氨基酸和生物资源 2004, 26(4) :17~19A mino A c ids &Biotic Resources
植物提取物对霉菌的抑制作用*
王丽丽, 田晋奇
(武汉大学生命科学学院, 武汉, 430072)
摘要:以生活环境中常见的霉菌(青霉、米曲霉和黑曲霉) 为试验菌, 选取可能对其有抑制作用的植物, 通过对其有机成分进行粗提, 用滤纸片法筛选对上述霉菌有抑制效果的植物。经查阅相关文献, 得备选植物共25种, 试验后发现黄连抑制作用最强, 其次是丁香和黄芩, 最后对这3种中草药植物的最低抑菌浓度进行定量测定。
关键词:抑制霉菌; 植物提取物中图分类号:Q 946. 887
文献标识码:A
文章编号:1006-8376(2004) 04-0017-03
目前人类已经可以利用抗生素类药物来对付细菌带来的危害, 而对付霉菌还没有特别有效的手段[1]。有些霉菌使衣物、木材、食品等发生霉变, 还有一些给人们带来疾病, 比如爱滋病病人常死于真菌感染。目前抑制真菌的药品多来自化学合成物质, 这些物质多对人体健康有负面影响, 而且在其生产流程中还可能产生污染环境的物质
[2]
75%酒精溶液浸泡植物一周, 得植物浸出液
[5]
。
1. 2. 3 滤纸片法检验植物浸出液的抑菌效果
从培养的平板上收集成熟的霉菌孢子, 滤掉菌丝, 得到均匀的孢子悬液, 涂布于查氏培养基平板。在平板底部划线分区, 将蘸有不同浸出液(经过细菌过滤) 的滤纸片贴在相应的区域。每个平板设一对照区, 此区滤纸片仅含体积分数75%酒精。每种浸出液至少做5组平行实验, 减小偶然误差。3d 后测量抑菌圈的大小。实验植物[6]分为二大组:
第一组:A 竹叶、B 蒲公英、C 金银花、D 桑叶、E 丁香、F 甘草、G 芦荟、H 黄连、I 大黄、J 黄芩。第二组:A 野葡萄、B 车前、C 虎杖、D 湿地松、E 构叶、F 鳞毛蕨、G 紫花益母、H 落叶、I 杠板归、J 小叶栗、K 龙柏、L 胡枝子、M 火焰草、N 辣椒。1. 2. 4 抑菌浓度的定量测定[7]
将初筛确定的有抑菌或杀菌效果的植物5g 浸泡于10mL 体积分数为75%的酒精一周。将此浓度定为1, 在此基础上稀释成3/4、1/2、1/4、1/8、1/16倍的系列溶液, 用滤纸片法分别进行抑菌测定, 每组设5个重复, 3d 后测量抑菌圈大小, 并计算平均值。2 结果与分析
2. 1 具有抑菌作用的中草药初筛
表1-a 、b 所列数据均为最大抑菌圈宽度, 以(最大抑菌圈直径-滤纸片直径) A 2表示, 其中滤纸片直径为7m m 。
由于各平板中真菌的生长速度不同, 统计数据不很均一。其中有个别组实验数据差别较大, 推测是由某些不确定因素如滤纸片蘸取药液量的多少, 抑菌物质的不稳定性(易挥发、易分解等) 所造成的, 。从植物
中提取抑菌物质这一思路旨在寻找既可有效对付霉
菌又不影响环境的物质, 开发中草药宝库的资源。1 实验材料与方法1. 1 材料:
待鉴定植物;
菌种:产黄青霉(Penicillium chrysogenum ) AF93073、米曲霉(Aspergillus oryz ae ) AF91012、黑曲霉(A sp ergillus niger ) AF91004, 均由中国典型培养物保藏中心(CCTCC) 提供。1. 2 方法:
1. 2. 1 培养基:产黄青霉:查氏培养基; 米曲霉:淀粉培养基; 黑曲霉:淀粉培养基。1. 2. 2 材料选择:
将淀粉培养基平板在日常生活环境中开盖放置20m in, 然后置于37e 恒温箱中3~4d 。在此期间时常观察霉菌的生长情况, 选择待测霉菌。环境中收集的霉菌中, 青霉比例最高且较为典型, 据此以CCTCC 提供的产黄青霉作为抑菌效果初筛的实验菌株。浸出液制备采用酒精浸泡法, 用体积分数
收稿日期:2004-06-15
作者简介:王丽丽, 女, (1982~) 本科生
* 武汉大学大学生业余科研基金资助项目, 在本院生物学实验教学中心大学生科学研究训练实验室完成。指导教师:陈向东。
[4]
[3, 4]
#18#
王丽丽等:植物提取物对真菌的抑制作用
表1-a 第一组实验植物的抑菌效果
提取液 A B C *D E F *G H I J 对照
