兽医微生物实验教案
实验一 显微镜油浸系的使用及细菌基本
形态构造的观察
【目的要求】
1.掌握正确使用及护理显微镜的方法，特别是油浸系的使用及护理。
2.正确认识细菌的基本形态和构造。
【油浸系的原理】
油浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”(Oil Immersion)或HI(homogenmus Immersion)表示。而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。其使用原理是由于香柏油与玻璃的折光率相似(香柏油为1.515，玻璃为1.52)。镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气(折光率为1.O)而散失，因而能提高物镜的分辨率， 使物像明亮清晰。
【器材及试剂】
1.菌种：大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、细菌的三型等标本片 ；
2.仪器：普通光学显微镜；
3.材料：香柏油，二甲苯，擦镜纸等。
【操作步骤】
(一)细菌基本形态构造的观察
1.准备 安置显微镜→调节光源→调节双筒目镜间距→调节聚光器数值孔径值。
将光圈完全开放，升高聚光镜与载物台同高，置标本片于载物台上，在低倍镜下对光，用于转动反光镜以调节之，至视野最亮时为止。若用天然光源宜用反光镜平面，较弱光源用凹面。检查未染色标本，光不宜太强，染色标本需强光。光线强弱可通过放大或缩小光圈、升降聚光镜、旋转反光镜调节之。
2.观察 将香柏油一滴滴于标本片有颜色的观察区，并置于载物台上，用片夹固定好，用推进器将观察区置于物镜正下方，依次用高倍镜→油镜观察。用油浸镜检查，使油镜头浸入油滴中，几乎与标本面接触为度。然后由接目镜注视镜内，同时慢慢转动粗调节螺旋提起镜筒(绝对不能下降镜筒)至能模糊看到物像时，再转动细螺旋(细螺旋转动一般不超过1周)，直至物像清晰为止。包括大肠杆菌、葡萄球菌的形态及炭疽芽孢、巴氏杆菌荚膜和大肠杆菌的鞭毛等细菌的特殊结构。
(二)显微镜的养护
1.上升镜筒，取下载玻片。
2.用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二
甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。 切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。
3.用擦镜纸清洁其他物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。
4.将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。
作业
一． 名词解释
细菌 荚膜 芽孢 油浸系
二． 问答题
1. 绘制葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌荚膜及芽孢等形态及排列方式；
2. 使用油镜时应注意哪些问题？加香柏油前载片上可否有水，为什么？
3. 细菌有哪些基本形态，各有哪些特征？
实验二 细菌抹片的制备及染色
【目的要求】
(1)掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。
(2)认识革兰氏染色的反应特性。
【基本原理】
1. 简单染色法 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法， 一般用于观察个体形态与细菌排列。 由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、 结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使 菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
2.革兰氏染色液 G—菌:细胞壁中含有较多类脂质，肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。G+菌:细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的颜色。
【器材及试剂】
1.菌种：培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌斜面菌种 ；
2.仪器：普通光学显微镜；
3.材料：载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等；
4.染料：美兰染色液、草酸铵结晶紫染色液，革兰氏碘液，95%乙醇，0.5%石炭酸复红染色液。
【操作步骤】
(一)载玻片处理
载玻片应清晰透明，清洁而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，如有残余油渍，可按下列方法处理。
1．滴上95%酒精2-3滴，用清洁纱布擦拭，然后以钟摆速度通过酒精灯焰3-4次。
2．若上法仍未能除去油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。
玻片洁净后，用玻璃铅笔在预涂材料处的背面划一个直径1.5cm的圆圈，用以标记。
（二）涂片方法
1．菌落涂片方法 涂片时，左手握菌种管，右手持接种环（又称铂金耳）取1-2环生理盐水，置于载玻片上，然后将接种环在火焰上灭菌。待冷后，从菌种管内取少许菌落，置于生理盐水中混匀，涂成直径1.5cm的涂膜，此膜应既薄又均匀为好，待于即成。
2．菌液涂片法 用灭菌接种环蘸取菌液（液体培养物、血清、乳汁、组织渗出液等）1-2接种环，均匀涂抹在载玻片上，使成直径为1.5cm左右圆形或椭圆形涂膜，自然干燥后备用。
3．血液涂片方法 先取一张干净无油垢、边缘整齐的载玻片，其一端蘸取少许血液，以450角放在另一张干净无油垢的载玻片一端，从这端向另一端推成薄而均匀的血膜，待干后备用。
4．组织涂片方法 先用镊子夹持组织局部，然后以灭菌剪刀剪取一小块，夹出后以其新鲜切面在载玻片上压印或涂成一薄层。
(三)干燥
涂片最好在室温中自然干燥。必要时，可将标本面向上，在离酒精灯火焰远处烘干，切勿紧靠火焰，以免标本糊焦而不能检查。
(四)固定
有两种固定方法：
1.火焰固定 将已干燥好的抹片，使涂面向上，以钟摆速度通过酒精灯火焰4次，使固定后的标本触及皮肤时，稍感烧烫为度。放置冷却后，进行染色。
2.化学固定 血液、组织脏器等抹片做姬姆萨氏染色或单染色时，不用火焰固定而用甲醇固定。可将己干燥的抹片浸入甲醇中2-3min，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2-3min后，自然挥发干燥。抹片做瑞特氏染色时则不必做特别固定，染色液中含有的甲醇可达到固定目的。
(五)染色方法
1.单染色法 只应用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。
美蓝染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的(足够覆盖抹片点即可)美蓝染色 液，经1-2min，水洗，沥去多余的水分，吸干或烘干(不能太热)，然后镜检。
2.复染色法 应用两种或两种以上的染料或再加助染剂进行染色的方法。染色时，有些是将染料分别先后使用，有些则同时混合使用。染色后不同的细菌和物体或者细菌结构的不同部分，可以呈现不同颜色，有鉴别细菌的作用，又可称为鉴别染色。如革兰氏染色法、抗酸染色法、瑞特氏染色法和姬姆萨氏染色法等。
