《微 生 物 技 术 大 实 验》
实验指导
（适用专业：11级本科生物技术 微生物学方向）
柯 野 编
韶关学院 英东生命科学学院
2014年
实验一、重组毕赤酵母发酵表达蛋白酶及其初步鉴定
一、实验目的
1、学习重组毕赤酵母培养基产物表达的方法。
2、学习发酵过程中菌体浓度的测定。
3、学习表达的重组蛋白酶的鉴定及其酶活的测定。
二、实验内容
1、毕赤酵母的菌体生长和诱导表达的培养基的制备。
2、重组毕赤酵母生长菌体曲线的测定。
3、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达。
4、对重组毕赤酵母工程菌株的诱导表达发酵液的酶活测定。
5、SDS-PAGE 鉴定重组蛋白酶。
三、实验原理
蛋白酶是催化蛋白质化合物中肽键水解为小肽或氨基酸的一类酶总称，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实及微生物中，并且对生物体的生理调控、催化各种代谢反应等方面具有重要的作用。蛋白酶是一类重要的工业用酶，约占整个工业用酶量60%以上；广泛应用于食品加工、皮革、医药和化工等行业。由于蛋白酶具有广泛的工业、食品和医药等方面的应用价值，目前工业上需求量大。植物中提取的蛋白酶主要是中性蛋白酶。植物蛋白酶生产依赖于植物种植，这易受到季节、地理、气候等多因素的影响致使来源不稳定。动物源性蛋白酶多从牛、羊和猪等的胰脏中提取而得。动物来源蛋白酶生产成本较高，并受到世界动物保护协会和人员的强烈反对，目前主要用于医药方面。因此，动植物源蛋白酶不能满足当代工业的需要。微生物源蛋白酶几乎具有所有植物和动物来源蛋白酶的应用特性，成为了目前的蛋白酶的重要来源。据统计，微生物蛋白酶占据了世界蛋白酶销售大约 70%以上的份额。
目前商业化的蛋白酶主要来源于芽孢杆菌，中性蛋白酶来自植物木瓜，而来源于真菌的极少。目前，国内外学者对来源于霉菌的蛋白酶的研究主要集中于通过优化固体(或者液体) 发酵来提高蛋白酶的产量或通过分离纯化其产生的部分酶进行性质研究；而优化发酵条件很难大幅度提高蛋白酶产量，且发酵过程易受多种因素(如易污染或菌株生长状态) 影响。并且霉菌产生的蛋白酶种类较多，这增加了蛋白酶的纯化难度，阻碍了其进一步的开发利用。因此采用基因工程技术，利用霉菌的蛋白酶基因整合到毕赤酵母
的基因组上构建工程菌株，利于高产获得重组霉菌蛋白酶。
毕赤酵母表达系统是目前表达异源蛋白性能较好的系统之一，其操作工艺简单，表达量高。该表达系统能对表达的蛋白进行折叠和翻译后修饰，获得具有活性的目的蛋白，该目的蛋白能直接分泌至发酵液中便于分离与纯化。毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP ），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX-甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX 。AOX 的合成是在转录水平调控的。其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
四、器材与试剂
1、菌种
重组蛋白酶毕赤酵母工程菌株，本菌株由本实验室自己构建保藏。
2、培养基
BMGY 培养基：酵母提取物10.0 g，胰蛋白胨20.0g ，YNB 13.4g，500×生物素溶液（4×10-5%生物素）2.0 mL，甘油 10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL 。
BMMY 培养基：酵母提取物10.0 g ，胰蛋白胨20.0g ，YNB 13.4g ，500×生物素溶液（4×10-5%生物素）2.0 mL，甲醇 10.0 mL，1M 磷酸钾(pH6.0) 100.0 mL，蒸馏水900mL 。
3、试剂
福林试剂(Folin试剂) ：于2000mL 磨口回流装置内, 加入钨酸钠(Na2WO4•2H2O) 100g ，钼酸钠(Na2MoO4•2H2O) 25g，蒸馏水700mL ，85%磷酸50mL ，浓盐酸100mL ，文火回流10h 。取去冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4) 50g，蒸馏水50mL ，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸15min ，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000mL ，用细菌漏斗(No4-5)过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。
0.4mol 碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠(Na2CO 3) 42.4g，定容至1000mL 。
0.4mol 三氯乙酸(TCA)溶液：称取三氯乙酸(CCL3COOH) 65.4g，定容至1000mL 。 pH7.2磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钠(NaH2PO 4•2H2O) 31.2g，定容至1000mL ，即成0.2mol 溶液(A液) 。称取磷酸氢二钠(Na2HPO 4•12H2O) 71.63g，定容至1000mL ，即成
0.2mol 溶液(B液) 。取A 液28mL 和B 液72mL ，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g ，称准至0.002g ，加入0.1N 氢氧化钠10mL ，在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸) ，然后用pH 7.2磷酸盐缓冲液定容至100 mL 即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。 100μg/mL酪氨酸溶液：精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g ，逐步加入6mL 1N 盐酸使溶解，用0.2N 盐酸定容至100mL ，其浓度为1000μg/mL，再吸取此液10mL ，以0.2N 盐酸定容至100mL ，即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存, 以免繁殖细菌而变质。
