生物技术通报
・综述与专论・
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００７年第１期
嗜酸硫杆菌属硫氧化系统研究进展
张成桂
摘
要：
夏金兰王晶邱冠周
４１００８３）
（中南大学资源加工与生物工程学院，长沙
硫化矿的酸溶解和化学氧化过程中（Ｈ＋和Ｆｅ３＋作用下，金属硫化矿中分解），伴随着硫元素转变成多聚硫Ｓ８
或硫代硫酸盐的过程。对嗜酸硫杆菌属硫氧化过程的研究表明，胞外环状多聚硫Ｓ８可能通过细胞外膜蛋白巯基活化成线状
－ＳｎＨ后，被转运到细胞周质区域，进而被硫加双氧酶氧化成ＳＯ３２－，活化过程中同时生成少量Ｈ２Ｓ；这些酶促反应不需要辅
助因子参与，不释放电子。胞外硫代硫酸盐通过未知途径进入细胞周质。细胞周质中的ＳＯ３２－主要经由亚硫酸－受体氧化还原酶氧化成ＳＯ４２－，Ｓ２Ｏ３２－可能经由硫代硫酸盐－辅酶Ｑ氧化还原酶、硫代硫酸盐脱氢酶、连四硫酸盐水解酶等氧化为硫酸，少量Ｈ２Ｓ则经由硫化物－辅酶Ｑ氧化还原酶氧化为多聚硫，后者再经由ＳＯ３２－和Ｓ２Ｏ３２－氧化生成最后产物ＳＯ４２－。这些生物氧化过程释放的电子进入呼吸链参与产生细菌生长代谢所需的能量。然而，关于Ａ．
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ硫氧化系统中各种硫化合
物的酶催化氧化机制的研究仍很缺乏，胞内外硫化合物的转运机制、是否存在胞外酶催化氧化等仍然有待解决。另外，硫的型态和价态、酶催化反应的细胞微区域以及硫氧化系统中一些关键酶的分离及其表达基因的鉴定等问题都还有待进一步研究。基于对这些事实的分析，提出了一个嗜酸硫杆菌属硫氧化系统的模型。
关键词：
硫氧化系统
嗜酸硫杆菌属
硫加双氧酶
硫化物－辅酶Ｑ氧化还原酶
硫代硫酸盐－辅酶Ｑ氧化还原酶
硫代硫酸盐硫转移酶亚硫酸－受体氧化还原酶连四硫酸盐水解酶
ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｎＲｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｆＳｕｌｆｕｒＯｘｉｄａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｏｆ
Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．
ＺｈａｎｇＣｈｅｎｇｇｕｉＸｉａＪｉｎｌａｎ
ＷａｎｇＪｉｎｇＱｉｕＧｕａｎｚｈｏｕ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＲｅｓｏｕｒｃｅｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００８３）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｍｅｔａｌｓｕｌｆｉｄｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｅｓｗｅｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｔｏｂｅｌａｒｇｅｌｙｃｈｅｍｉｃａｌｗａｙｓｉｎｗｈｉｃｈｔｈｅ
ｓｕｌｆｕｒｉｎａｍｉｎｅｒａｌｗａｓｏｘｉｄｉｚｅｄｗｉｔｈＦｅ２＋ｂｙｅｉｔｈｅｒｐｏｌｙｓｕｌｆｉｄｅｐａｔｈｗａｙｏｒｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅｐａｔｈｗａｙｉｎｔｏｐｏｌｙｓｕｌｆｕｒＳ８ａｎｄｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＲｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｎｔｈｅｓｕｌｆｕｒｏｘｉｄａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆＡｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｏｌｙｓｕｌｆｕｒ（Ｓ８）ｉｓｐｒｏｂａｂｌｙｍｏｂｉｌｉｚｅｄｂｙｔｈｉｏｌｇｒｏｕｐｓｏｆｓｐｅｃｉａｌｏｕｔｅｒ－ｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｓｐａｃｅａｓｐｅｒｓｕｌｆｉｄｅｓｕｌｆｕｒ（－Ｓ２Ｈ），ａｎｄｔｈｅｎｏｘｉｄｉｚｅｄｂｙｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｓｕｌｆｕｒｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅｉｎｔｏＳＯ３２－ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄｗｉｔｈｒｅｌｅａｓｅｆｅｗｏｆＨ２Ｓ．Ｔｈｅｓｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓｍａｙｄｏｎｏｔｎｅｅｄａｎｙｃｏｆａｃｔｏｒａｎｄｄｏｎｏｔｒｅｌｅａｓｅｅｌｅｃｔｒｏｎｓ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅｗａｓｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｓｐａｃｅｂｙａｎｕｎｋｎｏｗｎｗａｙ．ＴｈｅＳＯ３２－ｉｎｔｈｅｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｓｐａｃｅｉｓｍａｉｎｌｙｏｘｉｄｉｚｅｄｉｎｔｏＳＯ４２－ｂｙｓｕｌｆｉｔｅ：ａｃｃｅｐｔｏｒｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ａｎｄＳ２Ｏ３２－ｉｓｏｘｉｄｉｚｅｄｉｎｔｏＳＯ４２－ｐｏｓｓｉｂｌｙｂｙｔｈｉｏｓｕｌａｆｔｅ：ｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ．ＴｈｅｆｅｗＨ２Ｓｉｓｏｘｉｄｉｚｅｄｂｙｓｕｌｆｉｄｅ：ｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｉｎｔｏＳ８ｔｈａｔｍａｙｂｅｆｕｒｔｈｅｒｏｘｉｄｉｚｅｄｂｙｗａｙｓｏｆＳ２Ｏ３２－ａｎｄＳＯ３２－ｔｏｔｈｅｆｉｎａｌＳＯ４２－．Ｔｈｅｓｅｂｉｏ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｅｓｎｅｅｄｓｏｍｅｃｏｆａｃｔｏｒｓａｎｄｒｅｌｅａｓｅｅｌｅｃｔｒｏｎｓｔｈａｔｔｒａｎｓｆｅｒｔｏｔｈｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｃｈａｉｎｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｅｒｇｙｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｇｒｏｗｔｈ．Ｙｅｔ，ｉｔｉｓｖｅｒｙｌａｃｋｉｎｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅｓｕｌｆｕｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ａｎｄｉｔｉｓｓｔｉｌｌｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄｈｏｗｔｈｅｓｕｌｆｕｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｒｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｓｏｒｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔａｄｄｉｔｉｏｎａｌｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄｅｎｚｙｍｅｓｔｈａｔｃａｔａｌｙｚｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｕｌｆｕｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｔｔｈｅｏｕｔｓｉｄｅｏｆｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓ，ｔｈｅｓｐｅｃｉａｔｉｏｎｏｆｓｕｌｆｕｒ，ａｎｄｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｒｅａｃｔｉｏｎｓｍｉｃｒｏ－ｒｅｇｉｏｎｐｅｒｔｉｎｅｎｔｔｏｔｈｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｒｅｄｕｃｅｄｓｕｌｆｕｒ－
收稿日期：２００６－０７－２４基金项目：９７３计划“微生物冶金的基础研究”项目（２００４ＣＢ６１９２０１）
作者简介：张成桂（１９７８－），男，博士研究生，主要从事微生物冶金的基础研究通讯作者：夏金兰（１９６４－），男，博士，教授，博士生导师，主要从事微生物冶金、生物材料和资源生物转化的基础研究
６０生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ
２００７年第１期
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｏｍｐｏｕｎｄｓａｒｅａｌｓｏｔｏｂｅａｄｄｒｅｓｓｅｄｉｎｍｕｃｈｍｏｒｅｄｅｔａｉｌｓ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｎａｌｙｓｅｓｏｆｔｈｅｓｅｆａｃｔｓ，ｉｎｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅ，ａｍｏｄｅｌｏｆｓｕｌｆｕｒｏｘｉｄａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＡｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．ｈａｄｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
