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65食品微生物学检验乳酸菌检验

09/28

中华人民共和国国家标准

GB 4789.35—2010

食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验

National food safety standard Food microbiological examination: Lactic acid bacteria

2010-03-26 发布

2010-06-01 实施 发布

中华人民共和国卫生部

GB 4789.35—2010

本标准代替GB/T 4789.35-2008《食品卫生微生物学检验 本标准与GB/T 4789.35-2008相比,主要变化如下:

食品中乳酸菌检验》。

——修改了乳酸菌总数、乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌的计数方法。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: —— GB 4789.35-1996、GB/T 4789.35-2003、GB/T 4789.35-2008。

I

GB 4789.35—2010

食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验

1 范围 本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(lactic acid bacteria)的检验方法。 本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅所注日期的版本 适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。 3 3.1 术语和定义 乳酸菌 lactic acid bacteria

一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(Lactobacillus) 、 双歧杆菌属(Bifidobacterium)和链球菌属(Streptococcus) 。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 5 5.1 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 冰箱:2 ℃~5 ℃。 均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。 天平:感量 0.1 g。 无菌试管:18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶:500 mL、250 mL。 培养基和试剂 MRS(Man Rogosa Sharpe)培养基及莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良 MRS 培养基:见附录 A

中 A.1。 5.2 5.3 MC 培养基(Modified Chalmers 培养基):见附录 A 中 A.2。 0.5 %蔗糖发酵管:见附录 A 中 A.3。

1

GB 4789.35—2010 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 0.5 %纤维二糖发酵管:见附录 A 中 A.3。 0.5 %麦芽糖发酵管:见附录 A 中 A.3。 0.5 %甘露醇发酵管:见附录 A 中 A.3。 0.5 %水杨苷发酵管:见附录A中A.3。 0.5 %山梨醇发酵管:见附录A中A.3。 0.5 %乳糖发酵管:见附录A中A.3。

5.10 七叶苷发酵管:见附录A中A.4。 5.11 革兰氏染色液:见附录A中A.5。 5.12 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin):化学纯。

2

GB 4789.35—2010 6 检验程序 乳酸菌检验程序见图1。

样品 25 g(mL)+225 mL 无菌生理盐水

10 倍系列稀释

选择 2 个~3 个适宜稀释度, 各以 0.1 mL 加入到 MRS 平板 进行涂布 厌氧, 36 ℃±1 ℃, 48

h±2 h 乳酸菌总数计数

选择 2 个~3 个适宜稀释度,各以 0.1 mL 加入到莫匹罗星锂盐 (Li-Mupirocin)改良 MRS 平板进行涂布 厌氧, 36 ℃±1 ℃, 48 h±2 h 双歧杆菌计数

选择 2 个~3 个适宜稀释度, 各以 0.1 mL 加入到 MC 平板 进行涂布 需氧, 36 ℃±1 ℃, 48 h±2 h 嗜热链球菌计数 乳杆菌计数 乳酸菌总数减去双歧杆菌 与嗜热链球菌计数之和

挑取双歧杆菌或乳杆菌菌落接种于 MRS 琼脂平板, 嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板(可选做)

菌种鉴定

报告

图1 7 操作步骤

乳酸菌检验程序图

7.1 样品制备 7.1.1 7.1.2 样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。 冷冻样品可先使其在 2 ℃~5 ℃条件下解冻,时间不超过 18 h,也可在温度不超过 45 ℃的条件

解冻,时间不超过 15 min。

3

GB 4789.35—2010 7.1.3 固体和半固体食品:以无菌操作称取 25 g 样品,置于装有 225 mL 生理盐水的无菌均质杯内, 于 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,制成 1:10 样品匀液;或置于 225 mL 生理盐水的无菌均 质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min 制成 1:10 的样品匀液。 7.1.4 液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品 25 mL 放入装有 225 mL 生理盐 水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成 1:10 的样品匀液。 7.2 步骤 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓慢注于装有 9 mL 生理盐水