电极缓冲液（pH 8.3）：0.025mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris ）， 0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS ）：称3.02 gTris、14.42 g甘氨酸，1g SDS，用蒸馏水定容至1000ml 。
分离胶缓冲液（pH8.8）：1.5 mol/L Tris-HCl 称18.171 gTris，80 ml蒸馏水溶解，用浓HCl 调pH 8.8，蒸馏水定容至100ml 。
浓缩胶缓冲液（pH6.8）：0.5 mol/L Tris-HCl 称6.075 gTris ，80ml 蒸馏水溶解，用浓HCl 调pH 6.8，蒸馏水定容至100ml 。
凝胶：30%丙稀酰胺（Acr ）、1.6%甲叉双丙稀酰胺（Bis ） 称30 gAcr 、0.8 g Bis ，加少许蒸馏水热溶, 用蒸馏水定容至100 ml。
染色液：称2.5 g 考马斯亮兰R-250，加500 ml 甲醇，100 ml 醋酸, 用蒸馏水定容至1000 ml。
脱色液：取250 ml甲醇，70 ml醋酸，用蒸馏水定容至1000ml
样品缓冲液：取10% SDS 1ml，二巯基乙醇（13.5mol/L）0.6 ml，甘油1.5ml ，0.05%溴酚兰少许，0.5mol Tris-HCl(pH6.8)定容至10 ml。
样品处理：将血清用样品缓冲液稀释至蛋白含量为1mg/ml，煮沸5min 。
10% SDS：称10.0 g SDS，用蒸馏水定容至100 ml。
4、器材
分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、恒温摇床、pH 计、离心机、电子天平、电泳槽等。
五、实验操作
（一）配制BMGY 和BMMY 培养基
1 称量：按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。
2溶解：向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。
3. 调节pH 值：用玻璃棒沾少许液体，测量pH 值。用氢氧化钠和盐酸调节PH ，本实验采用的是缓冲液配制培养基，也需要培养基的最终pH 。
4. 分装及包扎：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。
6. 灭菌：高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20分钟。 （高压蒸汽灭菌器使用方法：加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。通电加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气。 待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排出时），关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(一般是101.53kPa ，即15磅/英寸2，温度为121.3℃) ，开始计时，维持15-30min 。灭菌时间到达后，停止加热，待压力降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。切不可在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。）
7. 灭菌后验证灭菌是否彻底：将培养基放置于37℃培养箱中，培养48 h，检测是否有菌生长。
（二）重组毕赤酵母生长曲线测定
1、种子液制备
取重组毕赤酵母工程菌株斜面菌株1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入BMGY 培养液中，250rpm ，30℃振荡培养24 h。
2、接种培养
用5ml 无菌吸管，准确地吸取5ml 重组毕赤酵母工程菌株的培养液，接种到灭菌装有50ml BMGY培养液的250ml 的三角瓶中，接种后振荡，使菌体混匀。
3、培养
将接种后三角瓶放置于摇床上，250rpm ，30振荡培养。分别在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30小时从三角瓶中取出一定体积的菌悬液，立即放4℃冰箱中贮存，最后一起比浊测定光密度值。
4、比浊测定
以未接种的BMGY 培养液作空白对照，选用600 nm波长进行光电比浊测定。从最稀浓度的菌悬液开始依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的BMGY 培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1-0.65以内，记录OD 值时，注意乘上所稀释的倍数。
（三）重组毕赤酵母的诱导表达
1、取出冰箱中保存的重组毕赤酵母工程菌株，接种于含25mL BMGY 培养基的
250mL 摇瓶中，28-30℃振荡培养（250～300rpm ）至对数生长期OD 600达 2-6，约 16-18h ）。
2、室温下以 3000 g 离心 5min 回收酵母细胞。弃去上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY 培养基中，至 OD 600值为 1.0-2.0（约 100-200mL ）。
3、将培养液置于 1L 摇瓶中，覆盖两层无菌纱布和一层灭过菌的报纸，置摇床中，28～30℃继续培养并开始诱导表达（注意诱导温度应严格控制，不要超过 30℃）。
4、诱导表达起始后，每隔 12h 补加 100%甲醇至终浓度为 0.5%～2%以维持诱导。
5、诱导开始后，每隔 24h 取样一次，直至 168h 。每次取诱导培养液 1mL 于 1.5mL 离心管中，室温下以最大转速离心 2-3min ，将上清液和细胞沉淀分别冻存于-20℃。
（四）发酵液酶活的测定
1、 标准曲线的绘制
1.1、按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表1) 。
表 1 配制各种不同浓度的酪氨酸溶液
管 号
试 剂
1
蒸馏水，mL
100μg/mL酪氨酸，mL
酪氨酸最终浓度，μg/ml
1.2、 测定步骤
