｋ’Ｓ液１２ｍＬ配制成储存液，使用时用Ｈａｎｋ’Ｓ液按１：１０稀释，０．２２ｐ，ｍ０１］Ｌ孔径滤膜过滤后备用；二醋酸酯荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＦＤＡ）和碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ，均为Ｓｉｇｍａ公司，美
国）；含１０％ＦＢＳ
ＲＰＭＩ１６４０培养基（Ｇｉｂｃｏ公司，美国）；胰岛素放射免疫分析药盒（北京北方生物技术研究所）；链脲酶素（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ，ＳＴＺ，成都宇洋高科技发展有限公司）：用Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ枸橼酸缓冲液（ｐＨ４．５）配成３０ｍｅｇｍＬ，３０ｍｉｎ内使用。
Ｅｕｒｏ．Ｆｉｃｏｌｌ分离液的配制：Ｆｉｃｏｌｌ４００（天津市聚合科贸有限公司）；Ｅｕｒｏ．ｃｏｌｌｉｎ保存液：含１５
ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＣｌ、１５ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２Ｐ０４、４３ｍｍｏｌ／ＬＫ２ＨＰ０４、１０ｒｎｍｏｌ／ＬＮａＨＣ０３、２００
ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖，ｐＨ７．２；Ｅｕｒｏ．Ｆｉｃｏｌｈ将
不同比例的Ｆｉｃｏｌｌ４００溶解于Ｅｕｒｏ—ｃｏｌｌｉｎ中，得到不同比重（Ｄ）的分离液（Ｆ１：Ｄ＝Ｉ．１３２，Ｆ２：Ｄ＝Ｉ．１０８，Ｆ３：Ｄ＝Ｉ．０９６，Ｆ４＂Ｄ＝１．０６９），４＇Ｃ避光保存。
Ｌｅｇｅｎｄ
ＲＴ低温离心机（Ｓｏｒｖａｌｌ公司，美国）；
ＭＣＯ．１７ＡＣ０２细胞培养箱（Ｓａｎｙｏ公司，日本）；ＩＸ５０
荧光倒置相差显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ公司，日本）；ＮＵ．４２５—４００Ｅ超净工作台（Ｎｕａｉｒｅ公司，美国）；血糖仪（Ｒｏｃｈｅ公司，美国）。
１．２
胰岛的分离
取２只大鼠麻醉后，腹部常规消毒去毛，作腹正中
切口及双侧肋缘下切口，显露肝门，切除剑状软骨。用棉签将大鼠小肠推至腹腔左侧，暴露胆管远端。在胆总管汇入十二指肠的入口处结扎，缝合时避免接触胰腺。于胆管近心端使用穿刺针原位插管，并结扎胆总管近心端。动物处死，经胆总管缓慢注入０．５
ｍｇ／ｍＬ
胶原酶Ⅺ溶液１０ｍＬ，使胰腺原位缓慢膨胀。沿肠壁分
离胰腺，切取后立即置入３７＂Ｃ水浴静止消化约１５
ｍｉｎ；
取出剧烈振摇１ｍｉｎ分散胰腺，使呈细沙状，立即加入１０倍体积的４℃预冷Ｈａｎｋ’Ｓ液（含０．１％牛血清白蛋白）终止消化。６０目网筛过滤，用５０ｍＬ注射器
１５
Ｇ针头从筛上喷过，冲洗网上组织。于４＂Ｃ离心以半
径１５ｃｍ，１
０００
ｒ／ｒａｉｎ离心ｌｍｉｎ；弃上清；同法离心
３
ｒａｉｎ；Ｈａｎｋ’Ｓ液重悬组织，８０目网筛过滤，同法离心
后收集沉淀。以上步骤均在超净台中进行。
１．３
胰岛的纯化
方法１：参照文献［１０］方法，将消化后的胰腺组织
混悬于１２ｍＬＦ２中，依次加入Ｆ３、Ｆ４和Ｈａｎｋ’ｓ液（Ｆ５：Ｄ＝１．０２３）各６ｍＬ；以离心半径１５
ｃｍ，２０００
ｒ／ｍｉｎ于
４＂Ｃ缓慢升降离心２０ｍｉｎ，收集位于Ｆ２和Ｆ３界面的胰岛，Ｈａｎｋ’ｓ液离心洗涤３次，备用。
方法２：另取胰腺组织瓣对方法１加以改进，在
５０
ｍＬ离心管中加入１２ｍＬＦｌ铺底，１０ｍＬＦ２重悬沉
