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上海免疫学杂志 2003年第23卷第3期
中青年学者论坛
B 细胞在骨髓发育中的凋亡与调控
吕力为
(香港大学病理学系)
摘要:近年来对细胞凋亡及其调控的广泛研究, 促进了对B 细胞发育及调节机制的理解。我们运用一系列转基因及基因剔除的鼠模型, 研究了B 细胞在各分化阶段的凋亡状况, 发现一些基因具有调节B 细胞发育、影响B 细胞存活的功能。实验证明这些基因能通过影响Bc-l 2家族蛋白的表达而决定细胞凋亡的阈值。有关领域的深入研究, 将有助于理解人类淋巴系统肿瘤及自身免疫性疾病的发生机制, 并为探索治疗这些疾病的新方法提供重要依据。关键词:B 淋巴细胞; 细胞凋亡; 发育生物学
中图分类号:R392 12 文献标识码:A 文章编号:1001-2478(2003) 03-0148-04
B 淋巴细胞在骨髓中的发育与分化是一个动态而复杂的过程。哺乳类动物出生后淋巴细胞前体在骨髓中不断进行分裂增殖形成未成熟的B 淋巴细胞, 然后离开骨髓经血流到达外周淋巴器官进一步成熟。最近十多年来分子免疫学的大量研究使得人们对B 淋巴细胞在骨髓中的发育分化过程有了较为完整的理解。尤其动物转基因及基因剔除技术的应用使人们对淋巴细胞发生及调控机制的认识更加深入。此综述将着重介绍近几年来我们对B 淋巴细胞在骨髓发育中细胞凋亡及其调节机制的研究工作及其进展。
要标志, 是细胞核内TdT 酶及胞浆中 链的表达, 因此需要固定B 淋巴细胞, 运用免疫荧光法检测。Hardy 建立了一个基于细胞膜表达的不同标志蛋白的鼠淋巴细胞发生模型, 运用流式细胞仪将骨髓发育中淋巴细胞分成A 、B 、C 、D 、E 和F 亚群[2]。经流式细胞分选仪纯化的不同分化阶段的B 淋巴细胞亚群, 可进一步作活细胞培养或进行分子生物学研究。近年来单细胞PCR 技术被用来分析纯化的B 细胞的基因重组及表达, 对理解B 细胞发育过程中基因的表达转录机制提供了重要信息。据此, 我们纯化了各B 细胞亚群, 并运用免疫荧光检测细胞核内TdT 酶及胞浆 链的表达, 证实Hardy 的B 细胞亚群与Osmond 模型中B 细胞发生各阶段基本吻合[3]。但我们也发现Hardy 的A 、B 、C 亚群中都有TdT 阳性的早前期细胞的存在, 显示这些亚群中的每个细胞不一定处于同一个分化阶段。由于目前尚没有任何膜表面分子的表达与B 细胞的分化阶段完全同步, 加之流式细胞分选仪在纯化细胞上的限制, 我们认为, 用单细胞PCR 技术研究B 细胞发生时, 对结果的解释和分析应保持慎重。近年来Melchers 和Rolink 实验室成功地结合上述两模型对早期淋巴细胞发生过程中基因的重组及免疫球蛋白的表达进行了深入研究并提供了丰富的数据[4]。可以预见不久的将来一个完善而统一命名的B 细胞模型有可能被建立而广泛应用。
1 B 细胞在骨髓中的发育过程
哺乳类动物在出生后骨髓成为B 淋巴细胞发生的主要场所。造血干细胞在此分化成为淋巴系定向干细胞。通过大量的细胞动力学的研究, Osmond 实验室较早提出了B 细胞在骨髓中的发育分化的模型, 将B 细胞的发育过程大致分为三个主要阶段[1]。首先是来源于定向干细胞的早前期B 细胞(或原B 细胞, Pro -B ) 。在此时期细胞核内的免疫球蛋白(Ig ) 重链基因在重组激活酶RAG -1和RAG -2作用下开始发生重组, 同时末端脱氧核糖核苷转移酶(TdT) 也在此阶段被激活。因TdT 可被免疫荧光法检测到而作为早前期B 细胞的标志酶。早前期B 细胞在完成Ig 重链的重组后分化为前期B 细胞(Pre -B ) , 开始在胞浆内合成 链多肽。随后, Pre -B 细胞启动轻链 或 的基因重组合成轻链多肽。当重链和轻链结合并在细胞膜表面表达完整的Ig M 分子时, 这些细胞分化成为未成熟B 细胞(imma -2 B 细胞在发育中的凋亡
1983年Osmond 实验室通过细胞动力学研究最