(1)革兰氏染色法
①在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2min，水洗。 ②加革兰氏碘液于抹片上媒染，1-3min，水洗。
③加95%酒精于抹片上脱色，约30s至1min，水洗。
④加10倍稀释石炭酸复红液复染1-2min，水洗。
⑤吸干或烘干，镜检。革兰氏阳性细菌呈蓝紫色，革兰氏阴性细菌呈红色。 作业
名词解释 无菌 细胞壁 L型细菌
1.革兰氏染色法涂片时为何要涂的薄而均匀，脱色程度要控制得当？
2.叙述革兰氏染色的原理及方法。
3. 简述细菌抹片的制备过程及注意事项。
实验三 培养基的制备
【目的要求】
(1)掌握一般培养基制备的原则和要求。
(2)熟悉一般营养肉汤和普通培养基制备的过程。
(3)了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围；
(4)掌握高压蒸汽灭菌器的使用方法及注意事项。
【原理】
培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基。
【器材及试剂】
1.药品：琼脂，1N NaOH溶液，1N HCl溶液，牛肉膏，蛋白胨，氯化钠；
2.材料：具刻度1000ml塘瓷盅，托盘天平，10×200mm试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，骨匙，pH试纸，分装漏斗，纱布，棉花，报纸，棉绳，标签，蒸馏水，高压锅，电炉。
【操作步骤】
(一)
一般培养基的制备过程
（二）营养肉汤及普通琼脂培养基的制备
1.准确称量牛肉膏1g，NaCl 0.5g，蛋白胨1g，倒于瓷缸中，加适量（约100ml）蒸馏水，加热煮沸(边加热边搅拌)；
2.待充分溶解后，定容至100ml，从中取5ml放入试管中，先用1/10 mol/L NaCl调
PH值至7.2-7.6，计算出所用的1/10 mol/L NaCl的量，并换算出需用1 mol/L NaCl的量，并对剩余的95ml培养基调PH值7.2-7.6；
3.分装3管每管3ml营养肉汤培养基，将所剩余的营养肉汤培养基按2%加入琼脂，加热煮沸（边加热边搅拌）后分装3管每管4ml普通琼脂培养基，最后将所剩余的培养基倒入三角瓶中；
4.包裹，高压灭菌后制备琼脂斜面和普通琼脂平板；
5.无菌检验合格后，备用。
作业
一．相关名词解释
培养基 灭菌 碳源 氮源 生长因子 消毒 固体培养基 半固体培养基 选择培养基 鉴别培养基 加富培养基
二．问答题
1.制备培养基的一般过程是什么？
2.在制备培养基时要注意些什么问题？
3.灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？
4.叙述高压灭菌器的使用方法及注意事项。
实验四 细菌及真菌分离培养及移植
【目的要求】
1.学习、掌握细菌分离培养的基本要领和技术；
2.掌握钓菌、纯培养及移植技术；
3.掌握厌氧菌培养的原理及其方法；
4.熟悉真菌的小培养方法。
【原理】
从混杂的细菌群体中获得只含有一种或某一株细菌的过程称为细菌的分离与纯培养。平板划线法是最常用的方法之一，通过沾有样本的接种环在平板上划线，将样本“稀释”，培养后使之形成单个菌落，从而达到分离的目的。
【器材及试剂】
1. 器材 酒精灯、接种环、恒温箱、记号笔；
2. 培养基 营养肉汤、普通琼脂斜面、普通琼脂平板；
3. 菌种 枯草杆菌、绿脓杆菌及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌混合菌菌种。
【操作步骤】
一、平板划线分离法
1 连续划线法 2 分区划线法 3 划线分离示意图
1.连续划线法 以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线。划线时平板面与接种环面成30-40O角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线。接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置于接种架上。培养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。培养后，在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
2.分区划线法(四分区划线法) 取菌、接种、培养方法与“连续划线法”
相似。
分区划线法划线分离时平板分4个区， 故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好在保持1200左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60-700。灼烧接种环，待在平板边缘上冷却后，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区做第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动60-700，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，倒置于37℃恒温箱中培养24h后，在划线区观察单菌落。
二、细菌的钓菌、纯培养和移植
1.接种环移植法 两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和新鲜空白琼脂斜面各一管，使管口互相并齐，稍上斜，管底握于图实4-15 斜面接种时试管的拿法
手中，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出(图
实4-15)。右手食指和拇指执接种环，烧灼接种环，以右手小指扭开第1管的棉塞，无名指扭开第2管的棉塞。棉塞头向掌心内，将试管口通过酒精灯火焰灭菌，待冷却后将接种环插入菌种管中，钓取细菌少许取出接种环立即接种在新鲜空白琼脂斜面上，不要碰及管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划由曲线或直线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌后，塞好棉塞。接种完毕，将接种环烧灼灭菌后放好。用蜡笔在试管上标明细菌名称和接种日期，置37℃温箱中培养。斜面接种无菌操作过程如图4所示。
三、穿刺培养
明胶穿刺和琼脂柱穿刺方法基本上与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直插入培养基中。要从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。
图4 斜面接种无菌操作过程
作业
一． 名词解释 真菌 菌落 菌苔 抑菌作用 杀菌作用
二． 问答题
1. 在细菌的分离纯化及移植中有哪些注意事项？
2. 什么叫纯培养？
3. 常见的细菌分离培养的方法有哪些，简述其操作过程？
实验五 细菌的分离培养及培养性状的观
察
【目的要求】
1.掌握细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
2.了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
【原理】