淀组织并小心加至Ｆ１上，注意防止气泡混入影响细胞重悬效果。依次小心加入Ｆ４和Ｆ５各６ｍＬ（图１）。以离心半径１５
ｃｍ，２０００
ｒ／ｍｉｎ于４＂Ｃ缓慢升降离心
２０
ｍｉｎ，收集位于Ｆ１和Ｆ２界面的胰岛，Ｈａｎｋ’ｓ液离
心洗涤３次，备用。
图１
胰岛分离体系示意图
Ｆｉｓ．１
Ｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒａｔｉｓｌｅｔｓ
１．４胰岛计数
将ＤＴＺ工作液５０此与两种纯化方法获得的胰岛各１００此混合５ｍｉｎ，显微镜下计数ＤＴＺ染为猩红
色的细胞团数量，并用标尺测量细胞团直径，按公式换
算为相当于直径１５０岬的胰岛当量（ｉｓｌｅｔｓ
ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ
ｑｕａｎｔｉｔｙ，ＩＥＱ），再计算总共收获的胰岛当量。胰岛平
均直径换算方法见表１。
中国修复重建外科杂志２００８年１月第２２卷第ｌ期
表１
ＩＥＱ换算表
Ｔａｂ．１
Ｃａｌｃｕｌａｔｅｔａｂｌｅ
ｏｆｍＱ
一亨径‘攀’．５０～１００Ｄｉａｍｅｔｅｒ（啪Ｊ
一．
。，
、
～ｌＯＣ１５０１５０～２００２００～２５０２５０～３００３００～３５０
！塑
Ｑ：！！！：笪！：！！！：！壁！：！壁
！！：塑
１．５
胰岛活性鉴定
ＦＤＡ／ＰＩ溶液１０皿与１００ｐＬ胰岛制各物混合
１０
ｍｉｎ，在荧光显微镜下分别用４９０ｎｍ和５１０ｎｍ激
发光滤光片后可分别见到绿色的ＦＤＡ荧光（活细胞）和红色的ＰＩ荧光（死细胞）。用ＣＣＤ成像系统采集图像。
１．６胰岛功能鉴定
１．６．１
葡萄糖刺激的胰岛素释放实验取２４孔板，
接种新鲜分离的ＳＤ大鼠胰岛２０ＩＥＱ／孔，１０％ＦＢＳ
ＲＰＭＩ１６４０培养液３７℃、５％Ｃ０２培养２４ｈ后，做葡
萄糖刺激的胰岛素释放实验（ｇｌｕｃｏｓｅ．ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｉｎ．ｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ，ＧＳＩＳ）。４℃用Ｈａｎｋ’Ｓ液以离心半径１５
ｃｍ，１２００
ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ洗涤胰岛细胞２次
后，加入含２．２２ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖的克一林二氏重碳酸盐液（Ｋｒｅｂｓ—Ｒｉｎｇｅｒ
ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ
ｂｕｆｆｅｒ，ＫＲＢ）缓冲培养
液（１１８
ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、４．７ｍｍｏｌ／ＬＫＣＩ、２．５ｍｍｏｌ／Ｌ
ＣａＣｌ２、１．２
ｍｍｏｌ／ＬＫＨ２Ｐ０４、１．２ｍｍｏｌ／ＬＭｇＳ０４、
２４．２ｍｍｏｌ／ＬＮａＨＣ０３，ｐＨ７．２）１ｍＬ于３７℃孵育１ｈ：
４℃以离心半径１５
ｃｍ，ｌ２００
ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ后收
集细胞上清，于一２０℃保存待测；另将细胞沉淀加入
２２．２
ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖的ＫＲＢ缓冲培养液１ｍＬ，混匀
后重新加入２４孔中，摇匀后继续３７℃孵育ｌｈ，４℃以离心半径１５ｃｍ，１２００
ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，收集培养上
清，一２０℃保存待测。放射免疫法检测培养液中胰岛
素浓度。