7.2.1

的无菌试管中 (注意吸管尖端不要触及稀释液) 振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀, , 制成 1:100 的样品匀液。 7.2.2 7.2.3 另取 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做 10 倍递增样品匀液,每递增稀释 乳酸菌计数 乳酸菌总数 一次,即换用 1 次 1 mL 灭菌吸管或吸头。 7.2.3.1

根据待检样品活菌总数的估计,选择 2 个~3 个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取 0.1 mL 样品 匀液分别置于 2 个 MRS 琼脂平板,使用 L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃,厌氧培养 48 h±2 h 后计数平 板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在 15min 内完成。 7.2.3.2 双歧杆菌计数 根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择 2 个~3 个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液于莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良 MRS 琼脂平板,使用灭菌 L 形棒进行表面涂布,每个 稀释度作两个平板。36℃±1℃,厌氧培养 48 h±2 h 后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释到平板涂 布要求在 15 min 内完成。 7.2.3.3 嗜热链球菌计数 根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计, 选择 2 个~3 个连续的适宜稀释度, 每个稀释度吸取 0.1 mL 样品匀液分别置于 2

个 MC 琼脂平板,使用 L 形棒进行表面涂布。36℃±1℃,需氧培养 48 h±2 h 后计 数。 嗜热链球菌在 MC 琼脂平板上的菌落特征为: 菌落中等偏小, 边缘整齐光滑的红色菌落, 直径 2 mm±1 mm,菌落背面为粉红色。从样品稀释到平板涂布要求在 15 min 内完成。 7.2.3.4 菌计数。 7.3 菌落计数 可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落 形成单位(colony-forming units,CFU)表示。 7.3.1 均数。 7.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释 度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以 2,代表一个平板菌落数。 7.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。

4

乳杆菌计数

7.2.3.1 项乳酸菌总数结果减去7.2.3.2 项双歧杆菌与7.2.3.3 项嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆

选取菌落数在 30 CFU~300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的

平板记录具体菌落数,大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平

GB 4789.35—2010 7.4 7.4.1 7.4.2 结果的表述 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按公式(1)计算:

均值乘以相应稀释倍数,作为每 g(mL)中菌落总数结果。

N =∑

式中: N——样品中菌落数;

C

( n1 + 0.1n2 ) d …………………………………………(1)

∑C——平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和; n1——第一稀释度(低稀释倍数)平板个数; n2——第二稀释度(高稀释倍数)平板个数; d——稀释因子(第一稀释度) 。 7.4.3 7.4.4 算。 7.4.5 7.4.6 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU~300 CFU 之间, 其中一部分小于 30 CFU 或大于 300 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30 CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计 记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

CFU 时,则以最接近 30 CFU 或 300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.5 7.5.1 7.5.2 7.5.3 8 菌落数的报告 菌落数小于 100 CFU 时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。 菌落数大于或等于 100 CFU 时,第 3 位数字采用“四舍五入”原则修约后,取

前 2 位数字,后 称重取样以 CFU/g 为单位报告,体积取样以 CFU/mL 为单位报告。

面用 0 代替位数;也可用 10 的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。

结果与报告 根据菌落计数结果出具报告,报告单位以CFU/g(mL)表示。

9 9.1

乳酸菌的鉴定(可选做) 纯培养 挑取 3 个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于 MC 琼脂平板,乳杆菌属接种于 MRS 琼脂平板,置

36 ℃±1 ℃厌氧培养 48 h。 9.2 鉴定 双歧杆菌的鉴定按 GB/T 4789.34 的规定操作。 涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。无芽胞,革兰氏染色阳性。 乳酸菌菌种主要生化反应见表 1 和表 2。

9.2.1 9.2.2 9.2.3

成对或成链排列, 无芽胞, 革兰氏染色阳性。 嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状, 直径为 0.5 μm~2.0 μm,

