高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理；
2. 掌握高效液相色谱仪的定性分析方法。
二. 实验原理：
被测样品与溶剂混合后在高压泵的作用下通过毛细管进入色谱柱，样品在色谱柱中作定向迁移运动并和工作物质发生互相作用，使多组份的样品逐渐分离为单个组份。
液相色谱法可以分离有机化合物，在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相中的分配系数K ：
K=（组分在固定相中的浓度）/（组分在流动相中的浓度）
K 值越大，组分在固定相上的停留时间越长：溶质流经色谱柱时，K 值越大停留的时间也越长，K 值越小，停留的时间也越短，由于组分在固定相的K 不同，就会出现差速迁移，从而达到分离的目的。
一般情况下，当外界条件及方法确定，溶质流经色谱柱时，不同分配系数的物质流出色谱柱的时间不一致，在检测器上得到响应，表现为出峰时间不一致，同一组分（K 值固定），保留时间一致，根据这个特性，可以分离不同的有机化合物。
三．仪器和试剂：
1．岛津 高效液相色谱仪LC-10A
2．色谱柱：C18
3．超声波发生器 (用于过滤或排气)
4．注射器：50微升
5．容量瓶：100ml 若干
6．移液管：2ml 、4ml 、8ml
7．流动相：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40，制备前，先调节水(用酸或缓冲盐) 的PH=3.5，进入系统色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。
四．实验步骤：
1．标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂，用纯水或去离子水溶解，定容到100毫升，浓度为1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml 稀释为10 ml ，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。
2．打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的工作站。
设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（40度左右），停止时间为4min ，流动相比例（甲醇：水=60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min ，记录仪上基线稳定后，开始进样。
3．进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上），注入进样阀中。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站开始记录并出图11。
5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次，获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。
6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
六．数据分析
根据标准样品色谱图中的保留时间，找到并标出饮料色谱图中的苯甲酸的色谱峰位置。
注意事项：
1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需过滤后使用。
2、 开机时自上而下打开各组件电源。关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工
作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；
3、 操作过程若发现压力很小，则可能管件连接有漏，注意检查。
4、 操作过程若发现压力非常高，则可能管路已堵，应先卸下色谱柱，然后用分
段排除法检查，确定何处堵塞后解决。
5、 自动进样器进样针未与样品瓶瓶口对准时，需重新定位。