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细胞死亡或丢失, 放射自显影术证实了I 标记的前期B 细胞在骨髓中迅速被巨噬细胞吞噬而降解。我们运用不同的实验方法证明发育中B 细胞的丢失是由凋亡造成[6]。从新鲜骨髓纯化的细胞中, 一些B 细胞在电子显微镜下表现出凋亡的形态学特征:细胞膜形成皱褶, 胞核异染色质浓缩; 一些B 细胞的核碎裂并形成由膜包裹的凋亡小体。由于大量凋亡的细胞迅速被周围的吞噬细胞吞噬消化, 因此体内实验难以反映细胞凋亡的程度。运用骨髓细胞离体短期培养技术, 我们发现新鲜分离的B 细胞在无血清基本营养液中培养6~8h 后凋亡的细胞可聚集在培养液中而不被吞噬细胞吞噬。用免疫荧光抗体标记及核染色, 凋亡B 细胞易被流式细胞仪检测, 在新鲜分离的骨髓细胞悬液中凋亡B 细胞约占1 2%左右。进一步的研究发现B 淋巴细胞在两个发育阶段发生凋亡最为显著:一是介于早前期B 与前期B 细胞之间; 二是未成熟B 细胞刚开始表达IgM 时。早前期与前期交界阶段正是前期B 细胞进行重链切割和连接的重组阶段。单细胞PC R 研究近来证实高达80%的早前期B 细胞不能完成重链重组, 因负性选择而凋亡。当未成熟细胞开始表达IgM 时, 将会遇到并识别骨髓微环境中的自身抗原。部分表达抗自身抗原受体的B 细胞与抗原结合后被诱导凋亡而清除。我们的研究证实, B 细胞在不同的发育阶段Bc-l 2家族蛋白的表达量不同; 胞内Bc-l 2与Bax 蛋白的表达量比率与细胞
凋亡和存活密切相关。因此, Bc-l 2家族蛋白在B 细胞凋亡的信号传递通路中起着重要作用。细胞凋亡的信号调节机制研究表明, Bc-l 2家族蛋白的表达及活性受细胞内源及外源信号的调节, 进而激活Caspase 酶, 最后导致细胞的降解与凋亡。通过检测不同时间段B 细胞的凋亡频率, 我们建立了正常B 细胞在各发育阶段的凋亡曲线。运用转基因和基因剔除的鼠模型, 证实凋亡曲线的斜率可准确地反映B 细胞在体内的凋亡程度。据此我们率先提供了鼠B 细胞发生的动力学模型, 并推测经大量凋亡筛选后每天大约有一千万左右的未成熟B 细胞在骨髓产生[6]。
[6]
[5]
基因对B 细胞发育及凋亡有重要的调节作用。3 1 RAG 基因 重组激活基因RAG -1及RAG -2的活性对B 细胞发育成熟起着决定性作用。在RAG 基因剔除的鼠骨髓及外周淋巴细胞中没有前期B 及成熟B 细胞, 证实免疫球蛋白基因的重组、重链的合成对B 细胞的分化与成活十分关键。我们
-/-的研究发现RAG -2鼠骨髓中早前期B 细胞的凋亡
频率比正常对照高1 5倍。短期活细胞培养实验数据与早期细胞动力学的推测一致, 显示正常鼠骨髓中70%的早前期B 细胞在发育中凋亡。进一步
-/-实验发现RAG -2早前期B 细胞Bc -l 2蛋白表达量
[7]
没有显著变化, 但Bax 蛋白表达量较正常早前期细胞显著增高。因此, Ba x 与Bc -l 2蛋白的比率的升
-/-高可能促使RAG -2早前期B 细胞的凋亡。
3 2 p53基因 p53是一重要肿瘤抑制基因, 当细胞核内双螺旋DNA 链受到损伤时, 此基因被激活, 抑制细胞分裂并诱导细胞凋亡。我们的研究发现[8], p53基因剔除的鼠骨髓中早前期B 细胞数量较正常鼠增多, 而此细胞群体的凋亡频率较正常对
-/-照明显降低。p53的前期B 及未成熟B 细胞的凋亡动力学与正常鼠相比无明显变化。这些实验数据提示, p53基因在早前期B 细胞阶段有促进凋亡的作用, 诱导不能成功完成免疫球蛋白基因重组的前期B 细胞通过凋亡而被剔除; 与B 细胞受体表达有关的未成熟B 细胞阶段的凋亡显然不受p53基因的调控。
3 3 白细胞介素-7(IL -7) 基因 IL -7是由骨髓基质细胞分泌的细胞因子, 对B 细胞发育分化分裂起着重要作用。在IL -7基因剔除的鼠骨髓中, 早前期B 细胞的数量没有明显变化, 但前B 细胞和未成熟B 细胞较正常鼠减少10倍。在早前期和前期B 细胞交界阶段的前体细胞的凋亡频率显著增高。值得注意的是IL -7未成熟细胞的凋亡频率与正常细胞相比无明显变化。我们对IL -7转基因(IL -7Tg ) 鼠的研究发现[7], 前期和未成熟B 细胞群体的数量显著增大。前期细胞的凋亡频率及程度较正常对照减少一半, 然而I L -7Tg 未成熟细胞凋亡的动力学与正常细胞一致。前期细胞中Bc-l 2和Bax 的比率与细胞的凋亡频率变化密切相关。这些研究证实IL -7不仅促进前期B 细胞的分裂增殖, 尚能调节Bc -l 2家族蛋白的代谢而显著延长这些细胞的存活。I L -7转基因鼠中常观察到有白血病前期的表-/-
