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内江师范学院学报
JOURNALOFNEIJIANGNORMALUNIVERSITY第26卷第4期No.4Vol.26
铁皮石斛多糖研究进展
付伟丽, 黄作喜, 唐正义, 段辉国, 王 芳
(内江师范学院生命科学学院, 四川 内江 641100)
摘 要:分类综述了铁皮石斛多糖的提取工艺、含量影响因素以及扩大其药源的方法等方面的研究,为合理地开发应用铁皮石斛多糖资源提供参考.
关键词:铁皮石斛;多糖;研究进展中图分类号:Q539
文献标志码:A
文章编号:1671-1785(2011)04-0040-05
铁皮石斛(DendrobiumcandidumWall.exLindl)是兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生附生草本植物,干品称为铁皮枫斗,是我国传统名贵中药[1],是石斛中的极品.石斛的药用部分是新鲜或干燥茎,有益胃生津、滋阴清热、免疫调节、延缓衰老等功效;用于阴伤津亏,口干烦渴,食少干呕,病后虚热,目暗不明斛类多糖及生物碱等
[1]
[2]
提2h,加水量20倍,提取3次,醇析时乙醇的浓度为80%.粗多糖脱蛋白时,氯仿/正丁醇(v/v)为1 0 4,粗多糖样品/氯仿+正丁醇(v/v)为1 0 35,萃取时间采用5min最佳.
周术涛等[12]采用均匀设计与正交设计联用的方法对铁皮石斛多糖的提取工艺进行优选.优选出来的铁皮石斛最佳提取工艺条件为温度85 ,提取时间3h,液料比20倍时,提取的总多糖得率最高为24 9%.
由此看来,经正交设计等方法所优选的工艺,均较合理,提取率高,适用于工业生产.1 2 超声提取法
超声提取法主要是超声波破坏植物细胞组织,使之变形、破裂并释放出内含物,同时加速植物有效成分在溶剂中的扩散释放,促进植物有效成分与溶剂混合,有利于萃取[9].
叶余原[13]进行了超声法提取铁皮石斛多糖工艺的研究,考察了提取温度、固液比、提取时间和超声频率4个因素对铁皮石斛多糖提取得率的影响.在单因素实验的基础上,通过正交试验优化提取工艺.综合确定的优化提取工艺条件为:1 30的料液比,50 超声水浴,45kHz超声频率,提取1 5h,铁皮石斛多糖的平均提取得率为15 3%.超声提取法的多糖得率大于常规水提法,更加高效.具有提取时间短、方法简单、收率高且无需加热等优点[14].1 3 微波提取法
微波具有穿透力强、选择性高、加热效率高等特点,故应用微波技术破碎细胞壁并提取有效成分,可以显著提高提取效率[9].
尚喜雨[15]以水为提取剂,在不同微波功率、固液比、浸提时间及pH等条件下进行正交实验,来确定各因素不同水
.铁皮石斛主要有效成分为石
[3 6]
.有人比较了石斛属的多种植物,发
.随着人们对多糖功效
现多糖是铁皮石斛的特征性成分
认识的增多,已有人发现铁皮石斛多糖具有较强的抗肿瘤的生物活性[7 8],故近年来,对铁皮石斛多糖的研究逐渐增多.这些研究主要围绕多糖的提取方法、分布及含量、药理作用以及如何扩大多糖来源等方面进行.现将相关研究进展进行如下综述.
1 铁皮石斛多糖提取方法
1 1 水提法
赵纪峰等[9]认为,水提法是用来提取多糖的最常用方法之一,可以热水浸提,也可冷水浸提.用得较多的是热水浸提.该法所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物;也可利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质,用高浓度乙醇沉淀提纯多糖.同时由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同,它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离.在粗分阶段还可利用混合溶剂提取法对植物中不同的多糖成分进行分离.
熊丽萍等[10]运用正交实验设计对水煎提取石斛中的石斛多糖工艺进行优选,得出了最佳的工艺条件.何铁光等[11]对铁皮石斛悬浮培养原球茎多糖的提取、纯化条件进行优化研究,正交试验结果表明,提取的最佳工艺为80 热水中浸
收稿日期:2010 02 25
,.
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平对石斛多糖提取量的影响.结果表明:在微波功率400W,pH为8,微波作用时间6min;1:50的条件下多糖提取量为17 48%.说明微波辅助提取铁皮石斛多糖,多糖得率较高.1 4 酶提法
尚喜雨[16]分别以水提法和酶法提取石斛多糖,通过正交试验,比较石斛多糖的提取率,找出了水提法的最佳条件,且在此条件下多糖的平均提取量为12 07%;而在酶提法中,使用4%的酶量、在40 水温和pH为6的环境下酶解3h,多糖含量测得为26 49%,比水提法提高了119%,由此他认为酶法提取石斛多糖优于水提法.张萍等[17]也采用正交实验确定了酶解的最佳条件,使多糖含量增加至15 02%,比水煮法提高了2倍.