１．６．２大鼠胰岛移植
取禁食１８ｈ、体重约３００
ｇ
的健康雄性清洁级ＳＤ大鼠６只，腹腔注射ＳＴＺ
（６５ｍｅ，／ｋｇ）溶液，建立大鼠糖尿病模型（以连续２ｄ血
糖＞２２ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ为建模成功）。建模１０ｄ后，将两种方法制备的分离纯化的胰岛悬浮于生理盐水中，移植于糖尿病大鼠的左侧肾包膜下（１０００瞪Ｑ／只）。术后隔日取大鼠尾静脉血并立即用血糖仪监测血糖至术后第９天，评价胰岛功能。
１．７
统计学方法
采用ＳＰＳＳｌｌ．５统计软件包进行分析。数据以
均数４－标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，Ｐ值＜０．０５为有统计学意义。
２结果
２．１
胰岛的产率
胶原酶灌注后，成年ＳＤ大鼠胰腺膨胀充分（图２），
消化１５ｍｉｎ后胰岛可与外分泌腺组织分离。方法１分离纯化得到的胰岛数量较少，每只大鼠收获胰岛（３１０ｄ：１５０）ＩＥＱ，混有较多外分泌腺组织；方法２收获的胰岛数量大幅度提高，每只大鼠可收获胰岛（９２０ｄ：１２２）ＩＥＱ。
两种方法收获的胰岛细胞大小比较差异有统计学意义
＠＜０．０１）。胰岛的平均直径分布比例情况见表２。
表２
两种纯化方法所获胰岛的平均直径分布比例（ｎ＝ｔＯ，％，ｊ蛔）Ｔａｂ．２
Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｉｓｌｅｔｓ’ａｖｅｒａｇｅｄｉａｍｅｔｅｒｉｎｔｗｏＳｔｏｕｐｓ（ｎ＝１０，％’ｉ±ｓ）
胰岛平均直径分布比例
ＧＩ唧５０～ｌｏｏ
组别Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆｉｓｌｅｔｓ’ａｖｅｒａｇｅｄｉａｍｅｔｅｒ
１００～１５０
１５０～２００
２００～２５０＞２５０啪
ｇｎｌ
ｇｔｒｎ
岫
Ｉｎｎ
盏，ｓ强“。３ｌ：ｔ１７＂蚶
蚪姘
方法２
Ｇｒｏｕｐ２
７±２２ｌ士８２７４－１２
３３４－１９
１２Ａ：６
。与方法２比较，值＜Ｏ．０１
’ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＧｒｏｕｐ
２，＜Ｏ．０１
２．２
胰岛的纯度
ＤＴＺ染色后可清楚区分胰岛与外分泌腺细胞。胰
岛为橘红色有光泽的球形细胞，直径１００～３００岬；
外分泌腺细胞不规则散在分布于胰岛细胞周围，不能被ＤＴＺ着色；二者区别明显。方法２所获胰岛呈球形，边缘清晰，形态良好，经低速离心洗涤后，仅残存少量外分泌腺组织黏附，胰岛纯度＞９０％（图３ａ）；而方法１所获胰岛形态不完整，周围黏附较多外分泌组织，胰岛纯度＜８０％。２．３胰岛活性
方法２分离纯化的胰岛经ＦＤＡ／ＰＩ染色后，将不同激发波长下的图像叠加后显示（图３ｂ）：细胞团中绝大部分细胞为绿色，仅有少量着红色，胰岛成活率为９１％士２％；而方法ｌ所获胰岛成活率仅７４９征ｌ％。２．４胰岛功能
放射免疫法检测结果显示：胰岛在低糖
（２．２２ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）和高糖（２２．２ｍｍｏｌ／Ｌ）刺激下，培养上清中
释放的胰岛素浓度分别为：（１８．２５＋０．３２）ｍＵ／Ｌ和（３６．７Ｑ士３．５７）ｍＵ／Ｌ，高糖释放的胰岛素是低糖的（２．０１土０。１５）倍（刺激指数），二者比较差异有统计学意义（尸＜０．０１）。
按两种方法纯化的胰岛分别移植于６只糖尿病大鼠左侧。肾包膜下，在９ｄ的观察期内，受体血糖水平均有不同程度降低（图４）。
３
讨论
应用胰岛移植治疗ｌ型糖尿病是较适应生理要
求的治疗方法。胰岛移植不仅可纠正糖代谢紊乱，而且可避免因血管病变引起的眼、肾、脑和心血管并发症【ｌｌ越】。但胰岛移植仍有许多问题亟待解决，其中关