将细菌经接种于培养基上,会出现典型的培养特征,所谓培养特征是指微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。细菌培养特征的常规检验包括平皿培养基上的菌落特征；斜面培养基上的菌苔特征；液体培养时的生长特征。菌落是指个体微生物在固体培养基上生长繁殖成的肉眼可见的群落。菌落连成一片形成菌苔。在一定培养条件下，不同的微生物形成的菌落其性状是不相同的，它是鉴别各种微生物的依据之一。
【器材及试剂】
1.器材 放大镜；
2.培养基 枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌及混合菌分别在营养肉汤、普通琼脂斜面、普通琼脂平板培养性状；
3.标本 葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、酵母菌、青霉、毛霉等多种霉菌等制备保存的各培养性状的标本。
【操作步骤】
（一）细菌在固体培养基上的生长表现
1.琼脂平皿上的生长表现 细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼可见的细菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鉴别某种细菌。如葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平干燥、边缘不整齐的火焰状菌落，用放大镜观察时，呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、大小不等的菌落；巴氏杆菌和猪丹毒杆菌，形成细小露珠状菌落。观察菌落的方法除肉眼外，还可用放大镜，必要时也可用低倍显微镜进行检查。观察的主要内容有(图1、2)：
图1 菌落的形状、边缘和表面构造
1.圆形、边缘整齐，表面光滑 2.圆形、叶状边缘，表面有放射状皱褶 3.圆形、边缘整齐，表面有同心圆 4.圆形、锯齿状边缘，表面较不光滑 5.不规则形、波浪状边缘，表面有不规则皱纹 6.圆形、边缘残缺不全，表面呈颗粒状 7.毛状 8.根状
图2 菌落的隆起度
1.扁平状 2.低隆起3.隆起 4.台状 5.脐状 6.纽扣状 7.乳头状 8.褶皱凸面 (1)大小 菌落的大小,规定用毫米(mm)表示，一般不足1mm者为露滴状菌落；1-2mm者为小菌落；2-4mm者为中等大菌落；4-6mm或更大者称为大菌落或巨大菌落。
(2)形状 菌落的外形有圆形、不规则形、根足形、葡萄叶形。
(3)边缘 菌落边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、放射状等。
(4)表面性状 观察其是否平滑、粗糙、皱襞状、漩涡状、荷包蛋状，甚至有子菌落等。
(5)隆起度 表面有隆起、轻度隆起、中央隆起，也有陷凹或堤状者。
(6)颜色及透明度 菌落有无色、灰白色，有的能产生各种色素；菌落是否有光泽；其透明度可分为透明、半透明及石透明。
(7)硬度 粘液状、膜状、干燥或湿润等。
(8)溶血情况 若是鲜血琼脂平皿，应看其是否溶血、溶血情况怎样。
2．琼脂斜面上生长表现(图3) 将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜面上 (自底部向上划一直线)，培养后观察其生长表现。
3．琼脂柱穿刺培养中的生长表现 将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，培养后观察其生长表现(图4)。
(二)细菌在明胶柱穿刺培养中的生长表现
取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱，置22℃温箱中培养后观察其液化与否和液化的情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相同(图5)。
图3 琼脂斜面直线接种培养的菌落表现
1.线状 2.棘状 3.珠状 4.扩散状 5.根状
(三)细菌在液体培养基中的生长表现(图6)
将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培养后观察其生长情况，主要观察其浑浊度、沉淀物、菌膜、菌环和颜色等。
1.浑浊度 细菌接种在液体培养基中经适当培养后其表现性状不同，有均匀浑浊、轻度混浊或培养基保持透明(表面有菌膜或底部有沉淀物)。
2.沉淀物 细菌在液体培养基中所形成的沉淀有：颗粒状沉淀、粘稠沉淀、絮状沉淀、小块状沉淀。另外还有不生成沉淀的细菌。
3.表面性状 主要是观察细菌在液体培养基中培养后有元菌膜或菌环形成等。
4.颜色 有的细菌在生长繁殖过程中能产生色素，色素能溶于水，所以细菌在液体培养基中培养后，所产生的色素会使培养基的颜色发生变化。
图5 细菌明胶柱穿刺培养生长表现
1.不液化 2.火山口状 3.芜菁状
4.漏斗状
5.囊状 6.层状 图6 细菌在肉汤中生长表现 1. 絮状 2. 环状 3. 厚膜状 4. 均匀状 图4 琼脂柱穿刺培养的菌落表现 1.线状 2.棘状 3.珠状 4.绒毛状 5.根状
作业
1.什么叫菌落？什么叫菌苔？
2.细菌在固体培养基上的培养特性包括哪些方面？
3．描述大肠杆菌、炭疽杆菌、葡萄球菌的菌落特点。
实验六 细菌的生理生化试验
【目的要求】
1．掌握细菌鉴定中常用生理生化试验的原理和试验方法。
2．了解生理生化实验结果对细菌鉴别的重要意义。
【实验原理】
1.糖发酵试验
糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌鉴定中尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异：有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2（黄色）-6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。
2.M.R试验
某些细菌(如大肠杆菌、志贺氏菌、产气杆菌等)在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再进一步分解为乙酸、乳酸、琥珀酸等。酸类增加愈多，则使培养基中的pH值愈下降，当降至pH4.5以下时，指示剂甲基红则呈红色，即为阳性反应。如pH值高于4.5时则指示剂呈黄色，即为阳性反应。因此,在培养物中加入1滴甲基红试剂，立即可以观察到上述结果之一。
3.乙酰甲基甲醇试验(V-P反应)
某些细菌（如产气杆菌）在糖代谢过程中，利用葡萄糖，产生丙酮酸，再将丙酮酸缩合。脱羧而成为中性的乙酰甲基甲醇，该物质在碱性条件下能被空气中的氧气氧化生成二乙酰。二乙酰能与培养基中含胍基的化合物发生反应，立刻或于数分钟内生成红色化合物；即为V-P试验阳性。如果培养基含胍基太少，可加入肌酸或肌酐酸等含胍基化合物。当加入α-萘酚时也可使反应加速进行。
4.靛基质试验（吲哚试验）
某些微生物如大肠杆菌、变形杆菌、霍乱弧菌等在代谢过程中产生色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸，产生靛基质(indolo)。靛基质与对二甲氨苯甲醛作用时，形成玫瑰靛基质而呈红色。
5.三糖铁琼脂试验
该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(E.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色
沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。
【器材及试剂】
1.器材 酒精灯、接种环、恒温箱、记号笔；
