上海农业学报 2004, 20(2) :20～23
Acta Agriculturae Shanghai
文章编号:100023924(2004) 02220204高通量筛选蛋白质突变体库方法的研究进展3
黄国庆1,2) 姚泉洪2) 32) 3(1) 浙江大学生命科学学院, 杭州310012; 上海市农业遗传育种重点实验室, 上海市农业科学院生物技术研究中心, 上海201106)
摘 要 定向进化已经被广泛用于修饰和加强蛋白质性能的研究。蛋白质突变体库筛选方法的改变和完
善进一步加强了定向进化技术在理解和设计新蛋白质实验中的运用。近年来报道了许多新的高通量筛选方法,
这些方法已经越来越多地用于蛋白质工程的研究, 并且解决了此领域中一些具有争论性的前沿问题。
关键词 定向进化; 突变体库; 高通量筛选; 流式细胞术
中图分类号:S188; Q785 文献标识码:A
随着蛋白质构象预测、结构分析和定点突变方法研究的不断深入, 加速了人们对蛋白质结构和功能之间相互关系的理解[1]。然而, 除了少数成功的实例外, 非常困难。因此, 在工业和医药方面, 得到广泛的关注。在农业生物技术研究领域, , 主要包括:良、饲用氨基酸、4, 包括高丰度蛋白质突变体库的, 使得表达特定功能的克隆优先繁殖, 。、抗体、, 如化学诱变和易错PCR [5]。此外, 近年来发展的DNA 改组(DNA shu ffling ) [6]、过渡模板随机嵌合(random chimeragenesis on transient tem plates , RACHITT ) [7]、酵母重组增强组合文库(combinatorial libraries enhanced by recombination in yeast ,C LERY ) [8]以及相关技术都具有重组特性且伴随点突变的发生、积累有益突变、去除有害突变和中性突变等优点。在以上方法基础上, 构建蛋白质突变体库越来越容易并快速成为常规实验技术。因此, 从蛋白质突变体库中高效筛选有益突变体的方法是决定蛋白质非理性设计实验成功的关键, 目前, 常规筛选大容量蛋白质突变体库技术的发展仍然不能满足蛋白质工程领域面临的挑战。令人兴奋的是, 许多高通量筛选方法正在不断涌现, 本文就目前蛋白质库筛选方法的现状和研究进展作一综述。
1. 常规筛选蛋白质突变体库的方法
当筛选的蛋白质可以产生可见信号时, 则简单的表型观察选择和筛选被广泛应用。目前, 蛋白质突变体库筛选一般是在固态(琼脂糖和滤膜) 或者液态(微量滴定孔板) 条件下通过表型选择和筛选而完成的。
1. 1 表型观察选择和筛选(Phenotype Visual Selection or Screens)
表型选择[9,10], 即是基于细胞生长率和生存率的筛选方法。对于前者而言, 主要是依据营养缺陷型互补和对细胞毒素的抗性来筛选突变体, 如增加抗生素的浓度进行平板筛选。但是, 对催化专一反应的蛋白质和催化专一底物的蛋白质设计表型选择是困难甚至不可能的, 其另一个局限是在筛选压下微生物基因组的进化非常快并且发生了显著变化, 选择压的应用通常会导致选择的突变子和预期得到的突变子催化活性各不相同; 对于后者而言, 则又是基于蛋白质突变体库中酶的催化活性的筛选方法, 主要依据强发色体底物(颜色变化) 、易观察的克隆表现(溶解圈) 或荧光产物来筛选突变体。
如绿色荧光蛋白突变体非常
收稿日期:2003-07-17初稿; 2004-04-12二改稿。
3上海市局管项目资助(编号:94JG 03-04) 。
33通讯联系人。T el :021-62208660-3207, Fax :021-62209988, E 2mail :Y aoquanhong @yahoo. com
作者简介:黄国庆, 男, 1974年9月出生, 硕士, E 2mail :hgq1015@yahoo. com. cn
容易通过荧光产物鉴定[11]。绿色荧光蛋白质突变体库通过易错PCR 和DNA shuffling 产生, 在大肠杆菌中表达, 根据它发出的固有荧光在紫外线下观察, 进行可见筛选。分泌活性蛋白酶的转化菌落涂布在琼脂糖平板上可以产生溶解圈, 溶解圈的大小和酶水解活性成正比。利用这种筛选方法, Y ou 和Arnold (1996) [12]通过连续几轮随机突变和筛选提高了枯草杆菌蛋白酶E 的表达水平和在有机溶剂中的活性。除了直接测定酶产物, 还可以结合另外一个酶, 通过这个酶反过来监控需要测定的酶。如已经阐明的加氧酶2辣根过氧化物酶结合反应系统非常适于筛选单加氧酶库[13], 通过突变和筛选能够得到所需性状的突变体, 包括提高酶的活性、稳定性以及改变反应的专一性。