取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL ，各加入0.4 mol碳酸钠5 mL，再各加入已稀释的福林试剂1mL 。摇匀置于水浴锅中。40℃保温发色20min 在721型分光光度计进行测定(波长660nm) 。一般测三次，取平均值。将1-6号管所测得的光密度(OD)减去1号管(蒸馏水空白试验) 所测得的光密度为净OD 数。以净OD 值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线(或可求出每度OD 所相当的酪氨酸量K) 。
2、发酵液的稀释液
取一定量的发酵液，加入pH7.2磷酸盐缓冲液稀释为2倍、4倍、8倍和10倍的稀释液。
3、样品测定
取15×100mm 试管3支，编号1、2、3(做2只也可) ，每管内加入样品稀释液1mL ，置于40℃水浴中预热2 min，再各加入经同样预热的酪蛋白1mL ，精确保温10min ，时间到后，立即再各加入0.4mol 三氯乙酸2 mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20min ，10 0 0 2 8 2 20 3 6 4 40 4 4 6 60 5 2 8 80 6 0 10 100
使残余蛋白质沉淀后离心1000rpm 、10 min，然后另取15×150mm 试管3支，编号1、2、3，每管内加入滤液1mL ，再加0.4mol 碳酸钠5mL ，已稀释的福林试剂1mL ，摇匀，40℃保温发色20min 后进行光密度(OD)测定。
空白试验也取试管3支，编号(1)、(2)、(3)，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol 三氯乙酸2mL ，使酶失活，再加入酪蛋白。
样品的平均光密度(OD)-空白的平均光密度(OD)=净OD 值。
4、计算
在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。
发酵液的蛋白酶活力单位=
式中： A-由样品测得OD 值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD 值×K) ；4-4毫升反应液取出1 mL测定 (即4倍) ；N-酶液稀释的倍数；10-反应10min 。
（五）SDS-PAGE 鉴定重组蛋白酶
1、安装垂直平板电泳槽。
2、灌制分离胶
在100ml 烧杯中依次加入重蒸水3.35ml ，1.5mol/LT ris-HCl (pH8.8)缓冲液2.5ml ，10%SDS 0.1 ml，凝胶贮备液4.0 ml， 10%过硫酸铵50μl和TEMED 5μl，由于加入TEMED 后凝胶就开始聚合，所以应立即混匀混合液，然后用滴管吸取分离胶，在电泳槽的两玻璃之间灌注，留出梳齿的齿高加1cm 的空间以便灌注浓缩胶。用滴管小心地在溶液上覆盖一层异丙醇，将电泳槽垂直静置于室温下约30min ，待分离胶聚合完全后，除去覆盖的异丙醇，尽可能去干净。
3、制备浓缩胶
一般采用5%的浓缩胶，配制方法：重蒸水3.4 ml，0.5mol/l Tris-HCl缓冲液（pH6.8）0.63 ml、10% SDS 50ul、凝胶贮备液（Acr/Bis）0.83 ml，10 %过硫酸铵50μl、TEM ED 5μl，在100ml 烧杯中混匀，灌注在分离胶上。小心插入梳齿，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置于室温下至浓缩胶完全聚合[9]。
4、样品的制备
标准蛋白样品的制备：取出一管预先分装好的20 μl低相对分子质量标准蛋白质，放入沸水浴中加热5min ，取出冷至室温，高速离心1min 。
待测样品的制备：取发酵液1000 μl于1.5 ml离心管中，加入600 μl无水乙醇, 然后放进冰箱冰浴25 min，取出来10000 rpm离心5 min，弃上清，重新加入300 μl菌液及600 μl无水乙醇，放进冰箱冰浴25 min，取出来10000 rpm离心5 min，弃上清，加入已配置好的溴酚蓝, 搅拌均匀，沸水浴中加热5 min，取出冷至室温，高速离心1 min。
5、电泳
待浓缩胶完全聚合后，小心拔出梳齿，用电极缓冲液洗涤加样孔（梳孔）数次，然后将电泳槽注满电极缓冲液，去除电泳槽内的所有气泡。用微量注射器按号向凝胶梳孔内加样。接上电泳仪，打开电泳仪电源开关，调节电流至20-30mA 并保持电流强度恒定。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1 cm时，停止电泳。
6、染色与脱色
小心将胶取出，置于一大培养皿中，加染色液染色1h ，倾出染色液，加入脱色液，数小时更换一次脱色掖，直至背景清晰。
7、照相
六、作业与思考题
1、配制的培养基有无污染，应该怎样处理污染的培养基？
2、绘制出重组毕赤酵母工程菌株的生长曲线图。
3、发酵液的酶活是多少？
4、影响SDS-PAGE 电泳实验的误差可能原因是什么? 根据你的实验进行分析。
5、写出完整的实验报告。
实验二、蛋白酶产生菌的筛选、培养、鉴定和选育
一、实验目的
1、学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法。
2、掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法。
3、学习并掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法。
4、理解培养条件对微生物培养的影响。
5、学习对自然界筛选的未知细菌菌株进行分类鉴定的方法。
6、了解掌握常用的细菌总DNA 制备方法的原理和适用范围，学习细菌总DNA 的操作技术。
7、学习和掌握微生物DNA 分子鉴定的方法与技术，熟悉PCR 技术在微生物分类学中的应用。
8、学习并掌握微生物诱变育种技术的基本思路和方法。
二、实验内容
1、培养基的配制、分装与灭菌。
2、产蛋白酶细菌的分离与纯化。
3、产蛋白酶细菌的培养发酵与条件优化。
4、产蛋白酶细菌的形态和分子鉴定。
5、产蛋白酶细菌的紫外诱变选育。
三、实验原理
（一）蛋白酶的概况
酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应条件温和、安全、无毒、环境污染少，人们很早就开始从动物脏器和植物体提取胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等酶，用于科学研究和生产实践。而不同类型的微生物由于自身生长的需要，产生并向胞外分泌能水解大分子蛋白和淀粉的酶类，使不能透过微生物细胞的大分子物质经酶解后形成小分子糖、小肽和氨基酸可为微生物提供碳素和氮素营养。由于微生物体积小，生长速度快，易于大规模生产，从微生物中制取酶已成为发酵工业中的一个新兴领域。目前能由工业生产的50多种酶制剂，大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌产生的。酶制剂中的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶，葡萄糖异构酶在食
品、洗涤剂、皮革、纺织、造纸、诊断、药用等领域具有广泛的应用价值。
蛋白酶是生物酶制剂的一种，在轻工、食品和医药工业等方面用途非常广泛。自从1945年，瑞士人Dr Jaag等人发现地衣芽孢杆菌能产生碱性蛋白酶，从此开启了人们利用微生物生产蛋白酶的历史。微生物来源的蛋白酶多数为胞外酶，与动植物来源的蛋白酶相比具有产酶量高，适合大规模工业生产的优点。微生物蛋白酶在整个酶制剂产业中一直都占有很大的份额，被认为是最重要的应用型酶类。因此，微生物产生蛋白酶菌株的筛选、鉴定、选育和发酵优化一直为人们所关注。
（二）、产蛋白酶细菌的筛选
微生物产生蛋白酶，在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显地蛋白水解圈；因此，可以根据产生水解圈的情况来鉴定菌株是否产生蛋白酶，进一步作为筛选产生蛋白酶的重要依据。
（三）培养发酵与条件优化
如何确定产蛋白酶菌株产生蛋白酶产生最佳发酵培养基和其它最适发酵条件，是发酵产生蛋白酶的首要问题。在微生物发酵工程研究和实践中，一般采用单因子实验和正交试验相结合的方法，对微生物发酵条件进行选择和优化。
单因子实验：
微生物发酵单因子实验，是在其它因子和水平固定不变的情况下，对某种因子和水平进行选择和优化。利用单因子实验虽然也能确定微生物发酵的基础培养基配方和基本发酵条件，但不能确定最佳培养基配方和最适发酵条件。因为其实验结果不能充分反映出各种因子和水平处于变化状态时对微生物发酵的影响，也不能反映出两种因子对微生物发酵是否有协同作用，即因子间的交互作用。
在利用单因子实验所获得的对微生物发酵有重要影响的许多因子和水平等信息的基础上，采用更科学的正交试验法，才能确定微生物发酵最佳培养基配方和最适发酵条件。
正交试验：
正交实验设计的基础是拉丁方理论与群论。统计学家将正交设计通过“均匀分散、整齐可比”的正交表，而进行多因子、多水平实验。经少量实验结果的统计分析和方差分析，即可选择出最佳的因子和水平。所以正交试验是目前选择、优化微生物发酵条件最常用的多快好省的实验方法。
1．举例说明多因子、多水平正交试验的过程与实验结果统计分析、方差分析方法
某种抗生素发酵培养基由黄豆饼粉、蛋白胨、葡萄糖、碳源1号、KH 2PO 4、CaCO 3、无机盐1号等七种营养因子组成。现打算用正交试验法对其中的黄豆饼粉、蛋白胨、葡萄糖、碳源1号和KH 2PO 4五种营养物质的最适配比以及摇瓶最适装液量进行选择、优化，如何利用正交表设计实验？如何对实验结果进行方差分析？这是正交试验的关键所在。
把黄豆饼粉+蛋白胨、葡萄糖、碳源1号、KH 2PO 4、摇迸发酵装液量，看作是五个因子，每个因子取三个水平，即构成五因子三水平正交试验，同时考察黄豆饼粉+蛋白胨分别与葡萄糖、KH 2PO 4、碳源1号间的交互作用。该正交试验可选用L 27(3)13正交表，该正交表共13列，可进行27组实验。各因子及考察因子间交互作用在正交表中所占列数见表头设计。
按表头设计所作27组实验的试验结果见表2。
Yi 表示试验结果，指抗生素产量百分比，按对照为100计。
注释：Ij 、IIj 、IIIj 分别为27组实验中每一因素的1水平，2水平，3水平时试验结果总和。Sj 为每因子的偏差平方和。
F0.01（2, 12）= 6.93，F0.05（2, 12）= 3.89，F0.1（2, 12）= 2.81
F0.01（4, 12）= 5.41，F0.05（4, 12）= 3.26，F0.1（4, 12）= 2.48
试验结果统计分析见表3，试验结果方差分析见表4。
2．试验结果统计分析与方差分析中的数学概念及意义：
（1）因子的偏差平方和
因子的偏差平方和用Sj 表示，其计算公式为：
为：S A =0.9, S B =0.05, S C =0.23, SD =0.07, S E =0.11，每一因子的偏差平方和反映了三个水平变化所引起的试验结果差异，其中也包含试验误差的影响。
（2）因子间交互作用的偏差平方和
由于三水平因子间的交互作用占据正交表中的两例，所以因子间交互作用的偏差平方和应为两列偏差平方和相加。
S A×B = S3 + S4 = 0.01 + 0.05 = 0.06
S A×C = S6 + S7 = 0.22 + 0.10 = 0.32
S A×E = S9 + S10 = 0.04 + 0.02 = 0.06
（3）实验误差的偏差平方和
实验误差的偏差平方和Se ，可以用正交表中未排因子空白列的偏差平方和计算。正交表中第12列、第13
列没有安排因子，所以其偏差平方和中不包含因子水平变化所引起
的差异，而仅仅反映出实验误差的大小。此外，如果其它列的偏差平方和与空白列的偏差平方和大小相近，也可作误差估计，这样使误差估计更精确。所以Se = S12 + S13 +S3 + S 4 + S9 +S10 = 0.01 + 0.07+ 0.01+ 0.05 + 0.04+ 0.02 = 0.2
A ×B 与A ×C 交互作用是用S 3 + S4 及S 9 + S10 考察的。计算后其偏差平方和大小与空白列的偏差平方和接近，说明A 与B 、A 与E 间不存在交互作用。
（4）平均偏差平方和与自由度
为了合理地比较两组个数不同数据的分散和集中程度，应采用平均偏差平方和，即偏差平方和除以自由度。
因子自由度f =因子水平数－1，f A ×B =A因子自由度×B 因子自由度。
（5）F 比
因子水平改变引起的平均偏差平方和与实验误差的平均偏差平方和之比值称为F 比。因子的F 比值越大，越说明因子的偏差平方和是由因子水平改变所引起，该因子是影响实验结果的越显著因子。
（6）F 分布表与F 比临界值
为了判断F 比大小的实际意义，即F 比多大时即可认为试验结果的差异主要由因子水平变化所引起，F 比多小时可认为试验结果差异主要由实验误差所引起，这就需要一个标准，据此衡量F 比的大小。在F 分布表中，按因子的自由度和实验误差的自由度所查得的数值称为临界值，该临界值即作为衡量F 比大小的标准。
