What's new in tuberculosis diagnosis
结核病的疫情急需快速有效的诊断方法，但长久以来，结核病的诊断一直依靠传统的结核杆菌抗酸染色涂片和培养技术。但前者的灵敏度较差，部分患者无法提供标本。而后者耗时较长，并不能满足结核快速诊断的需要。近年来，新的结核病诊断技术和方法逐渐出现，为结核病诊断提供了新的思路。
目前结核病诊断方法分为如下几类：
在本篇公众号中，我们将为大家介绍这其中较为具有代表性的技术。部分技术已经获得了WHO的推荐，部分技术则正在进行大规模临床研究或验证。我们将对每项技术逐一讨论，阐述近年来结核病诊断新的发展方向。
结核分枝杆菌的培养技术
结核分枝杆菌的培养仍然是结核菌检测和药敏试验（DST）的金标准。但传统的罗氏培养法耗时较长，约为4-6周，不能满足快速诊断的需要。液体培养系统如BACTEC和MGIT （BD Diagnostics, Sparks, Maryland, USA）提供了较传统固体培养更为敏感和快速的方法，1-3周即可检测到分枝杆菌的生长。 分枝杆菌生长指示管法 分枝杆菌生长指示管法（mycobacterial growth indicator tube, MGIT）在管底含有荧光复合物，该荧光复合物可被氧气淬灭。当分枝杆菌生长时，管内氧气逐渐被消耗即可探测到管底的荧光复合物。
图1：BD BACTEC? MGIT? 系统
优点
1． 检测不到8天即可显示结果。2． 可对链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇进行药敏检测。3. WHO和结核战略技术顾问组推荐在有条件的地区逐步启用液体培养，包括低收入国家。 TK SLC L?结核杆菌快速培养系统 TK SLC L?结核杆菌快速培养系统也是一种改良的液体培养方法，通过液体培养基颜色的改变（红色变为黄色）可以检测到结核杆菌的早期扩增，并且可以区分真菌和其它革兰阴性杆菌的污染。TK SLC L?液体培养基在结核病诊断中的应用目前还在进一步评估和验证。
图2：标准的TK培养基为红色（如左管），当检测到结核分枝杆菌感染后将变为黄色（如中管），若污染可变为绿色（如右管）。
优点
1． TK SLC L?将报告时间缩短3-5天。
2． TK SLC L?污染的几率较少。
分子诊断技术
Gene Xpert? MTB/RIF 结核杆菌的分子诊断技术近几年出现了突破，其标志就是以Xpert技术为代表的盒式诊断技术的出现。Xpert MTB/RIF 检测试剂盒为美国Cepheid公司开发的，适用于GeneXpert仪器，可以在2小时内直接时间从病人新鲜痰液或冻存痰液中检测是否还有结核分枝杆菌及对利福平的耐药性，整个过程都在一密闭环境中进行，手动操作时间不超过5分钟，对操作者和周围环境安全，全程约2h即获得结果。
图3：美国Cepheid Gene Xpert? MTB/RIF试剂盒
Xpert MTB/RIF以半巢式实时定量PCR扩增技术为基础，能够自动抽提DNA并且扩增rpoB基因。由于95%以上的利福平耐药菌株都有rpoB基因变异，所以扩增rpoB基因同时可以鉴定是否为利福平耐药菌株。由于大部分利福平耐药的菌株同时对异烟肼耐药，所以rpoB基因的检测又可以在一定程度上判断是否为多耐药菌株（MDR-TB）。
图4：Xpert MTB/RIF 检测试剂包含3 对特异性引物，5个探针， 检测rpoB gene。
2010年新英格兰杂志公布了一项多中心的研究结果，研究结果表明，以培养为参考标准，Xpert MTB/RIF的灵敏度为92.2%，特异度为99.2%。近年来，Xpert MTB/RIF技术已在多个国家和地区完成了诊断效果的研究和评估，其诊断疑似结核感染的敏感性为88% (95% CI 83%-92%)，特异性为98% (95% CI 97%-99%) 。
图5：Xpert MTB/RIF 检测流程图
2010年12月，WHO首次发布官方文件推荐Xpert MTB/RIF技术的使用。随后截止至2014年3月，共有104个人国家，超过2300台GeneXpert检测仪器和超过600万个Xpert MTB/RIF的标本收集盒被采购。
图6：截止到2014年末，GeneXpert已累积生产了17,883组模块和10,013,600组标本盒，销往145个国家和地区。
2013年，WHO又再次发文更新了对XpertMTB/RIF的推荐意见： 当成人和儿童患者怀疑MDR-TB感染或合并HIV感染时，强烈推荐Xpert MTB/RIF作为首选检测方法，从而替代传统的涂片镜检，培养和药物试验的方法。 对疑似肺外结核患者的肺外标本如脑脊液，淋巴结和其它组织，推荐Xpert MTB/RIF作为检测方法。 对于痰涂片检测阴性的患者，推荐Xpert MTB/RIF作为后续检测方法。
环介导的等温扩增技术 环介导的等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是一种快速、简便并且有效的DNA扩增方法。TB-LAMP技术采用结核杆菌特异性的引物，其结果采用荧光发光的可视化检测，对DNA的扩增不需要热循环仪器。
图7：TB-LAMP技术流程示意图。
TB-LAMP技术采用结核杆菌特异性的引物，其结果采用荧光发光的可视化检测，实验全过程采用全封闭系统，从而减少工作场所DNA的污染，来保证检测的准确性。
图8：荧光发光检测后，管1，2，7，8为阴性，管3，4，5，6为阳性。