10. 250. 000. 000. 002. 501. 501. 005. 000. 001. 000. 00
20. 500. 250. 000. 003. 503. 002. 255. 500. 001. 000. 00
抑菌圈宽度(mm)
30. 500. 250. 000. 253. 502. 503. 005. 500. 002. 000. 00
40. 250. 500. 000. 002. 253. 001. 506. 000. 251. 000. 00
5O. 750. 250. 500. 253. 002. 250. 003. 000. 501. 000. 00
边缘不清晰, 继续放置, 抑菌范围渐渐变小, 可推知金银花的抑制效果并不持久。黑曲霉平板的实验结果如图1-c:可见仅有黄连有较大的抑菌圈。
表1-b 第二组实验植物的抑菌效果
提取液 A B C D E F G H I J K L M N 对照
10. 004. 002. 0011. 50. 004. 006. 505. 000. 503. 003. 008. 002. 006. 500. 00
抑菌圈宽度(mm) 21. 001. 001. 001. 001. 000. 003. 005. 000. 002. 503. 506. 5011. 507. 500. 00
30. 005. 005. 001. 0011. 500. 000. 003. 000. 006. 500. 502. 504. 004. 000. 00
40. 001. 001. 501. 006. 500. 000. 001. 507. 503. 006. 500. 006. 500. 500. 00
54. 000. 000. 002. 509. 000. 006. 505. 500. 003. 002. 008. 006. 504. 000. 00
图1 植物提取物对不同真菌的抑制。
a. 青霉平板:1甘草2黄连3黄芩4丁香5金银花6. 对照
b. 米曲霉平板:1对照2丁香3黄芩4黄连5甘草6金银花c. 黑曲霉平板:1金银花2对照3丁香4黄芩5黄连6. 甘草
将黄芩、黄连、丁香进行梯度稀释, 检测其最低抑菌浓度。从表2-a 可见, 黄芩在浓度为1时效果比较明显, 但随着浓度的下降抑菌效果下降比较大, 在浓度为1/2以下时, 几乎无抑菌作用。而丁香、黄连则分别在1/4和1/8时仍有较明显的抑菌能力见
表2-a 黄芩抑菌限制浓度实验/mm
平板编号12345平均
不同稀释浓度下黄芩抑菌直径
11. 002. 001. 001. 002. 501. 60
3/40. 001. 500. 000. 000. 000. 30
1/20. 001. 000. 000. 000. 000. 20
1/40. 001. 000. 000. 000. 000. 10
1/80. 000. 000. 000. 000. 000. 00
1/160. 000. 000. 000. 000. 000. 00
*培养1~2d 时曾产生很大的抑菌圈, 但继续培养时缩小消失。
2. 2 5种具有抑菌能力植物的进一步分析根据以上数据选定5种抑菌圈较大且较均一的
植物, 包括黄连、丁香、黄芩、金银花和甘草。用它们进一步重复实验并延长培养时间, 典型的实验结果照片如图1-a 。抑菌圈宽度最大的为黄连(12. 5mm) , 金银花(6. 5mm ) 虽然抑菌圈很大, 但抑制时间短, 放置时间长抑菌圈内会有菌苔长出。丁香(4. 5mm) 和黄芩(4. 0mm ) 的抑菌圈为黑色。甘草的抑菌圈不明显。黄连, 丁香和黄芩的抑制效果非常持久。因此最后确定它们为最有效且持久的抑菌植物。
为了检验选出的植物浸出液的抑菌效果是否具有普遍性, 又以米曲霉和黑曲霉涂布平板检验。米曲霉平板的典型实验结果如图1-b:可见黄连产生边缘清晰的较大抑菌圈, 丁香的效果也比较明显, 黄芩和甘草的抑菌圈较小。与青霉平板不同的是, 金
, 表2-b 黄连抑菌限制浓度实验/mm
平板编号12345不同稀释浓度下黄芩抑菌直径