Ｓｕｌｆｕｒｏｘｉｄａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ
Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ．
Ｓｕｌｆｕｒｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ
Ｓｕｌｆｉｄｅ：ｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ
Ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ：ｑｕｉｎｏｎｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅＴｈｉｏｓｕｌｆａｔｅｓｕｌｆｕｒｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＳｕｌｆｉｔｅ：ａｃｃｅｐｔｏｒｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓＴｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ
金属硫化物在酸性条件下，金属硫化矿在Ｈ＋
和Ｆｅ３＋作用下，金属硫化矿中分解，其中的硫原子转变为元素硫和硫代硫酸盐，其过程属于化学反应的范畴；但是，嗜酸硫杆菌属等微生物等参与对亚铁和还原性硫的氧化作用产生金属循环不断溶出所需要的Ｆｅ３＋和Ｈ＋［１］。化学反应产生的元素硫和硫代硫酸盐经由细菌细胞转运到细胞周质区域被氧化，其中单质Ｓ在氧化的过程中不释放电子参与能量物质ＡＴＰ的长生，但转变为其它可溶性的硫化合物，为其它还原性硫化合物氧化还原酶，如亚硫酸盐－受体氧化还原酶、硫代硫酸盐－辅酶Ｑ氧化还原酶等提供底物，在Ｓ活化时产生少量的Ｈ２Ｓ则作为硫化物－辅酶Ｑ氧化还原酶的底物，被氧化为元素硫，这些酶催化氧化还原反应产生的电子进入呼吸链后参与细菌生长代谢所需能量的生产［２］。近年来由于金属硫化矿生物浸出对资源利用的重要性以及金属硫化矿废堆酸性渗流液引起的环境问题，有关金属硫化矿硫氧化机制的研究引起了相关科学工作者的重视，相关研究日渐增多，但国内研究相对缺乏，需要对就近年来有关金属硫化物的溶解、硫元素在嗜酸硫杆菌属体内的氧化还原作用的研究进展进行综合评述。本文作者在此基础上，提出一种关于Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ的硫氧化系统模型。
多聚硫化物溶解途径则适用于ＺｎＳ、ＰｂＳ、ＦｅＡｓＳ、
ＣｕＦｅＳ２、ＭｎＳ２、ＣｕＳ、Ｃｕ２Ｓ、ＮｉＳ、ＣｏＳ和ＣｄＳ等众多金
属硫化物的溶解，它基于Ｆｅ３＋在Ｈ＋的协助下的对金属硫化物的氧化作用，将金属硫化物溶解，其中金属硫化物中大约９０％硫元素转变为多聚硫（如图１所示），其余则生成少量的Ｓ２Ｏ３２－和单质Ｓ［５，６］。
图１多聚硫化物溶解途径示意图
图１中强酸Ｈ２Ｓ＊＋电离产生自由基ＨＳ＊，后者容易形成Ｈ２Ｓ２及后续的多聚硫化氢；多聚硫化氢不稳定，大多数分解产生单质Ｓ８，少量被Ｏ２或Ｆｅ３＋氧化成Ｈ２Ｓ２Ｏ３和单质Ｓ［错误！
未定义书签。］
。这个氧化反
应在没有Ｆｅ３＋存在的情况下也能进行，电子经过导电的硫化物ＭＳ传递到Ｏ２，Ｏ２通过形成超氧自由基和过氧化氢而被还原成Ｈ２Ｏ［７］。然而，在浸矿生物群落中Ｆｅ３＋的存在，Ｆｅ３＋更容易从ＭＳ晶格中夺取电子。
上述两种反应机制都是属于化学反应的范畴，但是，在有微生物参与的情况下，Ｆｅ３＋主要由细菌胞外的多聚体供应，这种多聚体附合在葡萄醛酸残基上，亚铁氧化细菌（如Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ，Ｌ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ等）能够保持Ｆｅ３＋的氧化状态，硫氧化细菌（如Ａ．
１金属硫化物的溶解
浸矿酸性环境下，金属硫化矿在Ｈ＋和Ｆｅ３＋作用
下，经过硫代硫酸盐途径或多聚硫化氢途径而分解；浸矿细菌利用对亚铁或／和无机还原性硫化合物的氧化来提供其生长所需的能量，同时维持浸矿环境中金属离子不断浸出所需要的高铁离子和质
５］子［１，３～。
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ，Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ等）能够参与单质元素Ｓ