（7）信度α
在判断F 比与临界值大小时，信度α是指我们对作出的判断大概有1-α的把握。当A 因子的F 比大于在α=5%的F 分布表中查得的临界值（用F 0.05（f A ，f e ）表示）时，我们大概有95%的把握判断因子A 的水平改变对试验结果有显著影响。常用的信度有α=1%，5%，10%等，根据自由度可在各种信度的F 分布表上查得F 比的临界值，分别记作F 0.01 (n1,n2), F0.05 (n1, n2), F0.10 (n1, n2)等。
（8）显著性
设因子A 的F 比为FA
当F A >F0.01(n1,n2)时，说明A 因子水平改变对实验结果有高度显著的影响，记作**。 当F 0.01 (n1,n2)> FA >F0.05 (n1, n2)时，说明A 因子水平改变对实验结果有显著影响，记
作*。
当F 0.05 (n1, n2) > FA >F0.10 (n1, n2)时，说明A 因子水平改变对实验结果有一定影响，记作○*。
当F A
3．试验结果与结论
本例通过试验结果统计分析、方差分析表明：
（1）培养基中黄豆饼粉与蛋白胨（因子A ）的水平变化对抗生素的产量有高度显著的影响。根据I A ，II A ，III A 的大小比较，选取2水平为好。
（2）培养基中葡萄糖（因子B ）的水平变化对抗生素的产量没有显著影响。根据I B ，II B ，III B 的大小比较，选取2水平为好。
（3）培养基中KH 2PO 4（因子C ）的水平变化对抗生素的产量有显著影响。根据IC ，II C ，III C 大小比较，选取2水平为好。
（4）培养基中碳源1号（因子D ）的水平变化对抗生素的产量没有显著影响。根据I D ，II D ，III D 大小比较，选取2水平为好。
（5）培养基摇瓶装液量（因子E ）的水平变化对抗生素的产量有一定影响。根据I E ，II E ，III E 大小比较，选取1水平为好。
（6）培养基中黄豆饼粉+蛋白胨与KH 2PO 4交互作用对抗生素产量有显著影响。参照交互作用表，黄豆饼粉+蛋白胨取3水平，而KH 2PO 4取2水平为好。
经正交试验，筛选的摇瓶发酵抗生素的最优条件是A 3B 2C 2D 2E 1，其最佳培养基配方是（%）：
黄豆饼粉1.5, 蛋白胨1.5, 葡萄糖6.5, KH 2PO 4 0.01, 碳源1号1.5, 装液量30mL/250mL锥形瓶。
本试验利用正交表，从原先需作243（35）次试验中只挑选作27次实验，就获得最优发酵条件A 3B 2C 2D 2E 1。该组试验虽没包含在27组实验中，但它是根据正交表的特点，经方差分析后，从27组实验中推测出来的最优试验方案，这正是利用正交表进行正交试验的优越性。
（四）产蛋白酶细菌的形态和分子鉴定
细菌的分类鉴定是微生物学中一项重要的内容。对细菌进行分类研究有助于人们利用有益细菌，控制有害细菌，并不断挖掘出新的细菌资源为人类的生产和生活服务。早
期的分类研究注重从表型特征对细菌进行认知，自二十世纪七十年代以来，人们已经开始采用先进的分析技术和分子生物学手段从细菌的心脏—核酸入手寻找细菌之间的亲缘关系，以探索细菌的系统发育。
细菌的表型特征（形态、生理特性、代谢产物等等）是细菌基因型的表观体现，同一个种的细菌具有相同或相近的表型特征。对细菌DNA 中G+Cmol%的检测已经表明，种内的差值小于3%；DNA 分子杂交技术则揭示出，DNA 相关性≥70%是细菌种的界限。这充分说明细菌表观特征与其基因型的相关性。
在微生物学实验课教学中，学习细菌分类鉴定常用的生理生化反应技术是进行细菌分类学学习的前提和基础。
细菌的代谢与呼吸，主要取决于酶的催化作用，各种细菌具有不同的酶系组成，因此表现在对某些含碳化合物及含氮化合物的分解利用情况不同，代谢产物也有所不同，这不但充分体现了细菌代谢类型的多样性，同时，还可以利用各种细菌生理化反应的特点，作为细菌分类鉴定的依据。
对于细菌的DNA 而言，DNA 是一个环形的大分子DNA, 真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA 与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA 分子的完整。提取DNA 的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS ）和蛋白酶K 的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA 溶液经乙醇沉淀使DNA 从溶液中析出。SDS 的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K 的重要特性是能在SDS 和EDTA （乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA 的反应体系中，SDS 可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA 分离；而蛋白酶K 可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵) 是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA ，而CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去。DNA 的电泳原理，DNA 分子在高于其等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于DNA 分子或DNA 片断的分子量差别，电泳后呈现迁移位置的差异。
随着分子生物学、化学分析技术的快速发展，微生物鉴定的方法与技术得到了相应的扩展。Woese 建立的16S rRNA（18S rRNA）基因序列分析方法对生命科学理论研究与试剂应用产生了重大影响。1985年，美国Cetus 公司的Mullis 等创建了一种聚合酶链反应（PCR 技术），在生命科学各个领域中得到了广泛的应用，同样在微生物鉴定中发挥着重要作用。正是因为这种方法与技术产生的深远影响，Mullis 等科学家获得了诺贝尔奖。
PCT 技术在微生物菌种鉴定中的应用主要有：（1）DNA 指纹图谱分析，包括随机扩增多态性DNA 、扩增rDNA 限制性片段分析和扩增片段长度多态性等，通过PCR 技术对微生物染色体DNA 进行比较分析。（2）16S rRNA（18S rRNA）的序列检测。这些技术已成为确定微生物分类地位的关键性依据。