2.培养基 葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖等糖发酵管；蛋白胨水；葡萄糖蛋白胨水、三糖铁培养基等；
3.菌种 大肠杆菌、沙门氏菌菌种。
【操作步骤】
一、糖类分解（发酵）试验
1．试验方法
（1）琼脂斜面培养物用接种针挑取少量菌穿刺接种于糖发酵管深部（勿穿到管底！）。（2）将接种管标记清楚放入37℃孵育，24-48h观察结果。
2．结果判定
无变化 - 培养基不变色
产 酸 + 培养基变黄
产酸产气 ⊕ 培养基变黄并有气泡
二、吲哚（靛基质）试验
1．试验方法
①以接种环将待检菌新鲜斜面培养物接种于蛋白胨水溶液中，置37℃培养24-48h（可延长4-5d）。②于培养液中加入戊醇或二甲苯2-3m1，摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入欧立希氏或Kovacs试剂2m1。③在戊醇或二甲苯下面的液体变为红色者为阳性反应。
三、甲基红（M.R）试验／维倍（V-P）二氏试验
1．试验方法
（1）M.R试验 接种细菌于培养基中，在37℃培养24-48h后。于培养物中加入几滴试剂，变红色者为阳性反应，桔红到黄色则为阴性。
（2）V-P试验①取出培养24hV.P试验用葡萄糖蛋白胨溶液lm1。②将6％小萘酚酒精溶液0.5ml加入，随后加16％KOH 0.5m1，轻摇，然后让其静置10-15min。③在15min内出现红色者则为阳性，1h后可出现假阳性。④或者加等量的硫酸铜试剂于培养物中混合，静置，强阳性者约5min后可产生粉红色反应。
四、三糖铁琼脂试验 以接种针挑取待试菌可疑菌落或者纯培养物穿刺接种并涂布于斜面，置36±1℃，18-24h观察结果。
作业 一名词解释 吲哚实验
二问答题 1. 细菌的糖发酵实验的检测指标有哪些，代表什么含义？
2. 简述三糖铁琼脂实验的单糖的种类、比例及其主要的实验现象？
试验七 细菌的药敏试验
[目的要求]
1.掌握纸片扩散法、稀释法细菌药敏试验的原理、操作方法、结果判读及临床意义。
2.熟悉纸片扩散法、稀释法的质量控制立法。
一、纸片扩散法
(一)原理
含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最小抑菌浓度(minima1 idIibitory concentration,MIC)呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC 愈小。
(二)实验材料
1.抗菌素纸片 可购用或按下列方法制备。
(1)将质量较好的滤纸用打孔机打成直径6mm的圆片，每100片放入一小瓶中，高压灭菌 (1.02kg30min)后在60℃条件下烘干。
(2)用无菌操作法将待测的抗菌药物溶液1ml,(含药量按表实17-1所列计算，例如，庆大霉素10μg/片×100片=1000μg/ml，加入100片纸片中，置冰箱内浸泡1-2h，如立即试验可不烘干，若保存备用可，用下列一种方法烘干(干燥的抗菌素纸片可保存6个月)。
培养皿烘干法 将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃温箱内保持2-3h即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。
真空抽干法 将放有抗菌药物纸片的试管，置干燥器内，用真空抽气机抽干。 将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中，置冰箱、内保存备用。并用标准敏感菌株作敏感性试验，记录抑菌圈的直径，若抑菌圈比标准敏感菌株的原来缩小，则表明该抗菌药物已失效，不能再用。 抗菌药物
阿米卡星(AMO)
庆大霉素(GEN)
青霉素〈PEN)
苯唑西林(OXA)
氨苄西林(AMP)
哌拉西林(PIP)
头孢唑林(FZN)
环丙沙星(CIP)
万古霉素(VAN)
克林霉素(CLI)
复方新诺明(SXT) 纸片含药量 30μg 10μg 10units 1μg 10μg 100μg 30μg 5μg 30μg 2μg 1.25/23.75μg 抑菌圈直径(mm) 耐药(R) ≤14 ≤12 ≤28 ≤10 ≤13 ≤17 ≤14 ≤15 — ≤14 ≤10 中介度(I) 15~16 13~14 — 11~12 14~16 — 15~17 16~20 — 15~20 11~15 敏感(S) ≥17 ≥15 ≥29 ≥13 ≥17 ≥18 ≥18 ≥21 ≥15 ≥21 ≥16 注：敏感(S) 表示被测菌株感染，可用该抗菌药的常用剂量治愈。
耐药(R) 表示被测菌株感染，用该抗菌药的常用剂量治疗，预期元效。 中介度(I) 出现此结果，有可能因试验技术因素引起的误差，不应报告，必要时用稀释法重做。
2.培养基Muelk-Hinton(M-H)琼脂
3.试剂及菌种无菌生理盐水、0.5麦氏标准比浊管(McFarland stanard，相当于1.58× 10cfu/ml)。菌种：金黄色葡萄球菌ATCC 25923、大肠埃希氏菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌 ATCC 27853。
(三)实验方法
1.用培养16~24h血平板上的菌落接种于生理盐水管
8中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于 1.5×10cfu/ml) 。
2.用无菌棉拭于蘸取少量的菌液，在M-H琼脂表面均
匀涂抹接种3次，每次旋转平板60℃, 最后沿平板内缘
涂抹一周。
3.将接种的平板置室温下干燥3~5min后，用无菌镊 图实17-1药物抑菌试验示意图子取含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm，置35℃培养16~18h后观察结果。药物的选择参照表实17-2。
表实 17-2 药敏纸片的选择
待测菌
金黄色葡萄球菌 ATCC 25923
大肠埃希菌 ATCC 25922
铜绿假单胞菌 ATCC 27853 药物 PEN、OXA、CLI、VAN、CIP、GEN、SXT AMP、FZN、GEN、AMS、FRX、CIP、IMP CAZ、GEN、PIP、AMK、ATM、CIP、IMP
(四)结果判定 根据抗菌药纸片周围抑菌区的大小，测定其药物的敏感性。用毫米尺测量抑菌圈直径，参照表实17-1的标准判读结果。按敏感(S)或耐药(R)报告。
(五)质量控制 标准菌株的抑菌圈应在表实17-3所示的预期范围内。如果超出该范围，应视为失控而不发报告，及时查找原因，予以纠正。
表实17-3 质控标准菌株的抑菌圈预期值范围
抑菌圈直径(mm)
抗菌药物 纸片含药量 金黄色葡萄球菌
ATCC 25923
19~26
19~26
—
—
16~22
24~30
29~35
26~32
30~40
—
—
24~32 大肠埃希菌 ATCC 25922 20~26 19~27 26~37 18~24 27~35 — 23~29 — 22~30 17~21 24~30 24~32 铜绿假单胞菌 ATCC 27853 18~26 16~21 — — — 25~33 — 20~28 25~33 — — — 阿米卡星(AMO) 庆大霉素(GEN) 青霉素〈PEN) 苯唑西林(OXA) 氨苄西林(AMP) 哌拉西林(PIP) 头孢唑林(FZN) 亚胺配南(IMP) 环丙沙星(CIP) 万古霉素(VAN) 克林霉素(CLI) 复方新诺明(SXT) 30μg 10μg 10units 1μg 10μg 100μg 30μg 10μg 5μg 30μg 2μg 1.25/23.75μg
作业：
1.