酶提取能够提高多糖的提取率及多糖含量,可能是因为酶对铁皮石斛中游离蛋白质具有水解作用,提取液中只含少量蛋白质,同时降低了它们与原料的结合力,有利于多糖的浸出.所以酶法是一种理想的提取方法[17].
在众多的提取方法中,均匀设计和正文试验联用法适宜工业化生产,超声波和微波提取法、简便易行,多糖得率较高;酶提法大大提高多糖得率,但要求严格,是发展的方向.
毛灵芝[24]通过在不同季节对最佳石斛品种进行四个不同的遮阴条件(遮阴强度:A>B>C>D)处理,发现二年生茎以B遮阴下的石斛多糖含量最高.这说明适宜的光照强度有利于多糖的积累.
徐琳娜[25]在对野生铁皮石斛在石生生境和树生生境条件下生长对比研究发现,通过调节人工大棚种植的各项生境因子,达到了最好的种植效果.人工栽培铁皮石斛,水分利用效率较高,产量最高,干重率较高,多糖含量较高,约为16 2%,微量元素含量丰富,可以作为优质中药材铁皮枫斗的原料,有较好的生态效益和经济效益.说明适宜的水分以及矿质元素有利于多糖的形成.
野生和人工栽培铁皮石斛多糖含量存在差异.尚喜雨[22]采集云南绿春的野生植株、云南蒙自的组培苗以及购自云南屏边一年生和两年生栽培植株,用微波辅助法提取石斛多糖,发现野生型铁皮石斛多糖含量多于栽培型.黎万奎等[26]发现人工栽培铁皮石斛总多糖含量与铁皮枫斗相近.诸燕等[27]发现全国人工栽培骨干基地生产的铁皮石斛,其多糖质量分数普遍高于野生药材,且种质与生长年限显著影响多糖质量分数.铁皮石斛品种选育与采收年限的控制可提高多糖质量分数,浙江产区铁皮石斛最佳采收时间为两年生冬季至三年生开花前.
综上,如果条件控制得当,人工栽培铁皮石斛的多糖含量是可以接近甚至超过野生型的.姜殿强等[28]岩溶生态环境条件下不同生境铁皮石斛多糖含量的比较研究结果也说明了这一点,并且他通过长期野外监测发现,石生、树生和棚生铁皮石斛的温度、湿度和光照都非常接近,这也是不同生境中铁皮石斛多糖含量相同的主要原因.
2 铁皮石斛多糖的含量
多糖的含量测定方法有苯酚-硫酸法[5]、3,5 二硝基水杨酸法[18]、分子光谱法[19]等.
2 1 不同器官组织、不同生长期多糖含量不同
无论是野生苗还是人工栽培苗,都是茎中多糖含量最高,又尤以二年生的茎中多糖含量最高.
何铁光[20]发现,野生铁皮石斛茎中的多糖含量随年份不同含量差异较大,多年生茎中的多糖含量最高,其次是叶.华允芬[21]也发现铁皮石斛的多糖含量是茎>根;尚喜雨[22]对铁皮石斛的组培苗、野生植株、栽培植株中多糖的含量及分布进行了系统的分析和研究,也发现铁皮石斛的多糖含量很高,尤以茎段为最;不同部位的含量存在一定差异,茎部的差异要大于根、叶.这说明传统用药上铁皮石斛以茎为入药部分在主要化学成分分析上是合理的.
也有人对铁皮石斛的组培产物原球茎的多糖含量进行了测定,发现原球茎与野生品的多糖和总氨基酸含量相近[23].初步证明以组织培养获得的铁皮石斛原球茎代替其野生品是解决铁皮石斛资源紧缺的有效途径.2 2 不同品种铁皮石斛的多糖含量不同
不同品种的铁皮石斛中,多糖含量又存在差异.毛灵芝[24]对铁皮石斛的三个品种:进行了比较,发现各品种均以二年生茎的多糖含量最高,宽叶石斛>窄叶石斛>青梗石斛.故在铁皮石斛的栽培中,应增加对宽叶品种的引种栽培.2 3 在不同生长条件下,多糖含量不同
不同的生长条件,会对铁皮石斛的代谢产生影响,从而影响多糖等代谢产物的含量.影响因素有光照、水分、矿质元素等.这些因素通过影响光合作用等代谢活动的强度,从而3 铁皮石斛多糖的药理作用
铁皮石斛有三种多糖,它们为一类O-乙酰葡萄甘露聚糖.铁皮石斛多糖的药理作用广泛,主要有增强免疫力、抗肿瘤、降血糖等作用[29].