3 B 细胞凋亡的调控
骨髓内B 细胞的发育依赖于内源性基因的调
节和造血微环境提供的支持及营养因子。我们研究,
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常的前期B 细胞在骨髓中未能经受凋亡清除而进入外周淋巴器官, 导致病理性改变。进一步的研究可能有助于对淋巴细胞白血病发病机制的理解。3 4 热稳定抗原(HSA) 基因 HSA (CD24) 是前体B 细胞表达的膜糖蛋白, 但其在B 淋巴细胞发育中的作用尚不明了。早期的实验发现HSA 在早前期B 细胞表达最高, 然后在前期B 细胞逐渐下降, 在未成熟B 细胞阶段表达最低。我们对HSA 转基因鼠的研究揭示前期B 细胞数量较正常鼠减少一半, 并伴有显著增高的凋亡频率。其他B 细胞群体没有明显变化[9]。值得提及的是其他实验室对HSA 基因剔除的鼠骨髓研究发现B 细胞发育也在前期B 细胞阶段严重受损, 细胞数量显著减低。这些结果提示HSA 的表达量及表达时间可能决定前期B 细胞凋亡的阈值, 但HSA 选择性的调节前期B 细胞凋亡的机制目前尚不清楚, 有待进一步研究。
3 5 克隆刺激因子-1(CSF -1) 基因 C FA -1对单核巨噬细胞系统细胞的发育起着重要作用。先前的研究证实OP/OP 鼠体内CSF -1基因有自发性突变, 严重影响巨噬细胞及破骨细胞的发育及功能。由于OP/OP鼠外周血中呈现一定程度的淋巴细胞降低, 因此我们系统地研究了OP/OP 鼠骨髓中淋巴细胞的发生与分化[10]。实验发现, 由于骨髓腔容量显著减少, OP/OP鼠骨髓细胞数量明显下降, B 细胞的数量减少尤为显著。前期B 细胞的数量只有正常对照鼠的2%; 未成熟B 细胞减少至对照组的5%; 但早前期B 细胞未受明显影响。凋亡动力学的实验显示OP/OP鼠骨髓前期B 细胞的凋亡频率较正常对照组明显增高。但IgM 的未成熟B 细胞的凋亡程度没有明显改变。在骨髓细胞短期培养中加入外源性CSF -1生长因子, 能显著抑制前期细胞的凋亡。但CSF -1与纯化的B 细胞一起培养对其凋亡没有明显影响。尽管我们用免疫荧光抗体标记发现B 细胞膜表达CSF -1受体, 但CSF -1可能作用于基质细胞或其他非淋巴细胞成分而间接地影响发育中B 细胞的存活。CSF -1是否可促进骨髓基质细胞分泌IL -7, 从而影响B 细胞的发育与存活有待进一步证实。
+[2]
段。这些基因包括B 细胞本身表达的基因如
RAG -2、p53及HSA, 局部骨髓微环境基质细胞分泌的细胞因子如IL -7, 以及一些系统因子如CSF -1。
RAG 和p53对免疫球蛋白基因的重组起着重要的调节作用, 且选择性地作用于早前期B 细胞阶段。HSA 和C SF -1以及最近克隆的新基因HK -1[12]对B 细胞的发育及凋亡的影响主要在前期B 细胞阶段。IL -7对前期B 细胞作用最为显著; 这与IL -7受体主要表达在早期B 细胞的结果一致。所有这些基因显然参与早前期与前期B 细胞交界阶段的早期B 细胞凋亡调控, 而未影响未成熟B 细胞阶段凋亡调节。目前已知大量新生的B 细胞在骨髓内经负性选择而发生凋亡剔除。目前认为这一阶段B 细胞的筛选失调与自身免疫性疾病的发生有密切关系, 因此研究和阐明能调节未成熟B 细胞凋亡的基因及有关机制变得十分重要。我们最近的实验结果提示, 肿瘤坏死因子家族的细胞因子对新生B 细胞的存活及最后成熟起着关键的调节作用。研究B 细胞的发育与调控有助于阐明B 细胞淋巴瘤及有关自身免疫性疾病发生机制。对B 细胞凋亡调节机制的进一步理解将为探索这些疾病的新方法提供重要依据。参考文献
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4 展望
我们近期的工作发现了一些基因具有调节B
上海免疫学杂志 2003年第23卷第3期
cific tachyki nin that regulates B lymphopoiesi s [J ] Nature Immunol, 2000, 1:392 作者简介:
吕力为(LVL-i wei ) :1983年毕业于江苏镇江医学院医疗系。
1990年获白求恩医科大学医学硕士。1993~1997年在加拿大麦吉尔大学学习并获博士学位。1997年任美国俄克拉荷马医学研究中心
