乳酸菌的鉴定与乳酸菌的抑菌性毕业论文
目 录
摘 要............................................................ Ⅰ Abstracts......................................................... Ⅱ 目 录............................................................ Ⅲ
第1章 前 言.....................................................1
1.1乳酸菌的生理功能.............................................1
1.2乳酸菌的类型.... ............................................2
1.3乳酸菌的研究历史.............................................2
1.4乳酸菌的工业用途.............................................2
1.5乳酸菌细菌素.................................................2
第2章 材料与方法...................................................4
2.1 材料........................................................4
2.2 方法........................................................5
第3章 结果与分析..................................................9
3.1抑菌实验结果................................................9
3.2抑菌物质的确定..............................................9
3.3乳酸菌的鉴定...............................................10
第4章 结论........................................................13
4.1分离纯化结果................................................ 13
4.2抑菌试验的结果.............................................. 13
4.3鉴定结果.................................................... 13
致谢............................................ ..................14
参考文献..........................................................15
第1章 前言
乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸菌的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的直接关系。
乳酸菌是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌能够将碳水化合物发酵成乳酸，因而得名。益生菌能够帮助消化，有助人体肠脏的健康，因此常被视为健康食品，添加在酸奶之内。
1. 1 乳酸菌的生理功能
在人体肠道内栖息着数百种的细菌，其数量超过百万亿个。其中对人体健康有益的叫益生菌，以乳酸菌、双歧杆菌等为代表，对人体健康有害的叫有害菌，以大肝杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌等为代表。益生菌是一个庞大的菌群，有害菌也是一个不小的菌群，当益生菌占优势时（占总数的80%以上），人体则保持健康状态，否则处于亚健康或非健康状态。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它们数量的多和少，直接影响到人的健康与否，直接影响到人的寿命长短，科学家长期研究的结果证明，乳酸菌对人的健康与长寿非常重要。