实际上，PCR 技术是将生物体内DNA 复制过程用于体外反应。该原理为通过设计一堆特异性引物，有效地识别靶DNA 片段两端相应位点，与模板单链DNA 上相应的位置互补，然后通过PCR 反应体系中的Taq 酶，完成一次循环，是靶DNA 片段扩增为2条。再经过变性、退火和延伸，靶DNA 量便扩增到4条，再经过变性是新形成的一条DNA 链与原来的DNA 链分开，成为两条DNA 单链；再经过引物重复上一次过程，不同的是新生的DNA 单链也成为模板链。如此循环30次，可使靶DNA 增加成千上万倍，在琼脂糖凝胶上可见明显的DNA 条带。因此通过PCR 技术可以扩增出细菌的16S rRNA 序列用于测序，鉴定。
（五）产蛋白酶细菌的紫外诱变选育
基因突变可分为自发突变和诱发突变，许多物理因素，化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。
在物理因素中紫外线具有较为理想的诱变效果，简单易行，操作方便，是一种最常用的物理诱变因素。
化学因素对采用一些化学诱变剂如盐酸氮芥、亚硝酸钠、乙酸亚胺、氯化锂和NTG 等。采用化学诱变剂进行诱变育种也是常用的育种技术。
紫外线诱变的主要作用是使DNA 双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱性的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的NDA 损伤，可由光复活酶的作用进行修复，是胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并且将照射处理后的微生物放在暗处培养。
四、器材与试剂
1、菌株
来自韶关学院校园的垃圾场、食堂的土壤和群达屠宰场的土壤中分离的产生蛋白酶的菌株。
2、培养基
牛肉蛋白胨培养基：牛肉膏 3.0g ，蛋白胨 10.0g ，NaCl 5.0g，琼脂 15-25g ，水 1000ml ，pH 7.4-7.6。
牛奶平板培养基：在普通牛肉膏蛋白胨培养基中添加质量浓度为1.5%的牛奶。脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（0.06 MPa，30min ），铺平板前再与加热熔化的牛肉膏蛋白胨培养基混合。
基础培养基：葡萄糖40.0g ，蛋白胨20.0g ，Na 2HPO 4 1.4g，CaCl 2 0.6g，MgSO 4 0.4g，pH 7.0-7.4, 琼脂 15-25g ，水 1000ml 。
3、试剂
牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、琼脂粉、脱脂奶粉、PCR 高保真酶、溶菌酶、细菌基因组提取试剂盒、EDTA 、PCR 产物回收试剂盒、氨苄青霉素、酵母提取物、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、硝酸盐、酵母膏、黄豆粉、花生粉、磷酸氢二钠，氯化钙、硫酸镁、引物（27F:5’-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3’；1492R:5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）
4、器材
试管、三角烧瓶、漏斗、量筒、吸管、烧杯、纱布、棉花、玻璃棒、pH 试纸、铁架台、漏斗架、止水夹、电炉、台秤、硫酸纸、药匙、牛皮纸、线绳、标签纸、剪刀、解剖刀、镊子、白瓷盘、（比色盘）铁丝筐。无菌培养皿、无菌吸管、无菌水、酒精灯、接种环、接种针、火柴等、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、灭菌培养皿、灭菌培养基、无菌水、超净工作台、酒精灯、分光光度计、恒温摇床、pH 计、离心机、电泳槽、PCR 仪等。
五、实验操作
（一）培养基的配制、分装与灭菌
1. 牛肉膏蛋白胨培养基的制作方法
称量：按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一
把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。
溶化：在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
调pH ：在未调pH 前，先用精密pH 试纸测量培养基的原始pH 值，如果pH 偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH 试纸测其pH 值，直至pH 达7．6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH 值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH 值较精确的微生物，其pH 的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。
过滤：趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。
分装：按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
加塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
包扎：加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
灭菌：将上述培养基以1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。采用高压蒸汽灭菌，具体步骤如下：① 需灭菌的物品（分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基），棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好（防止锅内水汽把棉塞淋湿），放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。② 将灭菌锅盖的排气管插入套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。③ 打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内