和其他还原性硫化合物的氧化，产生Ｈ＋保持溶液的酸性环境。图２给出了在微生物作用下，金属硫化矿溶解和硫元素氧化的硫代硫酸盐途径和多聚硫化氢途径的概况模式图［１，５，８］。如图２所示，在微生物作用下，在硫代硫酸盐途径机制中，由于Ｆｅ３＋对金属硫化矿中元素硫的有氧氧化，使得金属硫化矿溶解，同时生成了Ｓ２Ｏ３２－，Ｓ２Ｏ３２－进一步被氧化，经由ＳｎＯ６２－和Ｓ８最后生成ＳＯ４２－；在多聚硫化物途径机制中，由于Ｈ＋的作用和Ｆｅ３＋对金属硫化矿中元素硫的有氧氧化，使得金属硫化矿溶解，同时生成了
硫代硫酸盐溶解途径适用于ＦｅＳ２、ＭｏＳ２和ＷＳ２
等金属硫化物的溶解，它完全基于Ｆｅ３＋对元素Ｓ的氧化作用直至元素硫中的六个电子全部被转移，形成Ｓ２Ｏ３２－，将金属元素分离到溶液中去。这个化学反应中还伴随单质Ｓ的产生，金属硫化物中大约有
２０％的硫变成单质Ｓ。
２００７年第１期
张成桂等：嗜酸硫杆菌属硫氧化系统研究进展６１
Ｈ２Ｓ２或Ｓ８，Ｈ２Ｓ２或Ｓ８进一步被氧化，经由ＳＯ３２－和Ｓ２Ｏ３２－最后生成ＳＯ４２－。
催化反应机理的报道。采用物理学的方法分析，发现该酶没有典型氧化还原酶的辅助因子（如细胞色素和核黄素）参与催化反应。
Ｃ．Ｄａｈｌ等［１０］报道在Ａ．ｖｉｎｏｓｕｍ中硫化物和硫
代硫酸盐的氧化过程中，有些蛋白质和单质Ｓ形成硫氧化过程中间产物（ＲＳｎ－ＲｏｒＲ－Ｓｎ－Ｈ）而短时间地存在于细胞周质空间。Ｔ．Ｒｏｈｗｅｒｅｒ和Ｗ．Ｓａｎｄ用嗜酸细菌Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ，Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ和Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ
ａｃｉｄｏｐｈｉｌｉｕｍ细胞提取物来研究依赖于ＧＳＨ的硫加
双氧酶的真正底物，发现ＧＳｎＨ能作为酶反应底物，但是ＧＳｎＨ十分的不稳定，能快速分解为单质Ｓ和较稳定的ＧＳ２Ｈ。ＧＳ２Ｈ在酶促条件下或非酶促条件下发生如下反应：
图２
金属硫化矿微生物浸出过程的硫代硫酸盐途径机制和多聚硫化物途径机制概况模式图
其中Ａ．ｆ．＝Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ，Ａ．ｔ．＝Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ＧＳＳＨ＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→ＧＳＨ＋ＳＯ３２－＋２Ｈ＋２ＧＳＳＨ→ＧＳ３Ｇ＋Ｈ２Ｓ
（酶促反应）（自发反应）
ＧＳｎＧ单独不能作为酶反应底物，但是ＧＳｎＧ在
有ＧＳＨ的情况下能作为底物，原因是发生了如下反应：
ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ，Ｌ．ｆ．＝Ｌｅｐｔｏｓｐｒｉｌｌｕｍｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ
２单质Ｓ的氧化
如图２所示，在多聚硫化物机制中，产生环状
ＧＳｎＧ＋ＧＳＨ→ＧＳｘＨ＋ＧＳｙＧ（ｎ＞２，ｘ＞１，ｙ＞１）
早期Ｔ．Ｓｕｇｉｏ
［１１］
的试验结果表明Ｈ２Ｓ在ＧＳ２Ｇ
结构的单质硫（Ｓ８）。Ｓ８在自然条件下或酸性环境中是相当稳定的，但在硫氧化细菌的存在下，通过硫氧化酶系的作用氧化分解并生成最终产物ＳＯ４２－。不过，目前有关Ｓ８细菌作用过程的初始步骤的酶，以及Ｓ元素的利用始于氧化或还原等问题一直悬而未决。
存在的情况下也能直接氧化成ＳＯ３２－。其原因是因为Ｈ２Ｓ和ＧＳ２Ｇ发生反应产生了ＧＳＳＨ（Ｈ２Ｓ＋
ＧＳＳＧ→ＧＳＳＨ＋ＧＳＨ），ＧＳＳＨ作为硫加双氧酶的底物
而被催化氧化生成ＳＯ３２－。
这些研究结果肯定了ＧＳｎＨ（或ＧＳ２Ｈ）而非
ＧＳｎＧ是酶促反应底物。既然ＧＳＳＨ中含有硫烷硫，
是不是所有含有硫烷硫的物质都能发生此反应呢？但研究发现如Ｓ２Ｏ３２－，ＳｎＯ３２－等都不能替代ＧＳｎＨ（或
２．１单质硫氧化模式的提出
Ｔ．Ｒｏｈｗｅｒｅｒ和Ｗ．Ｓａｎｄ［９］提出了单质Ｓ８先被活
化然后被催化氧化的模式，其中，活化反应首先由亲核反应试剂打开环状结构的Ｓ８，即细胞外的单质
ＧＳ２Ｈ）作为酶促反应底物。
２．２单质硫的活化和转运相关蛋白的研究有关硫活化、转运相关膜蛋白的研究非常缺
Ｓ与外膜蛋白上的硫醇基团ＲＳＨ（功能类似于大量
的ＧＳＨ）相互接触后被活化，形成线状的无机硫与有机物结合的ＲＳｎＨ（ｎ＞＝２），然后转运到细胞周质后被硫加双氧酶氧化，形成主要产物ＳＯ３２－。其中，活化过程中，可能产生少量的Ｈ２Ｓ。
体外试验表明，在酸性环境中生长的细菌，Ｓ８
的氧化依赖于低分子量硫醇（如谷胱甘肽ＧＳＨ）酶的催化，该酶依靠ＧＳＨ将单质Ｓ活化（ＧＳＨ＋Ｓ８→
乏。ＲａｍíｒｅｚＰ．等［１２］比较研究了Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ在元素硫和Ｆｅ２＋基质中生长时细胞体内总蛋白质表达的差异，发现在元素硫基质中生长的细胞一分子量为４４ｋＤａ的外膜蛋白表达上调。Ｔ．Ｓｕｇｉｏ等［１３］从Ａ．
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓＡＰ１９－３的外膜蛋白中分离并鉴定出