而人体肠道内乳酸菌拥有的数量，随着人的年龄增长会逐渐减少，当人到老年或生病时，乳酸菌数量可能下降100至1000倍，直到老年人临终完全消失。在平时，健康人比病人多50倍，长寿老人比普通老人多60倍。因此，人体内乳酸菌数量的实际状况，已经成为检验人们是否健康长寿的重要指标。现在，由于广谱和强力的抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力逐步下降，导致疾病越治越多，健康受到极大的危胁。所以，有意增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要。目前国际上公认的乳酸菌，被认为是最安全的菌种，也是最具代表性的肠内益生菌，人体肠道内以乳酸菌为代表的益生菌数量越多越好。也完全符合诺贝尔得奖者生物学家梅契尼柯夫“长寿学说”里所得出的结论，乳酸菌=益生菌=长寿菌。
乳酸菌的生理功能[1]具体有：
1、防治有色人种普遍患有的乳糖不耐症（喝鲜奶时出现的腹胀、腹泻等症状）。
2、促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收，产生维生素B 族等大量有益物质。
3、使肠道菌群的构成发生有益变化，改善人体胃肠道功能，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，维护人体健康。
4、抑制腐败菌的繁殖，消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾。
5、抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压作用。
6、免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力。
7、抗肿瘤、预防癌症作用。
8、提高SOD 酶活力，消除人体自由基，具抗衰老、延年益寿作用。
9、有效预防女性泌尿生殖系统细菌感染。
1.2 乳酸菌的类型
乳酸菌大体上可分为两大类。一类是动物源乳酸菌，一类是植物源乳酸菌。因为动物源取自动物，因菌种常处于相对不稳定状态，其生物功效也较不稳定，且在大量食用时，很容易导致人体动物蛋白过敏，即排斥反应。而植物源乳酸菌，因为取自植物易被人体认可，不论摄取多大的量，人体不会产生异体蛋白排斥反应，且植物源乳酸菌比动物源者更具有活力，能比动物源多8倍的数量到达人体小肠内定植，从而发挥其强大而稳定的生物功效。
1.3 乳酸菌的研究历史
早在20世纪初，俄国著名的生物学家梅契尼柯夫（Mechnikoff,1845-1916），在他获得诺贝尔奖的“长寿学说”里已明确指出，保加利亚的巴尔干岛地区居民，日常生活中经常饮用的酸奶中含有大量的乳酸菌，这些乳酸菌能够定植在人体内，有效地抑制有害菌的生长，减少由于肠道内有害菌产生的毒素对整个机体的毒害，这是保加利亚地区居民长寿的重要原因。这个具有划时代意义的“长寿学说”，为人类利用乳酸菌生产健康食品开创了新纪元。今天，利用乳酸菌生产的健康食品已经一跃成为全世界关注的健康食品。
早在5000年前人类就已经在使用乳酸菌。到目前为止，人类日常食用的泡菜、酸奶、酱油、豆豉等，都是应用乳酸菌这种原始而简单的随机天然发酵的代谢产物。
1.4 乳酸菌的工业用途
乳酸菌多数为同型发酵，如链球菌属（Streptococcus ），是与人类关系密切的重要菌群，有些菌是人和温血动物的致病菌；有些是人体的正常菌群存在于口腔和肠道；有些是乳制品及植物发酵食品中的常用菌，常在食品工业中使用，如乳链球菌（S ．lactis ）。少数为异型发酵，如肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides ）是制药工业上生产右旋糖酐（即代血浆）的重要菌种，但也是制糖工业的一种有害菌，常使糖汁发粘稠而无法加工。
1.5 乳酸菌细菌素
乳酸杆菌在胃肠道内能够产生细菌素，抑制病原菌的作用，而且乳酸杆菌属
的细菌都是无毒副作用的，因此是一类很有前途的益生素生产菌种(Ewing和Cole,1994) 。乳酸菌是正常人畜肠道中极为重要的生理菌群，担负着人畜机体多种重要的生理功能，具有维持人体中微生态平衡作用。而且，乳酸菌能够产生有机酸(如乳酸、丁酸和醋酸等) 、过氧化氢和细菌素等抑菌物质[1]。这些抑菌物质不仅不破坏食品的风味和组织状态，还可以抑制腐败菌和病原菌的生长，从而防止腐败，延长食品的保藏期。乳酸菌产生的细菌素以其对动物无毒性，易被人体消化道中的蛋白酶降解，不会在体内蓄积引起不良反应等特性，被认为是一种具有广阔应用前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂[2]。本实验欲从进口干酪中分离乳酸菌，并研究各种乳酸菌对食品中常见致病菌的抑制作用。
由于乳酸菌来源于食品, 其无毒副作用、无残留、无抗药性等优点受到人们的关注。乳酸菌在发酵过程中可以产生一系列物质, 能够抑制或杀死一些食物腐败菌, 其中起主要抑菌作用的是细菌素, 其具有一定的热稳定性, 易被人体消化道的部分蛋白酶降解, 并且不会在体内积蓄引起不良反应。因此，乳酸菌制剂作为一种天然防腐保鲜剂，有着广阔的市场前景。