冷空气，排气约5~10分钟，关闭放气阀。④ 关闭放气开关后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至121℃，压力达0.1MPa 时，保持20~30分钟，即达到灭菌目的。⑤ 灭菌完毕，待压力自然降至“0”时，打开放气开关，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。⑥ 打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。
搁置斜面:将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24-48小时，以检查灭菌是否彻底。
2、牛奶平板培养基：在普通牛肉膏蛋白胨培养基中添加质量浓度为1.5%的牛奶。脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（0.06 MPa，30min ），铺平板前再与加热熔化的牛肉膏蛋白胨培养基混合。
（二）、产蛋白酶细菌的分离与纯化
1. 土壤样品的稀释
首先把微生物悬液通过一系列稀释，取1g 样品，放入装有99mL 无菌水的三角瓶中，振荡10-15min ，稀释倍数=10-2；从三角瓶中吸取1mL 稀释液放入装有9mL 无菌水的试管中，振荡2-3min ，均匀，稀释倍数为10-3 ；如此依次稀释得到稀释倍数为：10-4，10-5，10-6，10-7,10-8等的稀释样品。重复3次。
2、倒平板
在最后的3个浓度的试管中分别取样，从每支试管中分别吸取1mL 取的稀释液，与熔化好的保持在40-50℃左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固。倒平板见下图：
图（a ）倾注平板法（b ）涂布平板法
1. 菌悬液 2. 熔化的培养基 3. 培养物 4. 无菌水
3、观察
倒置放在培养箱中培养，24-48h 后观察培养基上的菌落情况，以及菌落附近的水解圈情况。
4、平板划线法纯化在接种室或超净工作台内进行）
用无菌的接种环取具有水解圈的培养物少许在牛奶平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
（1）斜线划线法：左手拿平板平皿，盖稍微打开，右手拿接种环，以无菌操作蘸一环土壤菌悬液，在平板一边划第一道平行线2~3条，转动培养皿约70度角，用烧灼过的接种环，待冷却后，接种环从第一道线划过做第二道平行线，同法划第三道平行线，如此划第四道平行线（如下）。每种培养基划线一套。
（2）曲线划线法：其它操作如同直线法，只是划线是划成曲线（如下图）。每种培养基划线一套。
平板接种与划线法
A. 接种时，用左手将平皿开启一缝；B. 棉签伸手入平板接种；
C ．用已灭菌并冷却了的接种环划线；D. 第二部分划线；E. 最后部分划线
（3）划线完后，把平皿倒置放在30℃下培养，细菌分离要培养24~48h，放线菌分离要培养5~7d；霉菌分离要培养3~5d。观察生长的菌落（如下图），再作进一步的分离纯化或直接挑取单个菌落接入斜面培养后保存备用。
划线分离出的细菌单菌落
（注意事项：1、分离纯化操作全过程要在无菌室或超净工作台内进行。2、划线时时，接种环要圆滑；接种环与平板成45°角，用手腕力轻巧地在平面上滑动，避免划破培养基；防止在空间划线。
三、产蛋白酶细菌的培养发酵与条件优化
1、不同碳源对细菌产生蛋白酶的影响
（1）用蒸馏水制备不同碳源的基础培养基，它们的碳源分别为：葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，淀粉，乙酸钠和不加任何碳源共6种，灭菌备用。
（2）每种培养基做3个平板，然后分别将菌株点接在每一平板中心，在37℃下培养。
（3）24h 后开始测量各种培养基上的菌落直径和水解透明圈的直径，以后每1d 测量一次。
（4）测量菌落直径和水解圈时，要同时记录下： a. 菌落形态 b. 水解圈的直径 c. 水解圈直径和菌落直径的比值。
1、不同氮源对细菌产生蛋白酶的影响
（1）用蒸馏水制备不同氮源的基础培养基，它们的碳源分别为：蛋白胨，尿素，干酪素，牛肉膏，硫酸铵，硝酸钾，大豆分离蛋白和不加任何氮源共6种，灭菌备用。
（2）每种培养基做3个平板，然后分别将菌株点接在每一平板中心，在37℃下培养。
（3）24h 后开始测量各种培养基上的菌落直径和水解透明圈的直径，以后每1d 测量一次。
（4）测量菌落直径和水解圈时，要同时记录下： a. 菌落形态 b. 水解圈的直径 c. 水解圈直径和菌落直径的比值。
四、产蛋白酶细菌的形态和分子鉴定
1、产蛋白酶细菌的形态观察
（1）涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴无菌水，用无菌操
作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，
涂布面积约1-1.5㎝2，如左图。
（2）干燥 将涂片于室温中自然干燥，如左图。
（3）固定 手持载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通
过微火2-3次。在火焰上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手
为宜。不能将载片在火焰上烤，如左图。
（4）染色 将涂片置于水平位置，滴加一种染色液覆盖于
涂菌处，染色约2min ，如左图。
（5）水洗 倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由
载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，洗至从载片上流下的水
无染色液的颜色为止，如左图。
（6）干燥 自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦
掉菌体，如左图。
（7）待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍观察，将典型
部位移至视野中央，再用油镜观察，如左图。
（8）绘制菌株的显微图。
2、菌株基因组DNA 的提取
使用北京普博欣生物科技有限责任公司的细菌基因组DNA 小量提取试剂盒对筛选出的菌株进行DNA 提取。
步骤如下：