表型观察筛选法的优点是筛选速度快, 缺点是具有很大的局限性, 如不能定量、对蛋白质特性中的微小的变化不灵敏, 因此不能被广泛使用。21世纪初, 数字影像分光光度计(Digital Imaging S pectroscopy ) 的发展大大提高了在滤膜、琼脂糖平板上的筛选通量并且可以定量突变体产生的信号, 提高筛选的灵敏性[13]。利用先进的数字影像系统筛选的通量可以达到105克隆/d 。
1. 2 96孔板筛选(Screen in 962w ell P late Form at)
许多酶活力测定不能在固态条件下完成, 这些酶的单个克隆必须在微量滴定板孔中生长和测活。液态酶活测定比固态酶活测定更消耗时间。96孔板微量滴定法(962well microtitre plate ) [10]是液态酶活测定最常用的一种方法, 它是当前和机器手臂(robotic arms ) 、液体处理系统(liquid handling systems ) 、读板仪(plate readers ) 最兼容的酶活测定方法, 是最普遍的适于自动化、高通量的筛选方法, 筛选的结果非常可靠。该方法的优点是测活的体积可以减少, 还可以从背景中区分低溶度的、弱活性的酶表达克隆。多孔板结合分光光度计测活的高通量筛选是目前最常用的筛选方法之一。1536和3456, 多波长检测仪的出现、每秒钟分配几千滴样品(pL 级) 品处理速度, 从而增加了筛选的通量, 节约了筛选的时间2. , 特别在抗体的研究当中应用非常普遍, 具有高效、2. 1 (]自Smith 博士1985年建立至今, 已发展成为生物学后基因组时代一个强有力的实验技术, 在生物学的许多领域得到广泛应用。人们利用这一技术可以将各种自然界或人工合成的DNA 整合到丝状噬菌体基因中, 以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面, 利用噬菌体展示库所固有的基因型和表现型之间的直接关联, 可以方便检测。如抗原抗体反应, 生物素结合反应等, 根据反应的性质进行分离, 从中筛选出人们所需的突变蛋白质。噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。
亲和作用是噬菌体展示技术筛选的主要原理[14], 蛋白质展示在丝状噬菌体的表面, 建立了目的基因和它表达的蛋白质之间的物理连接, 该方法最明显的优点是展示的蛋白质能够到达噬菌体的表面环境, 与位于表面的底物或其它的目标分子作用。将筛选的靶蛋白偶联到固相支持物(磁株或酶联板) 上, 加入噬菌体, 作用一段时间后, 去掉与靶蛋白不结合的噬菌体, 将有特异结合活性的噬菌体侵染细菌, 几轮筛选后就富集到了与靶细胞高亲和力的噬菌体克隆。
2. 2 核糖体和mRNA 展示技术(Ribosome Display and mRNA Display)
核糖体和mRNA 展示技术[15,16], 是通过筛选靶蛋白2核糖体2mRNA 三元复合物或靶蛋白-mRNA 二元复合物, 将基因型与表型直接偶联起来, 并利用mRNA 的可复制性, 使靶基因(蛋白) 得到有效富集的一项技术。利用此方法进行单链抗体可变区scFv 片段表达文库的筛选, 得到了亲和力提高40倍的变异体。与噬菌体展示技术相比较, 核糖体和mRNA 展示技术不需要将DNA 库转化到微生物中[16], 因此, 库容量的大小不受转化效率的限制, 库容量可达到1012～1013, 而噬菌体展示技术构建的噬菌体库容量一般只能达到109。总而言之, 核糖体和mRNA 展示技术库容量比噬菌体库要复杂104倍, 比酵母展示和酵母双杂交及三杂交系统要复杂106倍, 比表型观察筛选方法要复杂109倍。核糖体和mRNA 展示技术还有一个优点, 就是mRNA 链和其所编码的蛋白质是共价连接的, 使得在极端条件下筛选目的蛋白质成为可能。另外,mRNA 展示技术具有可以自身装配成蛋白质芯片的特性。Schaffitzel 等[15]提出标准的DNA 芯片通过mRNA 展示技术中的mRNA 2蛋白质融合体杂交能转变成蛋白质芯片,cDNA 2蛋白质融合体杂交本身可以直接装配成蛋白质芯片。
核糖体和mRNA 展示技术克服了噬菌体展示技术和酵母双杂交系统的许多缺点, 减少了表达偏好, 同
时, 因为不需要转化步骤, 一般能产生大于1012个分子库容量的蛋白质库。另外, 由于mRNA 链和其所编码的蛋白质共价连接, 可以在严峻的选择条件下筛选突变体, 去除更多的对照, 准确地筛选出有意义的突变体。
2. 3 细菌细胞表面展示技术(B acterial Cell Surface Display)
细菌细胞表面展示技术, 结合荧光激活细胞筛选仪(Fluorescence Activated Cell S orting ,FACS ) 或流式细胞筛选仪(flow cytometry ) 是非常有效的高通量筛选方法[17～19]。