图２灌注后的大鼠胰腺（Ｄ灌注胰腺⑥剥离胰腺图３方法２获取的大鼠胰岛细胞④胰岛的纯度（ＤＴｚ染色×ｌｏｏ）⑤胰岛的活
性（ＦＤＡ／Ｐ！双染色ｘ１００）
ｐａｎｃｒｅａｔａ①Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆ
ｍｅｍｏｄ２④Ｔｈｅｐｕｒｉｔｙｏｆｉｓｌｅｔｓ（ＤＴＺｓｔａｉｎｘｌ００）⑥Ｔｈｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆｉｓｌｅｔｓ（ＦＤＡ／ＰＩｓｔａｉｎｘｌ００）
Ｆｉｇ．２
ｒａｔ
Ｒａｔｐａｎｃｒｅａｔａｗｅｌｌｐｅｒｆｕｓｅｄｂｙｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ④Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎｏｆ
ｒａｔ
ｐａｎｃｒｅａｔａＦｉｇ．３
Ｒａｔ
ｉｓｌｅｔｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅ
岛（直径≤２００“ｍ）悬浮于Ｆ２内，胰岛产率得到了极大提高，为（９２０＝ｊ：１２２）ＩＥＱ／只。后续的ＧＳＩＳ实验和胰岛移植实验表明，胰岛具有良好的生物功能活性。
该实验中用于胰岛纯化的Ｅｕｒｏ．Ｆｉｅｏｌｌ是由国产
Ｆｉｃｏｌｌ
童
ｏ
ｉ
莓
繁蜷
．目
４００配制而成。Ｆｉｃｏｌｌ４００作为胰岛分离纯化过
程中的主要消耗试剂，用量很大，是胰岛功能和胰岛移植研究重要的成本支出部分。目前国内实验室大多采用Ｓｉｇｍａ等公司进口的Ｆｉｃｏｌｌ４００，而进口Ｆｉｃｏｌｌ的售价通常是国产试剂的５０倍以上。我们通过使用国产试剂和对纯化方法进行改进，在保证胰岛产率和质量的同时，降低了胰岛分离纯化的成本，是一种值得在普
Ｏ
ｌ
３
５
７
９
时间（ｄ）
图４
Ｆｉｇ．４
通实验室的动物实验中推广应用的方法。
在胰腺灌注和胰岛消化分离过程中的注意事项：①处死大鼠时，为避免残留血液影响酶的作用效果，应对胰腺进行充分放血。建议操作时，先将大鼠放血处死后再进行胆管穿刺和酶灌注。②胆管穿刺时，穿刺结扎位置要在最低一支胆管与主干的汇合支以下，以防止部分酶液倒流至肝内；灌注过程中应顺胆管将针头向后退少许，以免位于胃部下侧的胰腺灌注不良；灌注时加压应先小后大，保证胰腺尽可能充盈。③胶原酶液溶解后应注意冰冻保存，灌注好的胰腺也应保存在４℃。若一次需多只大鼠胰腺时最好多人同时操作，尽量减少灌注胰腺的时间差。④严格控制胰腺的消化时间，避免时间太短、胰腺消化不够、产率降低和时间太长、胰岛破损、收获胰岛总当量减少。⑤胰腺消化分敖后，应立即加入相当于灌注酶液体积１０倍的预冷Ｈａｎｋ’Ｓ液，尽快混匀终止消化。如果Ｈａｎｋ’Ｓ液用量太少，则不能终止胶原酶的作用，造成过度消化，破坏胰岛完整性，也容易使胰腺组织形成胶冻样，影响分离效果１２１］。
综上述，我们的实验通过改善酶的保存方法、灌注手法、消化时间、纯化液的比重和加入顺序，改进了原＋
有的胰岛分离纯化方法，大大提高了胰岛产率。同时
胰岛移植后糖尿病大鼠血糖的变化
ｒａｔｓ
Ｔｈｅｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅｌｅｖｅｌｓｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｉｓｌｅｔｓｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