（1）取适量的细菌培养液，10000rpm/ min离心1min
，弃上清液，留细菌沉淀以备
用。
（2）若提取的细菌为革兰氏阴性菌，可以在菌体沉淀中加入200 μl裂解液GDL 。用枪头吹打几下，充分混匀。然后进入步骤4。
（3）若提取的细菌为革兰氏阳性菌，则必须利用溶菌酶溶解细胞壁。
（4）加入5μl RNase A溶液，充分混匀。
（5）加入15μl蛋白酶K ，充分混匀。
（6）加入220μl缓冲液GDB 充分混匀，加入GDB 有可能会出现白色沉淀，放置于70℃水浴时便会消失。
（7）对于革兰氏阴性菌70℃保温15min （革兰氏阳性菌需70℃保温30min ）。等溶液变成清亮后，离心数秒去除管壁上的水珠。
（8）加入220μl的无水乙醇，剧烈振荡，使其充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
（9）将离心柱装在收集管上，然后将所得到的溶液及沉淀都转移入新的离心柱中。12000rpm 离心1min ，倒掉收集管中的滤液。
（10）加入500μl蛋白清洗液PWB ，12000rpm 离心1min 。倒掉收集管中的滤液。并将离心柱放回收集管中。
（11）加入500μl洗涤液WB ，12000rpm 离心30sec 。
（12）重复步骤11的操作一次。
（13）12000离心1min ，去掉离心柱中的所有液体。将离心柱放在一个洁净的新的
1.5ml 离心管中，置于37℃烘箱放置5-10min ，直至管中的乙醇全部挥发为止。
（14）往离心柱中心悬空滴加经70℃水浴预热的100-200μl洗脱液EB 。室温放置2min 后，12000rpm 离心30sec ，洗脱DNA 到离心管中。为了得到更多的DNA ，可以再加100-200μl洗脱液EB ，再次洗脱。
（15）取10μl DNA进行0.8%琼脂糖电泳以检测DNA 的完整性和质量。
4 菌株16s rDNA的PCR 扩增
使用北京金全士公司的2×RransStartTM FsatPfu PCR SuperMix对提取出的DNA 进行扩增。以50μl反应体系如下：
菌株 DNA 5 μl
引物27F 2 μl
引物1492R 2 μl
2×RransStartTM FsatPfu PCR SuperMix 25 μl
ddH 2O
PCR 反应条件如下：
94℃ 2-5min
94℃ 20sec
50-60℃ 20sec
72℃ 1min
30cycles
72℃ 5min
取10μl PCR产物进行0.8%琼脂糖电泳检测其质量。
4、PCR 产物回收
使用北京普博欣生物科技有限责任公司的PCR 产物回收试剂盒对已扩增出的PCR 产物进行提取。
具体步骤如下：
（1）将PCR 产物转移到一个新的1.5ml 离心管中，大约计算液体总量，并加入3倍体积的结合液BB ，充分混匀。
（2）将溶液转移到离心柱中，静置2min ，12000rpm 离心30sec 。若一次加不完可分两次操作。
（3）倒掉收集管中的滤液，将离心柱重新装在原来收集管中。
（4）加入700μl洗涤液WB 于离心柱中，12000rpm 离心30sec 。
（5）倒掉收集管中的滤液，将离心柱重新装在收集管中。再加入500μl洗涤液WB 于离心柱中12000rpm 离心30sec ，弃滤液。将离心柱重新装在收集管中，12000rpm 离心1-2min ，充分离心去掉洗涤液。
（6）将离心柱重新装在收集管中，置于室温活37℃烘干箱数分钟，充分晾干以除掉洗涤液中的乙醇。
（7）将晾干后的离心柱装在一个高压灭菌处理过的1.5ml 离心管中，向离心柱膜中间位置悬空加入20-50μl洗脱液EB 或去离子水，室温静置2min ，12000rpm 离心1min ，洗脱DNA 。
（8）取10μl PCR回收产物进行0.8%琼脂糖电泳检测回收产物的质量。
5、对PCR 产物进行序列鉴定 to 50μl
将回收的PCR 产物送往华大基因公司进行基因测序后，根据反馈得到的序列在NCBI 数据库（）进行同源性分析并确定菌株名称。
五、产蛋白酶细菌的紫外诱变选育。
1、将上述菌用显微镜直接计数，配制成108cell/mL的菌悬液。
2、紫外线照射处理
（1）将紫外线灯开关打开预热20min 。
（2）取上述计数过的菌液3mL 放入7cm 直径的无菌平皿中，做2套平皿，平皿内放入一根无菌玻棒或大头针。
（3）将这两套平皿置于磁力搅拌器上，在超净工作台内距离紫外线灯30cm 处，打开皿盖并搅拌下，分别照射0.5min 和2min 。盖上皿盖，关闭紫外线灯开关。
3、用无菌水于10倍稀释法把照射过的菌液稀释成10-1~10-6菌悬液。
4、取10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1mL/平板，用无菌玻璃刮涂布，每个稀释度涂布3套平板。以同样的方法，取未经UV 照射处理的原始菌液稀释涂布平板作为对照。
5、将上述涂布的平板标明处理项目，用黑布或黑低包好，倒置于37℃下培养48h 。
6、将培养好的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上cfu 数，计算出每毫升菌液中的cfu 数，同样计算出紫外线处理05.min 和2min 后的cfu 数及致死率。
7、选取处理后cfu 数在5~6个左右的涂布与牛奶平板上观察诱变效应，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值(HC值) 。与对照平板相比较，分析诱变效应，并选取HC 比值大的菌落移接到试管斜面上培养，此斜面可作复筛用或用化学诱变剂继续诱变。
存活率（%）= 对照每毫升cfu 数 处理后每毫升cfu 数 ×100 致死率（%）= 对照每毫升cfu －处理后每毫克cfu 数 对照每毫升cfu 数 ×100
8、注意事项
（1）紫外线照射时，应先开搅拌器开关，再开盖照射，以使菌液中的细胞接受照
射均等；时间计算要从开盖起，加上盖止；操作者应戴上眼镜，以免紫外线伤及眼睛。
（2）紫外线照射处理，直至涂布等操作过程应在红光下进行，以防光复活作用。
六、实验报告
将本实验的所有内容写成一个实验报告。
七、思考题
1、什么叫培养基？有什么功能？培养微生物的培养基应该具备哪些条件？
2、培养基为什么要灭菌后再用？可否用橡皮塞，木塞代替棉塞或硅胶泡沫塞？
3、如何检查灭菌后的培养基是无菌的？
4、划线分离过程中，划完第一道线后再划第二道线时，为什么接种环要在火焰上烧灼冷却后再划线呢？
5、紫外线引起诱变的机理是什么？为保证诱变效果，在照射过程及照射后应注意哪些问题？