了一种富含硫醇基团的外膜蛋白，但未能确定该外膜蛋白的功能便是和单质Ｓ的活化及转运相关。
ＧＳ９Ｈ→…→ＧＳｎＨ）以作为硫加双氧酶的底物。
目前还没有关于硫加双氧酶的活性反应中心
Ｎ．Ｏｈｍｕｒａ等
［１４］
发现在硫生长基质中生长的Ａ．
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ的鞭毛上有一种硫结合蛋白（４０ｋＤａ），
６２生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ
２００７年第１期
该蛋白通过与硫形成二硫键的形式使Ａ．
件下催化氧化和还原单质Ｓ的产物是ＳＯ３２－，Ｓ２Ｏ３２－和Ｈ２Ｓ［２０］。Ａｃｉｄｉａｎｕｓａｍｂｉｖａｌｅｎｓ中的ｓｏｒ基因已经被克隆测序［２１］，但在Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ中没有与古生菌
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ特异地吸附在硫的表面上。Ｖ．Ｂｕｏｎｆｉｇｌｉｏ等［１５，１６］在将Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ从Ｆｅ２＋生长基
质转入到以单质Ｓ或是硫代硫酸盐为基质的培养液中时，发现Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ外膜蛋白成分显著变化。例如，在单质Ｓ基质中生长的Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ表达一分子量为５５ＫＤａ的外膜蛋白质，该蛋白在Ｆｅ２＋基质中生长的Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ外膜却没有出现；另外，发现一分子量为４７ＫＤａ的组成性表达外膜蛋白，该蛋白在单质Ｓ或硫代硫酸盐基质中的表达相对较高，而在Ｆｅ２＋基质中的的表达较少；说明这两种外膜蛋白可能和Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ对含硫化合物的氧化相关。另外，Ｖ．Ｂｕｏｎｆｉｇｌｉｏ等在对不同基质中的生长的菌株Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓＭＳＲ外膜蛋白的研究中，发现有一分子量为５０ＫＤａ的外膜蛋白只在单质Ｓ基质中生长的细菌细胞中高度表达，在黄铁矿和硫代硫酸盐基质中生长的细菌细胞的表达量也增加，但在Ｆｅ２＋基质中生长的细菌细胞中不表达。这种情况在Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓＡＴＣＣ２３２７０也得到了证实。该５０ＫＤａ的外膜蛋白中只有一个Ｃｙｓ残基，推测它可能在细菌吸附单质Ｓ的最初步骤中发挥重要作用。
但是这些研究都未能区分出硫活化和转运相关蛋白及其相关活化或转运机制。
Ａｃｉｄｉａｎｕｓａｍｂｉｖａｌｅｎｓ中ｓｏｒ同源相似的基因。
硫活化过程中，可能产生少量的Ｈ２Ｓ成为质膜上ＳＱＲ的底物，催化生成单质Ｓ８，单质Ｓ８在细胞周质被活化后进一步被氧化。Ｓ．Ｗａｋａｉ等
［２２］
在Ａ．
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓＮＡＳＦ－１中，以辅酶Ｑ作为电子受体时，
能检测到ＳＱＲ活性，且在Ｓ基质中生长的细胞的
ＳＱＲ活性是Ｆｅ２＋基质生长细胞中的１８倍，但是在
转录水平上，在Ｓ基质生长的细胞的ｓｑｒ转录量是
Ｆｅ２＋基质生长细胞中的３倍，相对于１８倍的酶活性
水平上的差异，相差较大，推测功能性ＳＱＲ的活性差异可能是缘于翻译后修饰或者辅助因子的参与。
３ＳＯ３２－的氧化
还原性硫化合物在Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ体内的氧化
过程中会产生大量的ＳＯ３２－，如果ＳＯ３２－没有被快速消化而在体内积累，就会对细胞产生毒害作用，影响细胞生长［２３］。因此，细胞体内需要有解除ＳＯ３２－毒性的氧化系统。一般ＳＯ３２－主要经由亚硫酸－受体氧化还原酶氧化成ＳＯ４２－。
研究发现，Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｎｏｖｅｌｌｕｓ［２４，２５］，Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｉｏｐａｒｕｓ
［２６］
，Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｖｅｒｓｕｔｕｓ
［２７］
和Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｃｏｎｃｒｅｔｉｖｏｒｕｓ［２８］中存在亚硫酸盐氧化酶，这些酶含有