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访问科学家。1998~2000年在多伦多大学从事博士后研究工作。1995~2000年先后获加拿大医学研究委员会博士奖、博士后奖、A mgen 博士后奖和加拿大白血病基金会David Rae 奖。2000年起任香港大学病理学系助理教授, 从事淋巴细胞发生和自身免疫病发病机制及免疫治疗的研究。Email:liweilu@hkucc hku hk
带状疱疹患者血清sICAM -1水平的变化
张忠奎1, 章宗亮2, 杨 林2, 牟发明2, 冯小青2
(1 成都军区总医院皮肤科, 成都 610083; 2 解放军37医院康定分院, 四川省甘孜州康定县 626000) 关键词:带状疱疹; 可溶性细胞间粘附分子-1; 高原
+
中图分类号:R752 12 文献标识码:B 文章编号:1001-2478(2003) 03-0151-01 细胞间粘附分子1(ICAM -1) 在免疫和炎症反应中起重要作用, 可溶性细胞间粘附分子1(sICAM -1) 是ICAM -1脱落循环产物, 具有ICAM -1的生物学特性。有报道
[1]
原地区的常见病, 由水痘-带状疱疹病毒感染引起的皮肤丘疹、水疱等炎症性损害。炎症性损害的发生与细胞因子、粘附分子有关[3]。
IC AM -1属于免疫球蛋白超家族粘附分子, 可在淋巴细胞、角质形成细胞等各种细胞表面表达, 炎症介质如IL -1及病毒感染能引起体内炎症局部细胞膜上ICAM -1表达增加, sICAM -1是ICAM -1的脱落循环形式。我们的实验结果发现, 高原地区正常人血清中有低水平sIC AM -1表达, 带状疱疹患者血清sICAM -1显著升高, 与正常对照组相比有显著性差异, 病程急性期和恢复期之间亦有显著性差异。水痘-带状疱疹病毒感染和IL -1等细胞因子诱导淋巴细胞、角质形成细胞等各种细胞表面ICAM -1表达和sICAM -1分泌增加。随着病情逐渐好转, sIC AM -1水平逐渐回落, 炎症反应逐渐减轻, 临床上动态观察血清sIC AM -1水平变化, 可帮助临床医生对患者病情的演变及预后作出更准确的判断。本实验结果提示sICAM -1参与了高原地区带状疱疹的发生和发展过程。
表1 高原地区带状疱疹患者血清sICA M -1检测结果组别正常对照组急性期HZ 恢复期HZ
例数404343
x s ( g/L)
187 68 48 23 325 37 61 31*
*
在某些
病毒感染时sICAM -1水平明显升高。为了解sICAM -1在高原地区带状疱疹前发病中的意义, 我们收集了四川省甘孜州地区(海拔2700~3700m ) 的带状疱疹患者43例进行血清sICAM -1浓度的测定, 现报道如下。1 材料与方法
1 1 材料 43例带状疱疹患者, 为驻高原部队病员, 男25例, 女18例, 年龄19~51岁, 平均31 8岁, 无系统性疾病, 近半年来未使用过皮质类固醇激素和免疫抑制剂。病程1~8d, 平均4 9d 。就诊时抽血检测作为急性期指标, 经治疗皮疹结痂后(平均治疗15d ) 再次抽血检测作为恢复期指标。对照组:医院献血员40人, 年龄、性别与患者组相匹配。
1 2 方法 静脉血3ml, 4h 内分离血清-40 冰箱贮存。sICAM -1测定采用双抗体夹心ELISA 法, 试剂盒为Endogen 公司产品。按说明书操作, 绘制标准曲线, 得样品中sICAM -1含量。
1 3 统计学方法 各组间均数采用不配对t 检验比较。2 结果
高原地区带状疱疹患者血清sICAM -1浓度检测结果(表1) 。结果表明急性期带状疱疹患者和恢复期带状疱疹患者血清sIC AM -1浓度均显著高于正常对照组(分别为t =7 82, P
高原地区主要气候特点是空气稀薄、气压低、低氧。低氧引起机体功能紊乱, 导致免疫抑制[2]。带状疱疹是高
收稿日期:2002-10-25; 修回日期:2002-11-26作者简介:张忠奎(1965-) , 男, 四川蒲江人, 副主任医师, 硕士, 201 49 53 23*
与对照组相比, *P
参考文献
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