3 1 增强免疫作用以及抗肿瘤作用
铁皮石斛多糖能够显著提升小白鼠外周白细胞数和促进淋巴细胞产生移动抑制因子,强有力地消除实验条件下免疫抑制剂环磷酰胺的加入所引发的副作用[30 31].因此,它能够提高机体的免疫功能,是一种很有价值的中药类免疫增强剂.
高建平等[32]发现,铁皮石斛组织培养原球茎有升高环磷酰胺模型小鼠外周血白细胞数,增加模型鼠胸腺或脾脏指数,增强巨噬细胞的吞噬功能,促进模型鼠体内淋巴细胞转化的作用,最大耐受量相当于人临床用药量的227倍.
何铁光等[23]从铁皮石斛原球茎粗多糖(DCPP)中分离纯化得灰色粉末状多糖DCPP1a-1,发现多糖DCPP1a-1的50、150、250mg/kg剂量组对H22肝癌小鼠有不同程度的抑瘤作用,其中以低剂量组的抑瘤效果最好(P
等[7],石斛白介素-2联
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用,能显著增强PB LAK杀伤活性.
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繁中存在着组培苗生产成本高、移栽苗成活率低、标准化生产程度低等技术瓶颈.
4 2 铁皮石斛原球茎的悬浮培养
作为兰科植物,铁皮石斛在组织培养过程中可以产生大量的原球茎,由于铁皮石斛原球茎的多糖含量与野生品的相近[23],且药理作用相同[32 33],用原球茎代替全植株作为药源成为可能.悬浮培养原球茎并从中提取多糖等药用成分,成本低,效率高,便于标准化生产,同时也解决了野生资源枯竭的问题,故近年人们开始着手进行悬浮培养原球茎并着力提高多糖含量的研究[1].
苏江[52]对比了野生铁皮石斛与原球茎的多糖和氨基酸含量,发现液体培养在生物量、多糖产量等方面均优于固体培养,而且如果培养条件适宜,原球茎与野生铁皮石斛的多糖和氨基酸的含量相近.
何铁光等[53]发现,在葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖4种碳源中,蔗糖和葡萄糖对原球茎生长和多糖积累的影响优于乳糖和果糖.在蔗糖浓度为30~60g/L时,浓度越高,原球茎生长受到抑制越大,而且生长周期延长,但多糖含量增加越快,多糖含量越高;当蔗糖浓度超过60g/L时,蔗糖表现出明显的抑制效应;适合多糖积累的蔗糖起始浓度为30g/L时,有利于原球茎的生长,最大干重量为17 93g/L,多糖最高含量为208 7mg/g,培养40d时,其产量为3679 6mg/L.
韦晓新[54]的研究发现,1/2MS和N6培养基适合原球茎生长和多糖积累.当氮源浓度为30~60mmol/L、NO3-/NH4+分子比为40 20、30 30时,有利于原球茎生长和多糖积累.当6 BA与NAA组合的最佳浓度配比为1 41mg/L、0 36mg/L时,原球茎最高多糖含量为274 2mg/g DW.对原球茎多糖积累的影响程度依次为转速、pH、接种量,当初始培养液pH为5 0、摇床转速为110r/min、接种量为50g.FW/L时,有利于多糖积累.
苏江[52]的铁皮石斛液体悬浮培养生产多糖的实验表明,最适铁皮石斛原球茎增殖和多糖合成的培养方案为:1/2MS+30g/L蔗糖+0 1mg/LNAA+10%椰汁,调整氮浓
、
度为30~60mmol/L,NO-NH4+的比例为40 20,30 3
张红玉等[34]发现,铁皮石斛多糖对S180实体瘤的,其抑瘤率为9 7%~26 8%.铁皮石斛多糖对S180肉瘤小鼠T淋巴细胞转化功能、NK活性、巨噬细胞吞噬功能及溶血素值均有明显提高作用.表明铁皮石斛多糖具有增强免疫功能的作用.
