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[文章编号] 1000-4718(2004) 08-1522-05
中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2004,20(8) :1522-1526
干细胞的应用
张敬军1, 刘焯霖2
3
(1泰山医学院附属医院神经内科, 山东泰安271000; 2中山大学第一附属医院神经内科, 广东广州510089)
Application of stem cells
ZHANGJing -jun , LI U Zhuo -lin
(1Department o f Neurology , Affiliated Hospital o f Taishan Medical College , , China ;
2
Department o f Neurology , Fir st Affiliated Hospital o f Sun -, 510089, China )
【A R eview 】cells. Stem cells have proliferating and multipotential cells play an im portant role in the repair tissue and organs.
分化 [KE Y WOR DS] S tem cells ; Differentiation [关键词]
[中图分类号] Q254 [文献标识码] A
近年来, 生物医学技术迅猛发展, 由于干细胞具有自我更新和分化的潜能, 在特定的微环境中可以横向分化, 因此干细胞的应用研究具有划时代的意义。干细胞应用和人类其它治疗疾病手段一样, 应符合安全和有效两大原则, 安全包括:致畸、致突、致癌三大安全评价试验。就算安全, 干细胞有效治疗也还有许多未解决的问题, 但由于其广阔的应用前景, 仍成为世界科学界研究的热点之一。应用干细胞治疗疾病较传统方法有很多优点, 如低毒性或无毒性, 长期有效; 应用自身干细胞移植, 避免产生免疫排斥反应等。1 骨髓干细胞应用
研究表明骨髓干细胞有3个干细胞群, 造血干细胞(hematopoietic stem cells ,HSC ) , 间质干细胞(mes 2enchymal stem cells ,MSCs ) 及内皮干细胞。HSC 移植后可以重建长期造血免疫功能, 目前已广泛用于白血病、再生障碍性贫血、肿瘤及艾滋病等治疗。MSCs 对造血干细胞不仅有空间位置的机械支持作用, 还分泌许多细胞因子及生长因子支持HSC , 有助于HSC 未分化状态的维持, 因此体外培养HSC 时, 用MSCs 作为饲养层可促进HSC 的增殖, 以获大量的HSC 。大剂量化疗血液病或肿瘤病人后需要进行骨
效。
在组织损伤修复中也具有很大的应用价值, MSCs 可以分化出多种组织类型:分化为软骨、骨组
织, 用于创伤缺损的修复[1]; 分化为神经, 用于中枢及周围神经损伤的修复或构建人工神经等; 分化为心肌组织, 用于替代缺血心肌或构建人工心脏[2]; 分化为真皮组织, 用于烧伤的修复; 分化为肌腱组织, 用于肌腱断裂缺损的修复或构建人工肌腱。但影响其分化的因素很多, 如基础培养基、细胞因子和生长因子、细胞密度、机械力、空间构成、生物材料、外源基因及体内所处微环境等都会影响MSCs 走向不同的分化途径。而且体内和体外是截然不同的环境, MSCs 在体内的分化很大程度受到所处微环境的影
响, 体外很难完全模拟体内的微环境, 所以MSCs 在体内和体外的分化有很大的差异, 因此实现对MSCs 的定向诱导分化, 用于组织的修复, 还需要不断地探索。
在受损的组织中, 新的毛细血管的形成是常见现象, 内皮干细胞能形成成熟的内皮细胞和血管, 对组织的修复具有重要作用。2 神经干细胞的应用
神经干细胞(neural stem cells ,NSC ) 治疗帕金森病。NSC 在神经发育和修复受损神经组织中发挥重要作用。NSC 移植是修复和代替受损脑组织的有效方法, 能重建部分环路和功能。利用NSC 作为基因治疗载体, 弥补了病毒载体的一些不足。Wagner 等[3]将NSC 移植到帕金森病模型的大鼠脑,NSC 在
髓移植重建造血功能时, 同时输入MSCs 会提高疗