钼元素，具有和哺乳动物亚硫酸盐氧化酶相似的特性，利用细胞色素ｃ或铁氰化物作为ＳＯ３２－氧化后的电子受体［２４］；Ｊ．Ｒ．Ｖｅｓｔａｌ等［２９］发现Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ中的亚硫酸盐氧化酶含有细胞色素ｃ，但是不含血红素和非血红素铁中心。Ｔ．Ｓｕｇｉｏ等
［３０］
２．３单质硫氧化酶系蛋白的研究
相对于硫活化和硫转运蛋白，有关硫氧化酶系
蛋白的研究要多得多。这些酶系蛋白主要包括硫加双氧酶、硫加氧还原酶、硫加氧酶、硫化物－辅酶Ｑ氧化还原酶等，前两者的底物为单质硫，第三者的底物为单质硫活化过程中产生的少量Ｈ２Ｓ。
从Ａ．
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓＡＰ１９－３中分离到了一种膜结合亚硫酸
盐氧化酶，其催化活性位点位于细胞周质，分子量为６５０ＫＤａ，含有分子量分别为５９ＫＤａ和６１ＫＤａ的两亚基，该酶以Ｆｅ３＋为电子受体，而不是以细胞色素ｃ或铁氰化物作为ＳＯ３２－氧化后的电子受体，这种亚硫酸氧化酶在有氧和无氧条件下都能快速地氧化ＳＯ３２－。Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ等［３１］和Ｇ．Ａ．Ｈ．ｄｅＪｏｎｇ等［３２］分别从Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ和Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ中分离到了利用细胞色素ｃ的亚硫酸盐氧化酶膜蛋白，体外试验表明其活性最优ｐＨ值为中性，暗示其活性中心位于细胞质液中。亚硫酸受体氧化还原
Ｉ．Ｓｕｚｕｋｉ
［１７，１８］
和Ｍ．Ｓｉｌｖｅｒ等
［１９］
分别对Ａ．
ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ和Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ的硫氧化酶进行了研
究，认为其中硫加双氧酶的硫氧化活性依赖于ＧＳＨ的参与，Ｓ从零价态转变为多聚硫化物之后直接氧化成ＳＯ３２－。在Ａｃｉｄｉａｎｕｓｓｐｐ．中也发现了十分相似的但不依赖ＧＳＨ的硫加双氧酶存在。在高温有氧条件下，从古生菌Ａｃｉｄｉａｎｕｓａｍｂｉｖａｌｅｎｓ中发现的惟一能氧化单质Ｓ的硫加氧还原酶（ｓｕｌｆｕｒｏｘｙｇｅｎａｓｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＳＯＲ）位于细胞质液中，兼具硫的氧化和
还原活性，不需要其他辅助因子的协助，其有氧条
２００７年第１期
张成桂等：嗜酸硫杆菌属硫氧化系统研究进展６３
酶途径中能量产生储靠电子传递来实现，电子经
Ｇａｒｄｎｅｒ和Ｄ．Ｅ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ［３６］在Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ和Ａ．ｃａｌｄｕｓ细胞内和细胞提取物中都检测到了ＴＳＴ活
性，然而，在能氧化亚铁而不能氧化含硫化合物的细菌Ｌ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ中没有检测到有ＴＳＴ活性。Ａ．
ＳＯＲ传递给细胞色素ｃ，最后由细胞色素氧化酶接
受。至今还没有关于亚硫酸盐氧化和细胞色ｂ、辅酶Ｑ相偶联的证据［３３］。
４Ｓ２Ｏ３２－的氧化
硫代硫酸盐在氧化生成硫酸的途径中，可能涉
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ在以黄铁矿和Ｓ为基质的酸性环境中
生长时有Ｓ２Ｏ３２－的生成，而且Ｓ２Ｏ３２－是黄铁矿中硫元素生物浸出的主要中间物质［５］。Ｐ．Ｒａｍíｒｅｚ等［３７］研究发现Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ在黄铁矿和Ｓ基质中生长时，细胞体内有一种类ＴＳＴ蛋白高度表达，在Ｆｅ２＋基质中生长时，该蛋白质只是微量表达。Ｐ．Ｒａｍíｒｅｚ等［３８］在进一步对比Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ在Ｓ和Ｆｅ２＋基质中生长时细胞体内的蛋白质表达差异时发现，在Ｓ基质中生长的细胞体内有几种蛋白质被诱导表达，包括一种外膜蛋白，一种类ＴＳＴ蛋白，一种类
及到的酶系蛋白包括硫代硫酸盐－辅酶Ｑ氧化还原酶、硫代硫酸盐硫转移酶、硫代硫酸盐脱氢酶和连四硫酸盐水解酶等。目前硫杆菌中Ｓ２Ｏ３２－的氧化途径仍十分不清晰，其中至今还未解决的核心问题是硫代硫酸盐在酶的作用下氧化成硫酸盐的过程中，是否有中间产物ＳＯ３２－存在。
Ｓ２Ｏ３２－的氧化酶系蛋白的研究
人们对Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ硫氧化酶系统进行了较深入的研究，发现Ｓ２Ｏ３２－共价结合在酶上，直接氧化成ＳＯ４２－，催化反应过程中没有其它中间产物的生成，释放的电子经过辅酶Ｑ或细胞色素ｃ传递给末端氧化酶。人们称这种Ｓ２Ｏ３２－直接氧化途径为ＰＳＯ（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓｓｕｌｆｕｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）途径。嗜酸硫杆菌Ｓ２Ｏ３２－氧化途径与此直接氧化途径不同，而是遵循