18. 508. 505. 506. 007. 003/46. 007. 005. 503. 504. 001/22. 504. 504. 502. 002. 001/40. 002. 002. 501. 501. 501/80. 001. 001. 000. 000. 501/160. 000. 000. 000. 000. 00
氨基酸和生物资源
#19#
表2-b 、c 。由此计算可得3种植物的抑菌浓度下限分别为:黄芩0. 25g #mL -1, 黄连0. 0625g #mL
-1
剂萃取出来, 再进一步检测是哪一种成分在起作用, 并提取制成一种纯净的制剂[8]。因为它来自天然植物(中药) , 既可达到抑菌的效果又不会对人体产
生不利影响, 可广泛用于食品添加剂, 衣物防腐剂等[9]。
, 丁香为0. 125g #mL
-1
。
表2-c 丁香抑菌限制浓度实验/mm
平板编号12345平均
不同稀释浓度下丁香抑菌直径
15. 001. 502. 00) ) ) 3. 503. 00
3/41. 000. 001. 50) ) ) 5. 001. 87
1/22. 000. 000. 00) ) ) 0. 500. 63
1/41. 000. 000. 00) ) ) 0. 500. 38
1/81. 000. 000. 000. 000. 000. 20
1/160. 000. 000. 000. 000. 000. 00
参考文献
[1] 沈萍. 微生物学[M], 高等教育出版社, 2002. 1[2] 邢来君, 李明春. 普通真菌学[M ], 高等教育出版社,
2001. 6
[3] [美]A. N 格拉泽, 二介堂弘陈守文, 喻子牛等译. 微
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育出版社, 1999. 6
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卫生出版社, 1980
[6] 谭仁祥主编植物成分分析[M ], 科学出版社, 2002[7] 赵宝玉李绍君等桔皮提取物抑制霉菌试验[J].动物
医学进展, 1998; 19(2) :30~33
[8] 黎海彬李琳郭祀远蔡妙颜药用植物有效成分提取
技术[J]. 现代化工, 2002; 22(5) :59~62
[9] 董新荣曾国建北美黄连主要生物碱的提取与分离
[J]. 精细化工中间体, 2001; 31(3) :33~35
注:%%是被污染平板
3 讨论
本实验通过滤纸片法检测了24种植物浸出液对青霉的抑制作用, 并对其中抑菌效果最好的3种植物的抑菌效果进行了定量检测。为了检验选出植物的抑菌效果是否有普遍性, 后来以米曲霉和黑曲霉重复实验, 不同植物浸出液对不同霉菌的抑制作用有所差别, 但黄连对它们都有较好的抑制效果。可见黄连抑制霉菌的效果是非常突出的, 有潜在的应用价值。可以对黄连的有效成分用不同极性的溶
In Vitro Activity of Plant Extracts Against Moulds
WANG Li-li, T IAN Jin-qi
(College of L if e Science, Wuhan University , Wuhan 430072, China)
Abstract:The crude extracts from 25plants were used to inhibit mould (Penicillium chry sogenum , As -p ergillus ory z ae and Aspergillus niger ) in proper method. It could can be found that Chinese goldthread inhib -ited mould fiercely, then clove and skullcap. The critical concentrations of the three plants:skullcap of 0. 25g /ml, Chinese g oldthread of 0. 0625g/m l and clove of 0. 125g/ml.
Key words:inhibiting mould; plant ex tracts