此方法能够决定突变体库中每个克隆的功能特性。因为, 细菌表面有许多单一性状能显示保留在细胞表面的酶反应产物, 因而展示在细菌表面的蛋白很容易通过荧光探针显示出来, 荧光产物和细胞表面酶反应产物之间的物理连接是筛选蛋白质库的一个非常有价值的特性, 同时也是定量检测单细胞酶催化活力的关键。这种技术是当前惟一能够定量检测单细胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。现在比较成熟的是利用革兰式阴性细菌表面带有的高负电荷结合荧光共振能量转换(flourescence res onance energy trans fer ,FRET ) 底物的多阳离子尾巴, 使底物吸收在大肠杆菌的表面。展示在大肠杆菌表面的酶剪切底物的淬灭基团从而产生一个荧光产物, 通过多阳离子尾巴重新保留在大肠杆菌表面(图) 。荧光的量和底物的转换数成正比关系。由于在基因和它编码的蛋白质以及目的功能之间建立了一个直接连接, 大容量蛋白质突变体库的筛选被大大简化。基于这些特性, 蛋白质展示技术结合FRET/FACS 筛选成为目前惟一具有在K cat 和K m 的基础上区分酶活性能力的筛选方法。流式细胞仪结合细胞表面展示技术具有以下几个明显的优点:能够定量分析酶活性、同时测定多个参数并且对每个观察到的克隆进行记录
。
图 革兰氏阴性细菌表面展示技术结合荧光共振能量转换仪或荧光激活细胞筛选仪筛选方法
Fig. G ram 2negative b acterial surface display coupled with FRET/FACS screening
2. 4 酵母表面展示技术
目前已报道的酵母表面展示系统有两种[20,21], 即目的蛋白分别与a 或α凝集素融合从而展示于酵母细胞表面。通常被选的展示系统应该满足以下几个条件:首先, 表达偏差应该是最小的, 以便DNA 库的多样性可代表正确折叠蛋白质的多样性; 其次, 要有定量筛选的标准; 最后, 被选系统必须能很好的区分仅有微弱亲和力差别的突变体。酿酒酵母的蛋白质折叠和分泌机制与哺乳动物细胞非常相似, 因而比原核细胞更能正确表达和展示人的蛋白质。与噬菌体不同, 酵母是个足够大的颗粒, 可用流式细胞仪进行筛选和分离, 这就使得基于特异定量亲和力改变的突变体分离成为可能。由于酵母展示的蛋白质是紧密锚定在细胞壁上, 可以耐受S DS 等的抽提, 同时酵母有发酵特性且生长快, 因此在工业上具有很好的应用前景。
总之, 近几年基于酶催化活性筛选多样性蛋白质突变体库的高通量筛选方法已经得到迅速发展。噬菌体展示技术具有筛选大容量突变体库的潜力, 但是它不能定量检测酶催化活性的微量差异。在应用过程中, 细胞表面展示技术结合流式细胞仪在筛选的高通量和测定单细胞水平的酶动力学之间达成很好平衡, 甚至在高密度的固体形态或微量滴定量孔板测活, 也能准确定量酶的活力。但是目前每天分析量超过105克隆仍是一个挑战。毫无疑问, 这些高通量的筛选技术, 无论是单个技术本身还是多个技术的融合, 将
会越来越广泛的被应用于新性能蛋白质的分离。
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Huang G uoqing 1,2 Y ao Quanhong 2
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Research Center o f Shanghai Academy o f Agricultural Sciences , Shanghai 201106)
Abstract Directed ev olution has been widely used in the studying of m odifying or enhancing protein perfor 2mance. And the im provement of screening protein mutant libraries has further made it increase to apply directed ev olu 2tion to experiments of understanding and designing new proteins. In recent years , a lot of new high 2throughput screen 2ing methods have emerged and are increasingly being used to explore challenging issues in protein engineering.
K ey w ords Directed ev olution ; Protein mutant libraries ; High 2throughput screening ; Flow cytometer