连四硫酸盐中间物途径［３４］。
从古生菌Ａ．ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ中分离的膜结合硫代硫酸盐－辅酶Ｑ氧化还原酶（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ：ｑｕｉｎｏｎｅ
４．１
Ｓ２Ｏ３２－／ＳＯ４２－结合蛋白，一种类微囊多聚糖运输蛋白
以及其它几种功能未知蛋白，其中类ＴＳＴ蛋白，类
Ｓ２Ｏ３２－／ＳＯ４２－结合蛋白的出现显然是和硫的氧化代
谢相关。
Ｋ．Ｎａｋａｍｕｒａ等［错误！
未定义书签。］
从Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ
ＪＣＭ７８１４分离纯化到了硫代硫酸盐脱氢酶
（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ），该酶属单体结构，含有血红素ｃ，分子量为２７．９ＫＤａ，位于细胞周质，最适
ｐＨ为３．５。这与早期Ｍ．Ｓｉｌｖｅｒ等
［３９］
从Ａ．
ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＴＱＯ）在铁氰化物和癸基－泛醌为电
子受体时能氧化Ｓ２Ｏ３２－成为Ｓ４Ｏ６２－。ＴＱＯ含有两个由含双顺反子的ｄｏｘＤＡ操纵子编码而来的亚基ＤｏｘＡ和ＤｏｘＤ（２８ＫＤａ和１６ＫＤａ）。二级结构预测ＤｏｘＤ含有五个跨膜螺旋，ＤｏｘＡ含有一个跨膜螺旋。ＴＱＯ活性能被巯基结合试剂（如乙基马来酰亚胺和在Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ中没有与古生菌Ａ．Ｚｎ２＋）所抑制。
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ分离到的硫代硫酸盐脱氢酶性质相似。
但与Ｊ．Ｍ．Ｖｉｓｓｅｒ等［４０］从Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．Ｗ５（实为
Ａ．ｓｐ．Ｗ５）中分离到的硫代硫酸盐脱氢酶组成不
同，后者含有两个亚基，分子量分别为３３ＫＤａ和
２７Ｋｄａ，含有细胞色素ｃ，而不是血红素ｃ。
４．２连四硫酸盐水解
很多嗜酸硫杆菌在利用硫代硫酸盐的过程中
ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ中ｓｏｒ同源相似的基因，但有与Ａ．ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ中编码ＴＱＯ的基因相似的双拷贝ｄｏｘＤＡ基因。ｄｏｘＤＡ在嗜酸硫杆菌Ｓ２Ｏ３２－氧化中的
作用机制虽然还不清楚，推测ｄｏｘＤＡ基因编码的产物在嗜酸硫杆菌硫氧化过程中可能起到十分重要的作用。
产生连四硫酸盐及其它连多硫酸盐。Ｒ．Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ等［４１］发现连四硫酸盐水解酶在细胞内的浓度足够催化硫氧化过程中产生的连四硫酸盐，认为连四硫酸盐水解酶是硫氧化系统中硫代硫酸盐氧化为硫酸盐的关键酶。已经证明在Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａ．
ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ和Ａ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ中连四硫酸盐水解酶
４５］
参与了硫的氧化反应过程［２２，４２～。
Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ在Ｓ基质生长时有硫氰酸酶
（ｒｈｏｄａｎｅｓｅ）表达。硫氰酸酶是一种硫代硫酸盐硫转移酶（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅｔｈｉｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＴＳＴ），
专门打断
有关嗜酸硫杆菌连四硫酸盐水解酶作用模式的报导先后不尽一致。例如，Ｒ．Ｓｔｅｕｄｅｌ等［４６］于１９８７年针对Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ（实为Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）
Ｓ２Ｏ３２－中的Ｓ－Ｓ化学键，产生Ｓ和ＳＯ３２－［３５］。Ｍ．Ｎ．
６４生物技术通报ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＢｕｌｌｅｔｉｎ
２００７年第１期