5

GB 4789.35—2010

表1

常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应

七 叶 苷 纤 维 二 糖 麦 芽 糖 甘 露 醇 水 杨 苷 山 梨 醇 蔗 糖 棉 子 糖

菌 种 干酪乳杆菌干酪亚种(L.casei subsp. casei) 德氏乳杆菌保加利亚种(L.delbrueckii subsp. bulgaricus) 嗜酸乳杆菌(L.acidophilus) 罗伊氏乳杆菌(L.reuteri) 鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus) 植物乳杆菌(L.plantarum) + - +

+ - + - + +

+ - + + + +

+ - - - + +

+ - + - + +

+ - - - + +

+ - + + + +

- - d + - +

ND + +

注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%菌株阳性;ND表示未测定。

表2

菌种 嗜热链球菌(S.thermophilus) 菊糖 -

嗜热链球菌的主要生化反应

乳糖 + 甘露醇 - 水杨苷 - 山梨醇 - 马尿酸 - 七叶苷 -

注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性。

6

GB 4789.35—2010 附录 A (规范性附录) 培养基及试剂 A.1 A.1.1 MRS 培养基 成分

蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温 80 1.0 mL K2HPO4·7H2O 2.0 g 醋酸钠·3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO4·7H2O 0.2 g MnSO4·4H2O 0.05 g 琼脂粉 15.0 g pH 6.2 A.1.2 制法 将上述成分加入到 1000 mL 蒸馏水中, 加热溶解, 调节 pH, 分装后 121 ℃高压灭菌 15 min~20 min。 A.1.3 A.1.3.1 A.1.3.2 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)改良 MRS 培养基 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)储备液制备:称取 50mg 莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)加入 制法

到 50 mL 蒸馏水中,用 0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌。 将 A.1.1 成分加入到 950 mL 蒸馏水中,加热溶解,调节 pH,分装后于 121 ℃高压灭菌 15 min~ 20 min。临用时加热熔化琼脂,在水浴中冷至 48 ℃,用带有 0.22 μm 微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂 盐(Li-Mupirocin)储备液加入到熔化琼脂中,使培养基

中莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)的浓度为 50 μg/mL。 A.2 A.2.1 MC 培养基 成分 大豆蛋白胨 牛肉粉 酵母粉 葡萄糖 乳糖 碳酸钙 琼脂 蒸馏水 1%中性红溶液 pH6.0 5.0 g 3.0 g 3.0 g 20.0 g 20.0 g 10.0 g 15.0 g 1 000 mL 5.0 mL

7

GB 4789.35—2010 A.2.2 制法 将前面 7 种成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节 pH,加入中性红溶液。分装后 121 ℃高压灭菌 15 min~20 min。 A.3 A.3.1 乳酸杆菌糖发酵管

基础成分 牛肉膏 5.0 g 蛋白胨 5.0 g 酵母浸膏 5.0 g 吐温 80 0.5 mL 琼脂 1.5 g 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4 mL 蒸馏水 1 000 mL A.3.2 制法 按 0.5%加入所需糖类,并分装小试管,121 ℃高压灭菌 15 min~20 min。

A.4 七叶苷培养基 A.4.1 成分 蛋白胨 磷酸氢二钾 七叶苷 枸橼酸铁 1.6%溴甲酚紫酒精溶液 蒸馏水 A.4.2 制法

5.0 g 1.0 g 3.0 g 0.5 g 1.4 mL 100 mL

将上述成分加入蒸馏水中,加热溶解,121 ℃高压灭菌 15 min~20 min。 A.5 革兰氏染色液 A.5.1 结晶紫染色液 A.5.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95%乙醇 20 mL 1%草酸铵水溶液 80 mL A.5.1.2 制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。 A.5.2 革兰氏碘液 A.5.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.5.2.2 制法 将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300 mL。 A.5.3 沙黄复染液

8

GB 4789.35—2010 A.5.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95%乙醇 10 mL 蒸馏水 90 mL A.5.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。 A.5.4 染色法 A.5.4.1 将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染 1 min,水洗。 A.5.4.2 滴加革兰氏碘液,作用 1 min,水洗。 A.5.4.3 滴加 95 %乙醇脱色,约 15 s~30 s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。 A.5.4.4 滴加复染液,复染1 min。水洗、待干、镜检。

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