2. 名词解释 药敏实验；最小抑菌浓度；半数致死量；抑菌圈 问答题
纸片扩散法药敏实验的原理、
操作结果片段及其有何临床意义？
实验八 小动物试验法
【实验目的】
1．学习并掌握实验动物的接种方法。
2．学习并掌握实验动物的剖检方法。
3.掌握病料采集、包装和运送的基本原则和操作技术。
【实验用途】
在微生物实验和研究工作中，动物实验是常用的技术之一，其主要用途有以下几方面：
1．进行病原体的分离和鉴定 有些直接分离培养有困难的病原菌或需鉴定的细菌，通过易感动物体就可达到目的。如从子宫分泌物中分离布鲁氏菌，可用豚鼠接种法。
2．确定病原体的致病力 有些细菌在形态、生物学特性等方面性状相似，仅在致病性上不同，可利用动物试验鉴别。
3．恢复或增强细菌的毒力 多数病原菌长期通过人工传代保存后，其毒力减弱，须通过易感动物恢复或增强其致病力。
4．测定某些细菌的外毒素 如产气荚膜梭菌的毒素测定。
5．制备疫苗或诊断用抗原 如兔化猪瘟疫苗。
6．制备作诊断或治疗用的免疫血清 如作鉴定用的沙门氏菌诊断血清。
7．用于检验药物的治疗效果及毒性等
（一）实验动物接种法
1．接种材料 细菌培养物（肉汤培养物或细菌悬液）、尿液、脑脊液、血液、分泌物、脏器组织悬液等。
2．实验动物 常用的动物有家兔、豚鼠（也称海豚、荷兰猪、天竺鼠）、大白鼠、小白鼠及绵羊等。所需实验动物以自行繁殖为最方便可靠，如必须向外购买、要选择健康无病未做过任何试验的动物。
3．实验动物常用的接种方法
（1）皮肤划痕接种 实验动物多用家兔，用剪毛剪剪去胁腹部长毛，必要时再用剃刀或脱毛剂脱去被毛，以75％酒精消毒，待干，用无菌小刀在皮肤上划成几条平行线。划痕口可略见出血，然后用刀将接种材料涂在划痕口上。
（2）皮下接种
家兔皮下接种 由助手把家兔伏卧或仰卧保定，于其背侧或腹侧皮下结缔组织疏松部分剪毛消毒，术者右手持注射器，以左手拇指，食指和中指捏起皮肤使成一个三角形皱褶，或用镊子夹起皮肤、于其底部进针，感到针头可随意拨动即表示插入皮下。当推入注射物时感到流利畅通也表示在皮下，拨出注射针头时用消毒棉球按针孔并稍加按摩。
豚鼠皮下接种 保定和术式同家兔。
小白鼠皮下接种 无须助手帮助保定，术者在做好接种准备后，先用右手抓
住鼠尾，令其前爪抓住饲养罐的铁丝盖，然后用左手的拇指及食指捏住颈部皮肤，并翻转左手使小鼠腹部朝上，将其尾巴挟在左手掌与小手指之间，右手消毒术部，把持注射器、以针头稍微挑起皮肤插入皮下，注入时见有水泡微微鼓起即表示注入皮下。拔出针头后，同家兔皮下注射时一样处理。
（3）皮内接种
作家兔、豚鼠及小白鼠皮内接种时，均需助手保定动物，其保定方法同皮下接种。接种时术者以左手拇指及食指夹起皮肤，右手持注射器、用细针头插入拇指及食指之间的皮肤内针头插入不宜过深，同时插入角度要小，注入时感到有阻力且注射完毕后皮肤上有小硬疱即为注入皮内。皮内接种要慢，以防使皮肤胀裂或自针孔流出注射物而散播传染。
（4）肌肉接种
肌肉注射部位在禽类为胸肌，其它动物为后肢内股部。术者消毒后，将针头刺入肌肉内注射感染材料。
（5）腹腔内接种
在家兔、豚鼠、小白鼠作腹腔接种，宜采用仰卧保定、接种时稍抬高后躯，使其内脏倾向前腔，在腹后侧面插入针头，先刺入皮下，后进入腹腔、注射时应无阻力，皮肤也隆起。
（6）静脉注射
家兔的静脉注射 将家兔纳入保定器内或由助手把握住它的前、后躯保定、选一侧耳边缘静脉，先用75％酒精涂擦兔耳或以手指轻弹耳朵，使静脉扩张。注射时，用左手拇指和食指拉紧兔耳，右手持注射器，使针头与静脉平行，向心脏方向刺入静脉内，注射时无阻力且有血向前流动表示注入静脉、缓缓注射感染材料，注射完毕用消毒棉球紧压针孔， 以免流血或注射物溢出。
豚鼠静脉内接种 使豚鼠伏卧保定。腹面向下，将其后肢剃毛、用75％酒精消毒皮肤，施以全身麻醉，用锐利刀片向后肢内上侧向外下方切一长约1厘米的切口，使露出皮下静脉，用最小号针头刺入静脉内慢慢注入感染材料。接种完毕，将切口缝合一两针。
小白鼠静脉接种 其注射部位为尾侧静脉。选15～20g体重的小白鼠，注射前将尾部血管扩张易于注射。用一烧杯扣住小白鼠，露出尾部，最小号针头（4号）刺入侧尾静脉，缓缓注入接种物，注射时无阻力，皮肤不变白、不隆起，表示注入到静脉内。
（7）脑内接种法
作病毒实验研究时，有时用脑内接种法，通常多用小白鼠，特别是乳鼠（1～3日龄），注射部位是耳根连线中点略偏左（或右）处。接种时用乙醚使小白鼠轻度麻醉，术部用碘酒，酒精棉球消毒，在注射部位用最小号针头经皮肤和颅骨稍向后下刺入脑内进行注射，先后以棉球压住针孔片刻，接种乳鼠时一般不麻醉，不用碘酒消毒。家兔和豚鼠脑内接种法基本同小白鼠，唯其颅骨稍硬厚，事先用短锥钻孔，然后再注射、深度宜浅，以免伤及脑组织。
4．注射量 家兔0.2m1，豚鼠0.15m1，小白鼠0.03m1。凡作脑内注射后一小时内出现神经症状的动物作废，认为是接种创伤所致。
（二）实验动物采血法
如欲取得清晰透明的血清，宜于早晨没有饲喂前抽取血液。如采血量较多则应在采血后，以生理盐水作静脉（或腹腔内）注射或饮用盐水以补充水份。
1．家兔采血法
可采自其耳静脉或心脏，耳边缘静脉采血方法基本与静脉接种相同，不同之处是以针尖向耳尖反向抽吸其血，一般可采血1～2m1。如采大量血液，则用心脏采血法。动物左仰卧由助手保定，或以绳索将四肢固定，术者在动物左前肢腋下处局部剪毛及消毒，在胸部心脏跳动最明显处下针。用一寸半长12号针头，直刺心脏，感到针头跳动或有血液向针管内流动时，即可抽血，一次可采血15～20m1。
如采其全血，可自颈动脉放血。将动物保定，左颈部剃毛消毒，动物稍加麻醉，用刀片在颈静脉沟内切一长口，露出颈动脉并结扎，于近心端插入一玻璃导管，使血液自行流至无菌容器内，凝后析出血清；如利用全血，可直接流入含抗凝剂的瓶内，或含有玻璃珠的三角瓶内振荡脱纤防凝。放血可达50ml以上。
2．豚鼠采血法
豚鼠一般从心脏采血。助手使动物仰卧保定，术者在动物胸部心跳最明显处剪毛消毒，用针头插入胸壁稍向右下方刺入。刺入心脏则血液可自行流入针管，一次未刺中心脏稍偏时，可将针头稍提起向另一方向再刺。如多次没有刺中，应换一动物，否则有心脏出血致死亡的可能。
3．小白鼠采血法
可将尾部消毒，用剪刀断尾少许，使血液溢出，即得血液数滴，采血后用烧烙法止血。也可自心脏采血，或摘除眼球放血。
4．绵羊采血法