目前TB-LAMP技术在FIND基金资助下正在开展大规模的临床研究，在14个国家或进行，并与LED microscopy 和Xpert MTB/RIF方法进行了头对头的比较，其中在冈比亚的研究结果以于2015年12月发表，证实TB-LAMP诊断结核病总体的敏感性为99%，特异性为94%。
图9：FIND基金资助下正在开展大规模的临床研究。
显微镜学诊断技术
Ziehl-Neelsen染色法 石炭酸复红抗酸染色涂片即为传统的Ziehl－Neelsen染色法，金胺-罗丹明染色也是临床中重要的结核杆菌检测方法。两种方法确诊肺结核的特异性高，快速简便，为WHO推荐的作为检测结核杆菌的广泛使用的方法。 LED荧光显微镜 LED荧光显微镜结合了LED光源与荧光显微镜，使用寿命长，价格相对于荧光显微镜更加低廉。WHO于2011年发表官方文件推荐LED显微镜逐步取代传统的荧光显微镜，并可以作为以Ziehl-Neelsen染色为基础的传统光学显微镜检测的替代方法。 全自动化读片系统TBDx系统 TBDx系统是建立在荧光染色基础上的全自动化读片系统，荧光染色后的涂片标本可以放入TBDx系统，系统会自动读取并报告检验结果，每小时能处理10-12张，其诊断准确性与专业人员判断的结果无明显差异。
图10：TBDX由三部分构成，左上为Automated Slide Sorter, 右上为Microscope, 左下为DigitalCamera and Computer System。
免疫学诊断技术
以细胞免疫反应为基础的γ干扰素释放试验如T-SPOT与QuantiFERON-TB Gold检测近年来获得了较快的发展被并广泛应用。但上述仍存在一定问题：诊断的敏感性仍有待提高，会出现无法判定结果的情况；无法区分活动性结核病和潜伏性结核感染；无法预测潜伏性感染者的活动风险等。新型试剂盒通过增加新的诊断抗原，诊断标志物等对该技术进行了改进。
图11：IFN-γ释放实验（Interferon-γ release assay,IGRA)检测的是结核杆菌抗原特异性记忆性T细胞，无法区分活动性结核和潜伏性结核感染 QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT?-Plus) Qiagen公司2015年底公布了新一代结核诊断试剂盒QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT?-Plus) 。QFT?-Plus包含有四根采血管，管壁上分别包被有阳性对照、阴性对照和两个结核特异性抗原。与上一代产品相比较，新产品宣称第一次加入了CD8 T细胞应答的数据，可以对潜伏感染发展为活动的风险进行评估，并较现有IGRAs具有更高的敏感性（95.3%）和更高的特异性（97.6%）。目前，新一代试剂盒已获得欧盟市场认证（CE-IVD），但尚未通过美国FDA认证。
图12：QFT?-Plus包含四根采血管：阴性对照管，阳性对照管，TB抗原管1，TB抗原管2。 Determine TB LAM Ag 免疫检测试纸条 Determine TB LAM Ag（Alere, Waltham, MA, USA）免疫检测试纸条原理是以体液免疫反应为基础，从而监测尿液标本中的LAM（脂阿拉伯甘露聚糖）抗原。LAM是分枝杆菌细胞壁的组成成分，能够被肾小球滤过并能够在尿液中被检测出来，因而已被广泛用于结核感染的诊断抗原。检测时，直接将试剂条插入尿液标本，若检测到LAM抗原，则在试纸条上出现条带。整个操作过程非常简便。
图13：上图为TB-LAM的三根试纸条。试纸条上端白色区域若出现红色的条带为阳性对照，在三根试纸条中均可看到。而下端白色区域若出现红色的条带，则为抗原阳性。中间及右侧的试纸条均为阳性结果，左侧试纸条为阴性结果。
另一项在南非的描述性研究表明：Determine TB-LAM检测在CD4细胞计数低的人群中具有较高的敏感性，在CD4细胞计数
优点
1． 操作快速，检测全过程仅需25min。2. 费用低廉。3. 肺内和肺外结核均可检测。
4． 在HIV感染的CD4细胞计数低的人群中具有较高的敏感性，可以作为对现有诊断方法的补充，与痰涂片方法联合，具有较高的诊断敏感性。但该技术在免疫功能正常的人群中的检测效能需进一步评估。
影像学及计算机辅助技术
胸片检查目前仍旧被WHO推荐用于结核疑似病人的筛查，特别是在低收入和条件受限制的地区。但近年来，新的影像学检查技术的诞生也进一步推动了结核影像学的发展。 数字化胸片（DR）及计算机辅助图像分析系统 这种软件由挪威的Radboud大学工作人员开发，称为CAD4TB系统，目前已经发展到第四代。 CAD4TB为全自动的检测系统，主要工作流程是对胸片图像中的可疑病灶进行搜索，包括肺部阴影，肺形畸变和空洞等，然后与数据库中的图像进行比对和计算，最终得到是否肺结核的诊断。
图1：左图为常规胸片检查，可见右上肺有一个病灶。右图为通过CAD4TB系统对胸片进行数字化分析，从而发现病灶。
优点
1. 自动对图像进行分析，1分钟之内就能获得诊断结果。 2. 与人工读片相比较未见明显差异。 3. 可建立移动式检查站点。 4. 不需要专业人员，减少筛查成本。
总结
全球结核病的疫情急需快速简便的结核病免疫诊断技术，目前已有多种有潜力的新诊断方法获得了开发并进行了广泛的评估，其中有些检测方法如Xpert已经通过WHO的评估并获得了推荐，更多的方法已经在进行临床试验和评价。相信在不久的将来，新技术的应用将会使我们更快更迅速的发现结核感染，从而进一步为预防和治疗服务。
参考文献
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编辑：Jingwen
审阅：王森，孙峰
专家审核：金嘉琳教授
华山感染