[收稿日期]2002-12-13 [修回日期]2003-07-213[基金项目]山东省自然科学基金资助(N o. Y 2000C23) ; 山东省高等学校省级中青年学术骨干基金资助项目(369)
T el :0538-6222292
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其脑组织中迁移并修复损毁的脑组织, 且震颤症状明显减轻, 可能是NSC 分化为多巴胺能神经元起到治疗作用。Piccini 等[4]从流产胎儿脑中分离的神经组织细胞, 移植入患者的脑中治疗帕金森病, 结果有一半以上的患者症状得到了明显改善, 而且效果持续存在。
NSC 治疗多发性硬化。多发性硬化是发病率较
3 表皮干细胞的应用
表皮干细胞(epidermal stem cells ,ESC ) 不断增殖,
不断地补充表皮脱落细胞。表皮干细胞的存在是组织再生和创伤修复的基础, 修复皮肤创伤、烧伤和植皮手术, 这都归功于表皮干细胞, 表皮干细胞不断分裂增殖、分化、产生角朊细胞修复表皮, 同时自我更新维持干细胞存在, 干细胞的活力和分裂增殖状况直接影响创伤修复的进程。治疗皮肤创伤的一个关键是如何提高表皮干细胞的自我更新与增殖能力并抑制成纤维细胞的过度增殖[9]。这为我们进一步研。
:许多公, 其中最著名是Apigraf , 已经获得FDA 认证, 主要用于治疗久治难愈的慢性皮肤溃疡。大面积烧伤、外伤性皮肤缺损、广泛瘢痕切除以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤缺损, 仅靠创面自身难以实现皮肤的再生修复, 需要足够的皮肤替代物进行修复, 因此自体表皮干细胞体外培养及组织工程化皮肤无疑提供了一种全新的解决方案[10]。在体外培养的皮片及移植于创面后均保持有正常表皮的自我更新能力, 是因为保留了表皮干细胞自我更新与分化潜能。
转基因的理想靶细胞:表皮干细胞具有无限增殖和自我更新能力, 在其分裂增殖过程中不断将遗传信息传给子细胞, 能够在体外长期传代培养, 移入体内可形成表皮干细胞群, 形成完整表皮。G haz 2izadeh 等[11]用连接LacI 报告基因的逆转录病毒直接
高的神经系统疾病, 在其啮齿类动物模型中发现产生髓鞘的少突胶质细胞被破坏或失去功能, 将NSC 直接移植到大鼠脑中, 移植的细胞在脑中发生了大范围的迁移, 在分化成的少突胶质细胞中, 约40%的细胞形成了髓鞘, 其特性非常接近正常状态, 一些接受移植的动物其典型的症状也得到了明显的善[5]。
NSC 治疗脑瘤一, 手术切除肿瘤困难, , 放疗和化疗对肿瘤有一定的作用。由于NSC 具有迁移的功能, 利用这种特性可以向脑部释放药物。对大鼠NSC 进行转基因处理, 使之分泌白细胞介素-4, 这种物质能够激活免疫系统, 对肿瘤细胞发生抗瘤攻击, 患有脑胶质瘤的实验大鼠接受这种细胞注射之后, 寿命比未治疗的实验大鼠大大延长, 核磁共振成像表明, 实验大鼠脑部的大块肿瘤有缩小的迹象, 有趣的是, 既使注射的NSC 不分泌白细胞介素-4, 实验大鼠的寿命也会延长。Ling 等[6]认为这是由于NSC 还能分泌一种能够减缓肿瘤细胞分裂的未知物质的缘故。
NSC 治疗脑缺血。激活自身NSC , 并诱导其向缺
血区迁移分化; 异体NSC 脑内移植; 较为可行的策略是将转染神经营养因子的NSC 移植于缺血边缘区, 早期利用其分化的基因产物, 阻止宿主细胞的坏死和凋亡, 晚期要利用其迁移、分化特性来达到结构和功能修复的目的。
NSC 治疗脊髓损伤。Akiyama 等[7]报道将NSC
进行小鼠皮内注射, 在耐受beta -gal 酶的鼠中, 转录基因在表皮干细胞中显著表达, 并持续16周以上, 这提示表皮干细胞可成为转基因的理想靶细胞。对于皮肤遗传性疾病, 转基因的持续表达非常重要。单纯性大疱性表皮松解症(E BS ) 为基因异常性疾病, 目前在临床上尚无有效的治疗方式, 动物实验已显示E BS 转基因治疗的可行性[12]。通过表皮干细胞转基因研究, 不仅可以从分子水平上阐述表皮干细胞的分化调控机制, 同时为相关药物的开发及基因治疗奠定基础。
虽然表皮干细胞的研究获得了长足的进展, 但到目前为止, 还有许多问题没有解决。表皮干细胞许多分子标志物都不是非常特异、专一, 有的标志物在表皮细胞多个分化阶段表达, 只是在表达量上有区别。现用的分离纯化方法尚无法得到纯的表皮干细胞, 而且即使得到了较高纯度的表皮干细胞也无可用的表皮干细胞。随着生物医学技术的进一步发