在微生物实验室中绵羊血最常用。采血时由一助手半坐骑在羊背上，两手各持其一耳（或角）或下颚，因为羊的习惯好后退，令尾靠住墙根。术者在其颈部上1/3处剪毛消毒，一手压在静脉沟下部使静脉努张，右手持针头猛力刺入皮肤，此时血液流入注射器或直接流入无菌容器内，一切应无菌操作，以获得无菌血液。
5．鸡采血法
剪破鸡冠可采血数滴供作血片用。少量采血可从翅静脉采取，将翅静脉刺破以试管盛之，或用注射器采血，需大量血可用心脏采取：固定家禽使侧卧于桌上，左胸部朝上，从胸骨脊前端至背部下凹处连线的中点垂直刺入，约1寸深即可采得心血。一次可采10～20ml血液。
（三）病料的采集、包装和运送
1、病料采集、包装、运送的基本原则
（1）要分离病原微生物，必须准确采集含菌(病毒)最多的病料。这就必须充分了解各种病原微生物在患畜(禽)体内及其分泌物和排泄物中的分布情况。不
同的病原微生物在患畜(禽)体内的分布情况是不同的，即使是同一种病原微生物，在病程的不同时期和不同的病型中分布也不相同。因此，在采集病料之前，必须根据该传染病的流行病学特点、临床表现和病理解剖检验的结果，对被检动物可能患什么传染病做出初步的诊断，然后采集最合适的病料。
（2）采集病料时应尽可能避免杂菌污染。要求尽量做到无菌操作，所用的器械、容器等均要求无菌。
（3）采集的病料应尽快送检，不宜久置。患畜(禽)死后，应立即剖检采取病料送检，否则组织腐败、不利于病原体的分离。因故不能及时送检时，则需冷冻保存；但保存的时间也不应太久。小动物(如家禽、家兔、羔羊、仔猪等)可将其整个尸体装入塑料袋内送检。
（4）进行人畜共患传染病病尸的剖检时，须做好个人防护工作和环境的消毒工作，以免发生自身感染和散播病原。凡认为动物死于炭疽或可疑为炭疽时，严禁剖检，应立即报告上级防疫部门，严格诊断处理。
（5）剖检时要对病例各个组织器官的病理变化进行详细的记录。
2、各种病料的采集与保存
（1）涂片或触片 病畜(禽)的病灶组织、脓汁、血液等可制成涂片或触片，待自然干燥后送检。血液涂片可制两种，一种为薄血片，供显微镜检查用；另一种为厚片，供细菌分离或接种实验动物用。所有涂片或触片的一端应贴上标签，注明来源、是否固定等。
（2）检查包涵体的病料，采集早期的病灶组织，浸泡在固定液中保存，以供制备病理切片。固定液的配方：40%甲醛50ml；冰醋酸120ml；96%酒1100ml；苦味酸8g；蒸馏水1000ml。
（3）细菌学检验病料，可采集组织脏器，如肝、脾、肾、心肌、淋巴结、脑组织等，盛入无菌容器中送检。液态病料，如痰、粘液、脓汁、腹水、脑脊液、关节液及胆汁等，可用无菌注射器吸取后装入无菌试管中，或用无菌棉球、无菌棉签蘸取后放入无菌试管中送检。凡装有病料的容器均要求直立瓶口或试管口棉塞要用融化的石蜡密封，并贴好标签。
（4）供病毒学检验的病料的采集、保存应按不同病料用不同方法。
（5）供血清学检验用的材料 血清学检验包括鉴定抗原或抗体。作为病毒样抗原的样品取材要准确，并注意保持病毒的抗原性。用荧光抗体检验的病毒病料，应立即置丙酮中在低温下固定，然后送检。供鉴定抗体的血清，采血时不加抗凝剂，直接在无菌条件下分离血清，将血清装入灭菌试管、小瓶或台式微量离心管中，并可在血清中加入抗菌素(青霉素和链霉素各100Ou/ml)、0.5%石炭酸或0.01%的硫柳汞或0.08%的叠氮化钠防腐。
3、病料的包装和运送
（1）将盛病料的容器表面用消毒剂擦拭好，以免散播病原。然后贴上标签，注明病料来源、种类、保存方法、采集时间等。为防止病料外漏，须用融化的石蜡严封瓶口或管口。
（2）各种病料装好后，全部置于密封箱膜袋或金属容器内，再置于内有冰块的泡沫箱或广口保温瓶中。
（3）指派专人将病料送到检验机关。送检人员应了解病料来源及疫病流行等情况，同时要携带一份病料送检单，其主要内容、格式可参考下表。
表1 病料送检单
第 号 年 月 日
项 目
送检单位、电话、邮编 病畜(禽)种类、年龄、性别特征
饲养管理、卫生、放牧、使役、牲畜数字等
情况
流行病学情况
主要临床症状
病理解剖变化
病料种类、数量、保存方法、采集日期
送检目的及要求
病料送出时间
记 录 送检单位 (盖章) 畜牧兽医负责人 (签名) 送检人员 (签名)
作业
1. 相关名词解释 毒力 外毒素 内毒素 致病力 小白鼠保定法
2. 问答题 1. 简述实验动物接种的途径、适用范围及注意事项
2. 简述家兔心脏采血的步骤及注意事项
3. 简述鸡的心脏采血和翅下静脉采血的方法
实验九 主要病原菌的认识
【目的要求】
1． 掌握结核杆菌抗酸染色法、布氏杆菌柯氏染色法；
2． 熟悉结核杆菌、布氏杆菌的形态特征及培养特性；
3． 认识金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、炭疽杆菌等形态特征。
【原理】
1. 抗酸染色法 分枝杆菌细胞壁含脂质较多,其中主要成分为分枝菌酸,此物具有抗酸性,染色时与石炭酸复红结合牢固,能抵抗酸性乙醇的脱色作用,因此抗酸菌能保持复红的颜色,达到染色目的。
2. 科兹洛夫斯基染色法
由于本菌吸收染料过程较慢，较其他细菌难于着色，所以，常用科兹洛夫斯基染色法染色，布鲁氏菌呈红色，其他细菌呈绿色。
【器材及试剂】
1.菌种：结核分枝杆菌、布氏杆菌弱毒疫苗 ；
2.仪器：普通光学显微镜；
3.材料：载玻片、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等；
4.染料：石炭酸复红染色液、3%盐酸酒精脱色、美蓝染色液、2％沙黄、1％孔雀绿。
5.标本片:金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、炭疽杆菌、魏氏梭菌、破伤风梭菌、猪丹毒杆菌等。
【操作步骤】 1.抗酸染色法
（1）细菌抹片的制备；
（2）滴加较多的石炭酸复红染色液，在微火上加热至有蒸汽出现（切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开），不断补充染色液，加热3-5分钟，水洗；
（3）用3%盐酸酒精脱色30秒-1分钟，直至乙醇液呈淡红色或无色，水洗；
（4）用美蓝染色液染1分钟，水洗；
（5）干燥、镜检，分枝杆菌为红色，其他菌为兰色。
2.科兹洛夫斯基法
（1）细菌抹片的制备；
（2）用2％沙黄（即番红花红）水溶液加温染色，出现气泡为止（约1.5分钟），充分水洗1～2分钟；
（3）再用1％孔雀绿水溶液染色0.5～1分钟（亦可用美兰液代替孔雀绿），水洗、干燥、镜检。