提出了连四硫酸盐水解酶作用模式，他们发现水解的主要产物为ＨＳ２ＳＯ３－和ＳＯ４－，其中，ＨＳ２ＳＯ３－不稳定，但可能在硫原子形成长环状Ｓ８过程中发挥关键作用。Ｒ．Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ等
［４５］
于１９９２年针对
Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ（实为Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）发
现连四硫酸盐水解酶水解的产物为Ｓ２Ｏ３２－，ＳＯ４２－，Ｓ和
Ｈ＋。Ｔ．Ｓｕｇｉｏ等［４７］于１９９６年针对Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓＦｕｎｉｓ２－１则发现水解产物为Ｓ２Ｏ３２－，ＳＯ４２－和Ｈ＋，并没有检测
到单质Ｓ的存在。Ｚ．Ｂｕｇａｙｔｓｏｖａ等［４８］对从Ａ．ｃａｌｄｕｓ中分离到的连四硫酸盐水解酶进行了Ｎ末端氨基酸测序，基因比对发现Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓＡＴＣＣ２３２７０基因组中没有与之同源的序列。这些水解产物的不同，说明不同菌株的连四硫酸盐水解酶结构与功能可能不同。
但不管按怎样的方式水解或水解产物是什么，除了从Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓＦｕｎｉｓ２－１分离到的连四硫酸盐水解酶是单体形式的细胞膜结合蛋白外［４８］，从上述Ａ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ，Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ和Ａ．ｔｈｉｏｏｘｉｄａｎｓ中分离到的连四硫酸盐水解酶都是二聚体形式的细胞周质蛋白，最适ｐＨ值都接近３。
图３
Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ硫氧化系统模式图
其中Ａ：硫双加氧酶，Ｂ：硫代硫酸盐－硫转移酶，Ｃ：连四硫酸盐水解酶，Ｄ：亚硫酸受体氧化还原酶，Ｅ：硫代硫酸盐脱氢酶
量代谢机制方面的研究正在广泛地开展。相对于铁氧化系统，硫氧化系统的研究更加复杂，还有许多悬而未决的问题。例如，是否有细胞外膜结合酶蛋白参与各种含硫化合物的催化氧化；单质Ｓ及其它代谢中间产物的转运蛋白的剖析；各种含硫化合物在酶系统作用下的酶催化机制的阐述；硫氧化系统中一些关键酶的分离和基因的鉴定；硫的氧化与
５硫氧化系统的可能模式
纵上所述，硫化矿的酸溶解和化学氧化过程
ＮＡＤ＋的还原相偶连的反应是否存在等。所有这些
问题的解决，将最终使硫氧化系统模型得以完善和甚至进一步修正。
参考文献
中，伴随着硫原子转变成多聚硫Ｓ８或硫代硫酸盐的过程。根据上述的研究结果，总结嗜酸硫氧化细菌氧化对元素硫的氧化过程，胞外环状多聚硫Ｓ８可能通过细胞外膜蛋白的巯基活化成线状－ＳｎＨ后，被转运到细胞周质区域，进而被硫加双氧酶氧化成ＳＯ３２－，活化过程中同时生成少量
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Ｈ２Ｓ，胞外硫代硫酸盐通过未知途径进入细胞周
质。细胞周质中的ＳＯ３２－主要经由亚硫酸－受体氧化还原酶氧化成ＳＯ
２－
４
，Ｓ２Ｏ２－３
可能经由硫代硫酸
盐－辅酶Ｑ氧化还原酶、硫代硫酸盐脱氢酶、硫代硫酸盐硫转移酶、连四硫酸盐水解酶等氧化为硫酸，少量Ｈ２Ｓ则经由硫化物－辅酶Ｑ氧化还原酶氧化为多聚硫，后者再经由ＳＯ３２－和Ｓ２Ｏ３２－氧化生成最后产物ＳＯ４２－。根据这些基本事实和推测，我们就Ａ．ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ硫氧化系统提出一个如图
３所示的粗略模式。
６结语
目前，关于嗜酸硫杆菌属硫氧化系统遗传及能
２００７年第１期
１９８９，９７３：２５０～２５６．１２１３１４１５１６１７１８１９２０２１２２２３２４２５２６２７２８２９３０
张成桂等：嗜酸硫杆菌属硫氧化系统研究进展
３１３２３３３４３５
６５
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ＬｕＷＰ，ＤＰＫｅｌｌｙ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９８４，７６５：１０６～１１７．（１）：ＭｏｒｉａｒｔｙＤＪ，ＮｉｃｈｏｌａｓＤＪ．ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，１９７０，２１６
１３０～１３８．
ＶｅｓｔａｌＪＲ，ＬｕｎｄｇｒｅｎＤＧ．ＣａｎａｄｉａｎＪＢｉｏｃｈｅｍ，１９７１，４９（１０）：１１２５～１１３０．
ＳｕｇｉｏＴ，ＴＫａｔａｇｉｒｉ，ＭＭｏｒｉｙａｍａ，ＹＬＺｈｅｎ，ＫＩｎａｇａｋｉ，Ｔ．Ｔａｎｏ．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８８，５４：１５３～１５７．