3 2 抗氧化作用
不论是直接从铁皮石斛植株中提取的多糖[35],还是从从铁皮石斛组培物原球茎中提取的多糖[36 37],都具有清除自由基以及抗脂质过氧化作用.而且,不同相对分子质量铁皮石斛多糖均有抗氧化作用,且抗氧化能力与其相对分子质量大小有关[38].3.3 降血糖作用
吴昊姝等[39]采用正常小鼠,肾上腺素性高血糖小鼠,链脲佐菌素性糖尿病(STZ DM)大鼠,用放射免疫分析和免疫组化HRP SPA染色等方法进行研究.发现铁皮石斛可使STZ DM大鼠的血糖值降低、血清胰岛素水平升高、胰高血糖素水平降低,胰岛 细胞数量增多, 细胞数量减少.它还可使肾上腺素性高血糖小鼠血糖降低[40]、肝糖原含量增高.其降血糖的胰内机制是促进胰岛 细胞分泌胰岛素,抑制胰岛 细胞分泌胰高血糖素,胰外机制可能是抑制肝糖原分解和促进肝糖原合成.
4 铁皮石斛多糖药源
铁皮石斛市场需求量大,然而铁皮石斛自然繁殖率低,加之人们过度采收,野生资源已濒临枯竭,因此人们把目光转向了人工栽培以及组织培养.4 1 组织培养及人工栽培铁皮石斛
首先培养组培苗,人工栽培组培苗,然后提取利用其中的多糖成分.铁皮石斛的组培快繁技术发展很快,应用广泛.
目前,铁皮石斛组织用于外植体的主要有种子、原球茎、人工种子及无菌苗幼苗茎段等[41].再生植株获得的方式主要有以下几种:(1)种子 原球茎 小植株;(2)种子 原球茎 愈伤组织 丛芽 生根苗;(3)种子 原球茎 无菌苗茎段 小植株;(4)种子 愈伤组织 原球茎 小植株;(5)原球茎 人工种子 幼苗;(6)茎尖 愈伤组织 丛芽 生根苗等.
在种子萌发过程中,种龄[42]、培养基与激素[43]、添加物与碳源[44]均有明显影响;在铁皮石斛原球茎增殖与分化过程中,培养基与激素[45 46]、添加物与碳源[47]同样会产生影响.在铁皮石斛生根与壮苗阶段,同样要适当的选用培养基与激素[48 49],并加入香蕉汁、马铃薯汁等物质[42].铁皮石斛组培苗移栽时成活率低,因此栽培前要进行炼苗,以增强组培苗对外界环境的适应能力,并应对栽培地、栽培基质等进行选择,以提高成活率[41].组培苗移栽后,还要注意水分、光照、温湿度、营养的控制以及病虫害的防治[50 51],以确保移栽后长势良好.
,30,pH7 0,摇床转速为110r/min,接种量为30g/L或40g/L,光照1000~1500lux,12h/d.2010年苏江又研究了中途添加不同浓度蔗糖对铁皮石斛原球茎多糖积累的影响,发现在培养第20d添加5g/L蔗糖对原球茎多糖积累最为有利,干重量及多糖含量、多糖产量最高,分别为16 02g/L、300mg/g、4805 85mg/L,且在整个培养过程,蔗糖的利用率最高,原球茎的活力最强[55].
真菌诱导子同样有利于多糖的形成[56 58].这是因为某些真菌与铁皮石斛是互利共生关系,有的真菌对铁皮石斛的生长有促进作用[59].
悬浮培养中,碳源、氮源等营养条件以及接种量、摇床转速、pH、激素等因素均会影响多糖的产量.悬浮培养铁皮石斛从中提取多糖的研究目前尚处于起步阶段,因而优化培养
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高多糖得率等仍将是人们努力的方向.另外,随着多糖产量的提高,对多糖的成分、性质以及药理作用的研究也将逐步深入,以为多糖的应用打下基础.
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在野生铁皮石斛资源日益枯竭的今天,人们在如何扩大石斛多糖的药源、怎样提高石斛多糖的得率以及了解石斛多糖的药理作用等方面已有了一定的研究,但其中还有很多问题没有解决,还需要人们做大量的研究,以满足市场的需求.参考文献:
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ResearchAdvancesonPolysaccharidesofDendrobiumcandidum
FUWei li,HUANGZuo xi,TANGZheng yi,DUANHui guo,WANGFang
(SchoolofLifeScience,NeijiangNormalUniversity,Neijiang,Sichuan641100,China)
Abstract:Acategory by categoryreviewisdonetoPolysaccharidesinDendrobiumcandidumitsextractionmethods,
affectingfactorsofthecontentsandwaystoexpandmedicalsources,whichcanserveasafuturereferrencesfortherationaldeveopmentofthepolysaccharidesresource.
Keywords:Dendrobiumcandidum;Polysaccharide;researchadvances
(责任编辑:胡
蓉)