(4) 本菌呈红色，其他菌呈绿色（最好40分钟内镜检，经久则红色褪去）
3.其他标本片的观察
（1）金黄色葡萄球菌 革兰氏染色阳性。呈葡萄串状。无芽孢，无荚膜。
（2）链球菌 为革兰氏染色阳性菌，呈链状排列。
（3）大肠埃希氏菌 革兰氏阴性短杆菌，常单独存在，偶呈短链排列，无芽孢，不形成荚膜。
（4）沙门氏菌 为革兰氏阴性两端钝圆小杆菌，多单个散在，偶有呈2-3个菌体相连的短链，无芽孢及荚膜。
（5）巴氏杆菌 革兰氏阴性类球杆菌，菌体两端钝圆，单个散在，偶有成双排列，本菌呈典型的两极染色。
（6）炭疽杆菌 在瑞氏或美蓝染色的组织标本中为两端平截的粗大杆菌，单个存在或成双、或呈短链排列，竹节状，有荚膜，无芽孢。但在人工培养物的涂片标本中，革兰氏染色为阳性大杆菌，呈长链排列，无荚膜，有卵圆形的中央芽孢。
（7）梭状芽孢杆菌
魏氏梭菌 在组织(肠粘膜)和纯培养染片中，均为大杆菌，多数单个散在，少数两个相连，革兰氏阳性，菌体两端较齐，无论组织片或纯培养都少见芽孢，若偶尔见到，芽孢呈椭圆，不比菌体宽，位于菌体中心或偏端。
破伤风梭菌 在培养物染片中，繁殖菌体细长，两端钝圆，革兰氏阳性，芽孢圆形，位于菌体一末端，且比菌体宽许多，呈“鼓槌状”。
（8）猪丹毒杆菌 为革兰氏阳性，平直或微弯的纤细短杆菌。不形成荚膜和芽孢。
一． 名词解释
抗酸染色法
二问答题
1．简述结核杆菌的形态学特征
2. 简述布氏杆菌的形态学特征
实验十 病毒的鸡胚培养
【目的要求】
1.了解动物病毒用鸡胚培养的意义及用途
2.掌握鸡胚接种的方法；
3.掌握病毒鸡胚培养的基本方法
【原理】
鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。 一般说来，孵育至9-12天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能
经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞
幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很
利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于
收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨
骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感
染病毒，特别是已不利于收获病毒材
料。
孵育至21天左右，羊水和尿囊液已
全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎图1鸡胚的基本结构 腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育1.气室 2.卵壳 3.卵黄囊 4.卵白 成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构如图1，5.尿囊腔 6.绒毛尿囊 7.胚胎 从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的8.羊水腔 9.胚外体液膜用鸡胚 卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳
膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在11-13日龄时最高，平均达6毫升左右。 羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎
浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液，以后蛋白质含量增加。羊水量在8-15日龄时最高，平均约为1毫升左右。附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。卵的尖端（俗称“小头”）是卵白，是胚胎发育晚期的养料。
除鸡胚外，其它禽类胚胎也常用于动物病毒的分离培养等研究上，如鸭胚、鹅胚、鸽胚等，其操作技术不作详述，可参照鸡胚之操作进行。
【实验器材】
孵化箱、检卵器（检卵箱或手持检卵灯）、卵架、打孔器、镊子、酒精灯、无菌眼科镊子和剪刀、吸头、洗耳球、注射器、适用的针头、无菌试管、平皿、三角瓶、烧杯、消毒胶布、石蜡和灭菌生理盐水等，NDV毒种，9-12日龄鸡胚。
【操作步骤】
1．鸡胚的实验室孵育
选择实验室用鸡卵，最好用白色薄壳鸡蛋，其易于观察胚胎的生活情况。实验用卵一般不宜保存过长时间，通常保存期不应超过10天，5天以内最好。而且不宜在高温下保存，通常保存于4-20℃，以10℃条件下最好。适宜的孵育温度为38-39℃，相对湿度为45-60％，并注意空气流通。孵育3天后每天应翻卵1-2次，以保证气体交换均匀，发育齐全，从而避免半边发育现象的出现。孵后第四天用检卵器对鸡卵进行检视，检出未受精卵和死亡的鸡胚。经四天孵育后，未受精卵不见有鸡胚迹象，仅见模糊的卵黄暗影；受精卵则可见清晰的血管小团，其中有鸡胚迹象，较大的鸡胚可见到胚胎主动运动;濒死或死亡的鸡胚则见到胚胎运动呆滞或不运动，血管昏暗、折断或漂落，这种鸡胚应剔出不用。
2．鸡胚的接种、剖视和收获
根据欲接种病毒的不同，选用不同的接种途径，主要应考虑最适病毒感染部位、最佳接种胚龄和获得最大的病毒滴度。常用的接种途径有尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、卵黄囊和静脉等。
（1）尿囊腔接种法
①选用9-12日龄发育良好
的鸡胚，照蛋标出气室及胚胎位
置，在气室底边胚胎附近无大血
管处标出尿囊腔注射部位。
②气室向上放置鸡胚于卵
架上，在气室及标记处先后用碘
图2尿囊腔接种法 灯和酒精棉球消毒蛋壳表面。
③在所标记注射部位用剪
刀尖端打孔，注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。为防止注射接种物时因胚胎内产生压力而使接种物溢出，可在气室顶端也打一小孔。
④用1毫升注射器抽取接种物，针头斜面（与卵壳成30º角）刺入注射部位3-5毫米达尿囊腔内，注入接种物。一般接种量为0.1-0.2毫升。