移植入大鼠脱髓鞘的脊髓中, 发现这些细胞形成髓鞘, 并且这些形成髓鞘的轴突能以近似正常的速度传导冲动, 这表明有功能性的髓鞘形成。Han 等[8]报道将NSC 移植于脊髓损伤的大鼠模型中, 结果显示移植的NSC 在受损部位可存活1个月以上, 并且有迁移现象。Liu 等将基因修饰的NSC 植入大鼠未损伤的脊髓中, 结果显示移植的细胞大多数在脊髓内存活至少2个月, 并在脊髓内迁移较长距离, 可分化为神经元和胶质细胞。基因修饰的NSC 在移植后不仅可代替因损伤而死亡的神经元, 而且还可以分泌因此在脊髓损伤的修复中,NSC 具有广阔的前景。
神经营养因子促进神经元的存活以及轴突的再生。法保持其不分化而大量扩增, 这样就无法得到大量
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的卵圆细胞移植入肝脏纠正代谢机能障碍。对于非遗传性疾病的基因治疗, 获取自体卵圆细胞, 体外扩大的作用。
增, 导入治疗基因, 如I L -10治疗自身免疫性肝疾病4 成肌干细胞的应用
成肌干细胞包括成肌细胞和卫星细胞, 成肌细等。在乙型肝炎生物治疗中, 肝干细胞工程也将成胞移植后可与变性的骨骼肌融合, 减少骨骼肌的变为一个新兴的肝细胞移植研究领域。
角膜缘干细胞的应用性坏死, 促进肌细胞的再生, 改善部分骨骼肌肌力。6
角膜缘干细胞(corneal stem cells ,CSC ) 位于角膜卫星细胞不象胚胎干细胞那样, 来源受到伦理道德
的限制, 也不似成肌细胞, 应用免疫抑制剂从而带来缘上皮层基底部, 但此处基底细胞并非都是干细胞, 并发症和不稳定的疗效。采用自身卫星细胞移植可只有少量干细胞, 其余大部分是短暂扩充细胞。用以避免免疫反应的发生, 在肌病治疗上的应用将有角膜缘干细胞移植术治疗严重眼角膜疾病, 已取得
较好疗效。Pellegrini 等[21]广阔的前景。
成肌细胞移植治疗肌营养不良症获得了良好的2,2例均成功。结果[13]。Wernig 6, ,1个月后角膜
[22]
惊人的疗效, , 透明度增加, 视力明显改善。Rama 等对18例眼力基本恢复正常, 5周后绝大部化学烧伤患者进行了以纤维素为载体培养的自体角
膜缘干细胞移植治疗,1年后, 其中14例症状得以改
分肢体发生横纹肌肉瘤, 可能是由永久细胞系的低
善; 有3例患者进行了穿透性角膜缘干细胞移植, 视
分化性造成的。Irintchev 等[14]利用雄性小鼠的Y 染
力恢复显著。K oizumi 等[23]报道采用培养的异体角
色体作标记, 移植原代培养的雄性鼠成肌细胞治疗
膜缘干细胞移植治疗Stevens -Johns on 综合征也获显
液氮造成不同的肌细胞损伤雌性鼠模型, 发现疗效
著疗效。将眼角膜缘干细胞培养后形成的细胞层移
不如永久细胞系好, 而且损伤程度越重效果反而越
植到患者角膜表面, 取得了良好的疗效[24]。
好, 移植后的细胞大部分死亡, 可能与免疫排斥有
7 干细胞与人体生物组织工程
关。
组织工程技术是利用仿生学的原理, 以可降解
在肌肉受到损害后, 肌卫星细胞可发生反应并
的高分子聚合物为载体, 将有生物活性的干细胞与
分化, 变成成肌细胞并进一步分化为成熟肌细胞, 修
该载体结合在一起, 形成一个具有特定三维结构并[15]
复或替代受损区域的肌纤维。K parpati 等将卫星
且具有生物活性的复合体, 以达到维持人体组织、器
细胞移植mdx 小鼠的实验, 研究结果表明移植后小
官的形态和功能的目的。体外构建生物组织和器官
鼠肌细胞能表达原缺失的蛋白。Raw 等将卫星细胞
的最基本要素是生物材料和干细胞, 而干细胞是构
注入病肌来治疗某些遗传性肌病,Law 等将卫星细胞
建真正意义上的生物组织和器官的关键因素。干细
移植治疗肌营养不良症病人, 均取得一定的疗效, 证
胞具有多分化潜能和便于体外操作等特点, 是构建
实了卫星细胞移植的可性行。此外卫星细胞移植治人体生物组织最理想种子细胞。从目前人工生物组疗心肌梗死亦有可喜的进展[16]。织研究的进展来看, 干细胞的研究相对滞后, 只有解5 肝干细胞的应用决干细胞的来源, 体外诱导分化等技术问题后, 人体