键问题是如何获得高产量、高纯度及高成活率的胰岛［协・。】。胰岛的分离纯化是一个较复杂的过程，所获胰岛的产量和质量受很多因素影响［”。引，稍有偏差即会直接影响实验结果，因此备受关注。
结合具体的实验条件和使用试剂特点，我们的实验对胰岛纯化方法进行了改进。按照国外经典文献报道的方法进行分离纯化［１９＿２０１，但胰岛收获率很低，仅（３１０士１５０）ＩＥＱ／只，大部分胰岛和外分泌腺细胞均停留在最底层的组织沉淀中。将胰岛沉淀与Ｆ２混匀后加在离心管最底层，在密度梯度离心的过程中，由于Ｆ２具有一定黏稠度，在离心力作用下，较大的胰岛细胞被牢牢黏在底部不能上浮到第２层界面，导致胰岛产量很低。我们的方法２对Ｆｉｃｏｌｌ的比重和加入顺序做了调整，将与Ｆ２混合的胰腺组织放到分离体系的中间，在离心管最底层铺垫高比重Ｆ１，目的是为了阻止体积较大的胰岛继续下沉，使胰岛从外分泌腺组织中分离出来。实验结果达到了我们的预期目的：较大的（直
径＞２００哪）胰岛聚集于Ｆｌ和Ｆ２界面上，较小的胰
中国修复重建外科杂志２００８年１月第２２卷第１期
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在保证胰岛质量的条件下，通过国产试剂替代进口试剂，有效降低了胰岛分离纯化的成本，为胰岛移植的相关实验研究奠定了基础。
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（本文编辑：苟莉）
・读者・作者・编者・
关于图表的要求
本刊对文稿中的表和图要求设计应科学、简洁。图表均分别按其出现先后次序连续编码，并冠以图（表）题。说明性的资料应置于图（表）下方注释中，并在注释中标明图表中使用的全部非公知公用的缩写及表中的统计学处理。均采用三线表，表内数据同一指标有效位数一致，均数及标准差小数点后保留位数一致。需附中英文图题、表题及图注、表注。黑白图片必须具有良好的清晰度及对比度，层次分明，彩色照片要求色彩鲜明，图像清晰。图片或照片大小要基本一致。图不宜过大，最大宽度半栏图不超过
７．５
ｃｍ，通栏图不超过１６．５ｃｍ，高与宽比例以５：７为宜。图注应附于图下或文后，不要粘贴，背面用铅笔注明作者姓名、图序号，
并表明上、下方向，照片中需说明的部位请以箭头或字母标注，在图注中说明。图片及照片不得折损。若刊用人像，应征得本人书面同意，或遮盖其能辨认出系何人部分（眼睛）。大体标本照片在图内最好有尺度标记。组织学图片需注明染色方法和放大倍数。
本刊编辑部
２００７．１２．２０
大鼠胰岛的分离纯化方法改进与功能鉴定
作者：
袁宇， 丛聪， 张静， 魏玲玲， 李胜富， 金熙， 麦刚， 李幼平， 程惊秋， 陆燕蓉，YUAN Yu， CONG Cong， ZHANG Jing， WEI Lingling， LI Shengfu， JIN Xi， MAI Gang， LI Youping， CHENG Jingqin， LU Yanrong
袁宇,丛聪,张静,魏玲玲,李胜富,金熙,李幼平,程惊秋,陆燕蓉,YUAN Yu,CONG Cong,ZHANGJing,WEI Lingling,LI Shengfu,JIN Xi,LI Youping,CHENG Jingqin,LU Yanrong(四川大学华西医院卫生部移植工程与移植免疫重点实验室,成都,610041)， 麦刚,MAI Gang(四川大学华西医院普外科)
中国修复重建外科杂志
CHINESE JOURNAL OF REPARATIVE AND RECONSTRUCTIVE SURGERY2008,22(1)9次
作者单位：
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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