⑤另一种接种方法是只开一小孔，在距气室底边0.5厘米处的卵壳上打一个孔，由此孔进针注射接种物。
⑥注射完毕，用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔和气室孔。气室朝上于35-37℃温箱中孵育。弃去24小时内的死亡鸡胚，因多系机械损伤、细菌或霉菌污染等非特异性因素所引起，以后每天检卵1-2次。
⑦检视出的死鸡胚、孵育48-72小时的活鸡胚（某些病毒并不收获活鸡胚，应弃之），取出置4℃冰箱过夜或-20℃冰箱中1小时，以免收获时流血。
⑧取出冷却的鸡胚，气室端卵壳表面用碘酊和酒精棉球消毒，用镊子无菌击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜，以眼科镊子镊住绒毛尿囊膜，用毛细吸管或吸管吸取尿囊液和羊水，置无菌容器中保存备用（低温冰箱冻结保存）。一般能收获尿囊液6毫升左右，最多可达10毫升。
⑨取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。根据需要，也可保存鸡胚胎或经匀浆机（器）处理后的悬浮液备用。
（2）绒毛尿囊膜接种法
①选用10-12日龄发育良好的鸡胚，检视并用铅笔标出气室和胚胎位置，在胚胎附近无大血管处的蛋壳上标出一个边长约0.6厘米的等边三角形，作为接种部位。
②在气室及标记处先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋壳表面。
③横放鸡胚于卵架上，标记处朝上，用牙科
钻砂轮挫或小钢锉轻锉三角处，不破坏壳膜取下
三角形蛋壳。气室中央用钢锥开一小孔。滴加灭
菌生理盐水一滴于三角形壳膜上，用灭菌针头或
火焰消毒钢锥在壳膜上斜刺挑破一小孔，注意不
能伤及绒毛尿囊膜。同时用吸头或洗耳球于气室
小孔上轻吸，使三角处绒毛尿裹膜下陷，生理图3绒毛尿囊膜接种法 盐水吸入，造成人工气室。（可在检卵器上检
视人工气室的确实与否）。
④用无菌注射器吸取接种物于三角处小孔．上刺入0.5-1毫米，注入病毒液，注射量一般为0.1-0.2毫升。轻轻旋转鸡胚，使接种液扩散到人工气室的整个绒毛尿囊膜上。用消毒胶布封闭三角形小口及气室小孔，横放鸡胚，开口向上，于35-37℃温箱中继续孵育。24小时后检视，死胎弃去。以后每天检视1-2次。
⑤检视出的死鸡胚、孵育48-72小时的活鸡胚（或视不同的病毒、不同的实验目的孵育更长时间），取出并用碘酊和酒精棉球消毒人工气室周围蛋壳，去除胶布，用无菌眼科剪、镊子去除人工气室处卵壳、壳膜。剪下人工气室处绒毛尿囊膜置于无菌平皿中，用灭菌生理盐水冲洗，展平后观察痘斑等病理变化。收集绒毛尿囊膜并低温保存、备用。也可收集部分绒毛尿囊膜、固定，供组织病理学切片检查包涵体。
⑥绒毛尿囊膜的另一种接种方法是，检视鸡胚划出胚胎
位置及气室界线，用碘酊和酒精棉球消毒，在气室边缘附近
将卵壳开一半径约0.3厘米的小窗口，左手持鸡胚，使小窗
口朝向操作者，右手持注射器用针头将气室边缘的壳膜挑起
一小孔，缓缓注入接种物，使接种物渗入壳膜与绒毛尿裹膜
之间。用消毒胶布封口，直立放置孵育。或不必开小窗，在
大头顶端刺一小孔，插入针头，接种病料于空室内，针头继
续深入，刺破卵壳膜及绒毛尿囊膜（约深1-1.5厘米），拔
出针后封口，卵直立使气室向上，培养几小时后，即可随便
翻动。
（3）卵黄囊接种法 图4卵黄囊接种法
①选用5-8日龄发育良好的鸡胚，检视标出气室及胚
胎位置。
②气室向上置鸡胚于卵架上，气室端卵壳用碘酊和酒精棉球消毒，用剪刀尖端在气室中央轻刺一小孔。
③用注射器吸取接种物，通过气室中央小孔，用长针头（3-4厘米）垂直刺入2-3厘米，也可刺入达鸡胚长径的二分之一，注入接种物。注射量一般为0.2-0.5毫升。
④注射完毕，用熔化石蜡封闭气室小孔，直立鸡胚，干35-37℃温箱中继续孵育。24小时后检视，死胎弃丢。以后每天捡视1-2次。
⑤继续孵育24小时以上死亡或濒死的鸡胚，取出气室向上直立于卵架上，气室周围卵壳用碘酊和酒精棉球消毒，去除气室端卵壳。用无菌镊子撕破绒毛尿囊膜和羊膜，提起鸡胚，夹住卵黄带，分离绒毛尿囊膜，置鸡胚与卵黄囊于平皿内。用无菌生理盐水冲去卵黄，分别将鸡胚和卵黄囊置于无菌容器中，低温冰箱保存备用。如欲作涂片，可取一小块轻轻涂于载玻片上制成薄片。
另外，由于卯黄是鸡胚的营养供给者，病毒可通过卵黄而进入胚胎，所以收获的胚胎一般病毒滴度也很高。
（4）羊膜腔接种法
①选用10日龄发育良好的鸡胚，照蛋标出气室和胚胎
位置。
②鸡胚气室向上置子卵架上，用碘酊和酒精棉球消毒
气室，将气室顶端开一直径0.7-1.2厘米的小窗口。
③滴加一滴灭菌液体石蜡于胚胎位置（也可用生理盐
水代替石蜡，但透明度较差）。用眼科镊子细心由无血管
处穿过绒毛尿囊膜，镊住羊膜，将其提出于绒毛尿囊膜外，
使成伞状。
④用注射器吸取接种物注入羊膜腔内，接种量一般为图5羊膜腔接种法 0.1-0.2毫升。注毕，用灭菌胶布封闭窗口，35-
37℃温箱
直立孵育。24小时后检视，死胎弃去。以后每天检视1-2次。
⑤经48小时或稍长时间的孵育，死胚或活胚按尿囊腔接种法收获时的办法低温处置鸡胚，碘酊和酒精棉球消毒气室卵壳，自气室处打开窗口，用无菌吸管吸出尿囊液，再用眼科镊子轻轻夹起羊膜使成伞状，用一无菌毛细吸管插入羊膜腔内吸取羊水，置灭菌容器中低温保存、备用。方法得当，一般可获得0.5-1毫升羊水。
（5）鸡胚静脉接种
①选用12-14日龄的鸡胚，暗室中照蛋并标出较粗的静脉，标出其位置和血流方向。
②消毒标记处，用锉在卵壳上挫出一个2-3毫米宽、5-6毫米长的长方形，注意不要伤及壳膜。
③用银子或外科刀挑去该长方形卵壳，在暴露的壳膜上滴加一滴灭菌液体石蜡，使壳膜透明，此时即可见到静脉。
④用磨过的4号针头顺血流方向刺入静
脉内，注射0.02毫升接种液。若静脉内出
现血流暂时中断，静脉呈白色，表明确已注
入静脉。
⑤用灭菌胶布封同卵壳缺口，置温箱中
图6 静脉接种法 孵育，弃去24小时内死胚。
⑥72-96小时的死胚或健胚，普通冰箱中静置4-10小时，收获胚胎，根据需要，采集相应器官组织，如肌肉、肝、脑等，保存或处理待用。
作业
1. 相关名词解释
细胞病变（CPE） 包涵体 鸡胚接种
2. 问答题
1. 简述病毒培养的方法及各自的优缺点？
2. 如何用鸡胚尿囊腔接种进行新城疫病毒的分离？
3. 鸡胚尿囊腔接种的操作步骤及注意事项有哪些？