肝干细胞(hepatic stem cells ,HSC ) 来源于前肠内生物组织工程才会有更大的发展。人体生物组织和胚层, 在胚胎发育过程中以成肝细胞的形式存在, 在器官研究已经成为世界生物高科技竞争的焦点, 人成年哺乳动物的肝中, 以小卵圆型的细胞存在, 因此工骨、血管、肌肉、神经、皮肤等已经开始进入临床试
[17]
又称为肝卵圆细胞。Y asui 等从大鼠肝脏分离的验, 耳朵、胰腺及手指也正在实验室中成形, 其中具卵圆细胞移植到大鼠肝脏中, 发现移植的卵圆细胞有生物活性的人工皮能够自己分泌胞外基质蛋白及在肝内分化为肝细胞并稳定分泌白蛋白。将卵圆细生长因子, 已经进入产业化发展阶段[25-27]。虽然利胞的悬液注到正常大鼠脾脏, 脾内肝细胞迅速生用组织工程技术获得了结构比较单一的器官, 但对长[18,19]。Dunn 等[20]将新鲜提取的卵圆细胞移植到于三维结构复杂, 涉及多种细胞类型的组织(如心、高尿酸血症狗模型肝中, 尿酸水平降低54%。对于肝、肾等) 还有许多工作要做, 只有在弄清干细胞分肝脏遗传性疾病, 如肝豆状核变性(Wils on πs 病) , 分化和组织器官形成的分子机制后, 才有可能实现。离出患者自体卵圆细胞, 进行体外扩增, 利用转基因8 其它技术将缺陷基因导入卵圆细胞, 筛选出转基因阳性衰老是人类生命发展的自然规律, 随着年龄的
展, 表皮干细胞无疑将对皮肤、创伤修复科学产生更
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增长, 干细胞的数量减少, 自我更新和分化的能力下降[28], 提示干细胞生理性衰老可能是人体衰老的重要原因之一。设法从干细胞的角度恢复或促进干细胞的活力可能是抗衰老的重要途经之一。干细胞对于判断药效及药物毒性等也有一定实用价值[29], 可利用干细胞培养技术观察某些天然化合物和合成化合物的细胞活性, 为发展小分子治疗药物提供理论基础。
9 干细胞应用中存在的问题
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目前干细胞的来源、分离、培养及鉴定还有许多工作要做, 干细胞诱导、分化及迁移机制有待进一步研究; 目前建立的干细胞系绝大多数来源于鼠[30], 而鼠与人之间存在着明显的种属差异、免疫反应、控制细胞的增殖, [31]; 在移植过程中, ; 利用胚胎干细胞存在着社会学及伦理学方面的问题等。但随着科学技术的发展, 上述存在的问题将逐步解决, 干细胞的应用将有广阔的前景。
[参 考 文 献]
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(上接第1506页)
正常成纤维细胞在体外培养时, 表现为有限生长, 传代次数积累到一定数目即表现为生长停滞现象, 并伴有其它特征性改变, 称为衰老。细胞增殖曲线和细胞周期则是反映细胞增殖能力的两个指标。在本实验中, 中等浓度D -gal 处理细胞, 细胞活力降低; 而高浓度的D -gal 与细胞作用72h 后细胞呈负增长, 说明D -gal 能使细胞增殖速度减慢, 但D -gal 浓度过高或作用时间过长, 会使细胞受到损伤, 引起细胞
用为我们建立细胞衰老模型, 并进一步研究细胞衰老的机理奠定基础。
[参 考 文 献]
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G 1比例增高, 但非二倍体比例也显著升高, 这种作用显然不
是由渗透压引起的, 对照组中相同浓度D -glu 处理细胞的结果已经排除了这种可能; 而细胞周期中非二倍体比例的升高提示我们, D -gal 对心脏成纤维细胞的作用可能不仅是诱导衰老, 更进一步是诱导细胞的凋亡, 这种凋亡是如何启动的, 有待于进一步研究。
S OD 能清除细胞中过多的氧自由基, 其活力高低可间接反映细胞清除氧自由基的能力;M DA 是自由基损伤不饱和脂肪酸生成的中间产物, 其含量能间接证明细胞内自由基的水平。与以往的实验结果相一致[5],D -gal 作用可使细胞内自由基含量升高, 推测抗氧化能力降低, 可能是D -gal 致心脏成纤维细胞老化的一个原因。
综合本文的研究结果,D -gal 对心脏成纤维细胞具有拟老化作用, D -gal 诱导心脏成纤维细胞拟老化的合适浓度是
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