第2章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 样品
市售进口奶酪
2.1.2 培养基
1、BCG 培养基：A 、B 液灭菌后混匀。
A 液：脱脂奶粉50g,1.6%溴甲酚绿酒精液0.35ml, 蒸馏水250ml.(90℃，开盖灭菌10min)
B 液：酵母膏5g, 琼脂10g, 蒸馏水250ml 。(PH 6.8 , 121℃灭菌20min) A、B 液灭菌后在无菌状态下混匀后倒平板。
2、MRS 液体培养基：蛋白胨10g 、牛肉膏10g 、酵母膏5g 、葡萄糖20g 、乙酸钠5g 、柠檬酸三铵1.45g 、K 2HPO 4·H 2O 2.6g、MgSO 4·7H 2O 0.58g、MnSO 4·4H 2O 0.25g 、吐温80 1.0g、蒸馏水1000mL 。(PH 6.2～6.4 , 121℃ , 灭菌20min) 。 3、PY 培养基（100mL ）：蛋白胨1.0g ，酵母提取物1.0g ，无机盐溶液4.0mL （盐溶液成分:无水CaCl 2 0.2g ，MgSO 4 20.0g ，K 2HPO 4 1.0g ，KH 2PO 4 1.0g ，NaHCO 3 10.0g，NaCl 2.0g，将CaCl 2和MgSO 4一起溶解于300mL 蒸馏水中，再加500mL 蒸馏水，一边搅拌一边缓慢加入其他盐类，继续搅拌直到全部溶解，加蒸馏水定容至1000mL ，混合后贮备于4℃) 。
4、PYG 培养基：PY 在基础培养液内加入1.0g 葡萄糖。
5、SS 培养基：牛肉粉5g 、月示胨5g 、三号胆盐8.5、枸橼酸钠8.5g 、乳糖10g 、枸橼酸铁1g 、硫代硫酸钠8.5g 、中性红0.025g 、煌绿0.00033g 、琼脂17g 、蒸馏水1000m L 。
2.1.3 指示菌种
单增李斯特菌（Listeria monocytogens）、阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium ）、大肠杆菌（Escherichia coli）：均购于广东微生物菌种保藏中心。
2.1.4 试剂
脱脂奶粉：光明乳业股份有限公司；
1.6%溴甲酚绿酒精溶液：自配；
琼脂：生化试剂, 福建泉州市泉港化工厂；
酵母膏：生化试剂, 原上海酵母厂；
蛋白胨：生化试剂, 上海化学试剂采购供应站中心化工厂；
牛肉膏：生化试剂, 北京奥博星生物技术有限责任公司；
葡萄糖：分析纯试剂, 国药集团化学试剂有限公司；
乙酸钠：分析纯试剂, 成都科龙化工试剂厂；
柠檬酸三铵：分析纯试剂, 上海试四赫维化工有限公司；
磷酸氢二钾：分析纯试剂, 上海光铧科技有限公司；
MgSO 4·7H 2O ：分析纯试剂, 上海美兴化工有限公司；
MnSO 4·4H 2O ：分析纯试剂, 上海美兴化工有限公司；
吐温80（聚山梨酯-80）：分析纯试剂, 上海申宇医药化工有限公司。
2.1.5 仪器和设备
LDZX-50FBS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；
SHP-150恒温培养箱：上海山连实验设备有限公司；
电子显微镜：上海欣茂仪器有限公司；
CA-1390-1垂直层流洁净工作台：上海上净净化设备有限公司；
电热鼓风干燥箱：北京市永光明医疗仪器厂；
FL-1可调式封闭式电炉：北京市永光明医疗仪器厂；
GL-21M 高速冷冻离心机：上海市离心机械研究所有限公司；
其他器材：烧杯、玻璃棒、吸量管、洗耳球、胶头滴管、涂布棒、试管等。
2.2方法
2.2.1 样品的处理
奶酪的处理：以无菌操作取奶酪1g ，放入含有9mL 灭菌加热至含40℃左右的生理盐水的灭菌广口瓶内，待奶酪溶解制成1:10的均匀稀释液，并用无菌生理盐水逐级稀释至10-3、10-4、10-5。
2.2.2 乳酸菌的分离纯化
采用BCG 牛乳培养基对稀释样品中的微生物通过平板倾注法进行分离纯化。以无菌操作取奶酪稀释液10-3、10-4、10-5 各0.1mL 置于灭菌后的平板中，加入15mL BCG 牛乳培养基，带培养基凝固后放入恒温培养箱中，37℃恒温培养24h 。观察结果稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌[3]。
2.2.3 革兰氏染色
洗片→载玻片上滴一滴蒸馏水→玻璃棒蘸取一滴菌液在玻片上→晾干→结晶紫初染1min →水洗→晾干→碘液媒染30s →水洗→晾干→95%酒精脱色20s →水洗→晾干→番红复染→水洗→晾干→镜检。
2.2.4 菌种的扩大培养
配制MRS 液体培养基，分装到试管中(每管约15m L ), 将选出的菌种接种到试管中在37℃条件下扩大培养24h ，在接种到小三角瓶中扩大培养24h 。
2.2.5 乳酸菌的抑菌实验---管碟法
a) 将扩大培养的菌液进行离心(条件: 10000r/min,10min)；
b) 在培养皿中加入约15ml 的牛肉膏蛋白胨培养基；